1) Cắt nhỏ tổ chức nguyên liệu bằng kéo đến độ 0,1 g. Nếu tổ chức lẫn máu hoặc lơng th. rửa trước bằng dung dịch TNM. Trong trường hợp mơ ung
thư thường lẫn nhiều mơ hoại tử thì làm sạch trước là cần thiết.
Chú ý: thực hiện trên nước đá hoặc trong ph.ng lạnh để tránh DNA bị phân giải
(kể cả các bước tiếp theo).
Dung dịch TNM chứa Tris-HCl (pH 7,5) 20mM, NaCl 0,1M và MgCl2 1,5mM.
2) Cho vào mỗi gam tổ chức 20 ml dung dịch TNM, nghiền nhuyễn (bằng homogenizer, như Porter), quay li tâm 2.000 v/ph trong 5 phút ở 4 ºC, thu cặn.
3) Tráng cặn bằng dung dịch TNE, đổ bỏ nước mặt. Lại cho 5 ml TNE
vào trộn đều thành huyền dịch rồi bổ sung thêm TNE cho đủ 20 ml, trộn đảo đều.
Dung dịch TNE chứa Tris-HCl (pH 7,5) 10mM, NaCl 0,1M và EDTA 1mM.
4) Thêm từ từ SDS 10% vừa thêm vừa trộn đảo nhẹ cho đạt mức 0,3% so tổng lượng. Thêm dung dịch proteinase 10 mg/ml cho đạt đến mức 1% so tổng lượng. Ủ 4 giờ đến qua đêm ở 60 °C.
5) Thêm lượng tương đương phenol, trộn đảo nhẹ khoảng 5 giờ đến 1 đêm.
6) Quay li tâm 3.000 v/ph trong 10 phút, dùng pipet cĩ lỗ to hút phần nước, tránh khuấy động phần phenol. Lại chiết xuất bằng phenol một lần và bằng chloroform một lần nữa.
7) Thẩm tích đối 2 lít TE qua một ngày đêm cĩ thay TE một lần.
8) Thêm RNase (DNase-free) 1 mg/ml đến mức 1/50 thể tích, ủ 37 °C trong 1 giờ.
9) Thêm lượng tương đương phenol, trộn đảo nhẹ trong 1 giờ.
10) Li tâm 3.000 v/ph trong 1 phút, hút lấy lớp nước bằng pipet cĩ lỗ miệng lớn.
11) Thẩm tích đối TE qua đêm cĩ thay ngoại dịch như trên.
12) Cho DNA thu được vào ống chất dẻo, bảo quản ở 4 ºC. Với DNA động vật cĩ thể bảo quản 4 - 5 năm trong điều kiện này.
III. KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM
Mỗi sinh viên theo dõi kết quả điện di của nhĩm, phân tích kết quả thu được, nộp bài báo cáo.
BÀI 10:
KỸ THUẬT PHÂN TÍCH PLADMID BẰNG PHƢƠNG PHÁP CẮT GIỚI HẠN
PHƢƠNG PHÁP CẮT GIỚI HẠN
I- MỤC ĐÍCH
Enzyme cắt giới hạn thường được sử dụng trong sinh học phân tử và kỹ thuật di truyền là các enzyme cắt giới hạn thuộc nhĩm II. Các enzyme này cĩ khả năng nhận biết một trình tự nucleotide xác định và cắt DNA ngay tại trình tự nhận biết đĩ. Cơng dụng của các enzyme cắt giới hạn là cắt phân tử DNA thành những đoạn DNA ngắn hơn. Do vậy, với sự hỗ trợ của một số kỹ thuật sinh học phân tử khác, các nhà nghiên cứu đã sử dụng cắt giới hạn cho nhiều mục đích thao tác, phân tích DNA khác nhau như: cắt nối DNA tạo DNA tái tổ hợp, phân tích tái tổ hợp, đột biến, đa dạng di truyền.
Trong phạm vi bài thực hanh này, enzyme cắt giới hạn được sử dụng nhằm để phân tích plasmid. Plasmid được cắt bằng enzyme cắt giới hạn để kiểm tra dung dịch plasmid thu được là plasmid cần thu nhận hay khơng.
Phương pháp phân tích DNA và vector tái tổ hợp chứa DNA bằng phản ứng cắt giới hạn cĩ thể được ứng dụng cho các trường hợp sau:
- Kiểm tra dung dịch vector, plasmid thu được sau khi nhân bản in vivo trong tế bào chủ
- Kiểm tra vector tái tổ hợp thu được sau khi được thao tác cắt nối bằng enzyme cắt giới hạn đĩ.
II-NGUYÊN TẮC
Trong sự phân tích plasmid bằng phương pháp cắt giới hạn, đầu tiên, plasmid được cắt bằng một hay một số enzyme cắt giới hạn thích hợp. Sản phẩm cắt được điện di gel agarose. Việc phân tích số lượng và độ dài các đoạn DNA thu được sau phản ứng cắt sẽ cho thơng tin cần thiết về plasmid cần kiểm tra.
Để phân tích plasmid bằng phản ứng cắt giới hạn cần phải cĩ thơng tin về
bản đồ enzyme cắt giới hạn của plasmid quan tâm. Dựa vào bản đồ enzyme cắt
giới hạn, số lượng và loại enzyme thích hợp được chọn lựa cho phản ứng cắt kiểm
tra plasmid
Sinh viên thực tập phân tích bản đồ enzyme cắt giới hạn của plasmid pBluescript và chọn các enzyme cắt giới hạn thích hợp cho phản ứng cắt kiểm tra plasmid pBluescript trong dung dịch DNA thu được sau khi tách chiết plasmid từ tế bào chủ E.coli DH5α
Thực hanh phản ứng cắt giới hạn với enzyme đã chọn. Phân tích sản phẩm của phản ứng cắt bằng điện gi gel agarose. Ghi nhận kết quả.
1. Vật liệu, dụng cụ, thiết bị
Dung dịch DNA thu được ở bài trước 01 eppendorf 1,5ml
Pipettman các loại: 0,5-10µl; 2-20 µl, 20-100 µl + đầu típ Nước cất vơ trùng
Enzyme cắt giới hạn, dung dịch đệm (buffer) Chậu thủy tinh
Cốc thủy tinh 100, 250 ml Agarose
Dung dịch TAE 1X, 50X Bộ điện di
Tủ ấm 37o
C hay Bể ổn nhiệt (Water Bath)
2. Thực hành
Dựa vào bản đồ plasmid của pBlueScript, sinh viên thực tập chọn enzyme cắt giới hạn sử dụng cho phản ứng cắt kiểm chứng plasmid. Dự đồn kết quả thu được khi sử dụng enzyme đã chọn cho phản ứng kiểm chứng.
Sinh viên tiến hành thực hiện các phản ứng cắt giới hạn theo các bước sau: Chuẩn bị hai (2) eppendorf sạch bằng việc rửa cồn ethanol 70o sau đĩ sấy khơ ở nhiệt độ 120o
C
Thiết lập phản ứng cắt với thành phần như sau:
DNA plasmid 1µg
Dung dịch đệm (10X) 2,0 µl Enzyme cắt giới hạn 0,5 µl Nước cất bổ sung cho đến thể tích 6,5 µl Ử hỗn hợp này trong 2h hoặc qua đêm
Bổ sung dung dịch đệm chạy mẫu (loading buffer) Chạy gel điện di agarose, quan sát và thu nhận kết quả
Tiến hành các nhĩm DNA đã được tinh sạch và tách chiết với các đối tượng: DNA thực vật, động vật, nấm men, máu…..
IV- KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM
Mỗi sinh viên theo dõi kết quả điện di của nhĩm, phân tích kết quả thu được, nộp bài báo cáo.
BÀI 11
CÁC PHƢƠNG PHÁP THU HỒI ĐOẠN DNA TỪ
GEL ĐIỆN DI
II. NGUYÊN TẮC
Nếu cĩ nhu cầu sử dụng các phân đoạn DNA đã được phân li và tinh chế nhờ điện di cho các thí nghiệm tiếp theo, người ta nhận thấy việc thao tác để thu hồi DNA từ gel là cần thiết. Cĩ một số phương pháp thu hồi DNA được trình bày và chúng cĩ những ưu điểm và nhược điểm nhất định như thời gian thao tác, độ phức tạp và tỷ lệ thu hồi, cũng như khả năng lẫn các polymer hịa tan hoặc các chất hỗn tạp cĩ trong gel agarose và gel polyacrylamide làm cản trở đến các phản ứng sẽ thực hiện trong thí nghiệm sau đĩ. Phương pháp dùng giấy DEAE cần thời gian ngắn và lượng chất hỗn tạp tương đối ít nhưng từ gel polyacrylamide tỷ lệ thu hồi các đoạn DNA dài hoặc DNA một sợi thường thấp. Phương pháp thu hồi nhờ điện di cĩ thể thực hiện để thu hồi DNA từ gel agarose cũng như polyacrylamide nhưng lượng thu hồi được dưới dạng dung dịch với lượng tương đối lớn cần phải cơ đặc, cho nên chất hỗn tạp lẫn nhiều. Hơn nữa, từ gel agarose việc thu hồi thường khĩ khăn. Phương pháp hồi thu từ agarose tan chảy nhiệt độ thấp cĩ thể thu hồi DNA trong thời gian ngắn thao tác cũng đơn giản, tỷ lệ thu hồi cao khơng phụ thuộc vào độ lớn của các đoạn DNA nhưng hỗn tạp nhiều.
