III. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
KỸ THUẬT PCR TRONG PHÂN TÍCH DÕNG DNA TÁI TỔ HỢP
DÕNG DNA TÁI TỔ HỢP
I. MỤC ĐÍCH
PCR là kỹ thuật được ứng dụng rộng rãi nhằm khuếch đại một trình tự DNA sau quá trình tách chiết, kiểm tra gen mục tiêu cĩ trong plasmid tái tổ hợp hay kiểm tra cấu trúc, trạng thái của đoạn DNA…. Nội dung của bài thực tập này nhằm khẳng định sự hiện diện của DNA mục tiêu trong plasmid tái tổ hợp bên trong dịng tái tổ hợp dựa theo nguyên tắc phản ứng PCR với cặp mồi chuyên biệt cho gen mục tiêu hoặc cặp mồi chuyên biệt cho vùng trình tự gen mục tiêu. Phương pháp PCR cho phép kiểm tran hanh sự hiện diện của đoạn DNA đĩ.
II. NGUYÊN TẮC
PCR (Polymerase Chain Reaction) là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm nhân bản (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA trong ống nghiệm mơ phỏng bộ máy sinh tổng hợp DNA của tế bào sống. Kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di truyền (genetic diseases), nhận dạng vân tay DNA (DNA fingerprinting), chuẩn đốn những bệnh nhiễm trùng (Infectious , tách dịng gene, và xác định huyết thống.
Các thành phần trong phản ứng PCR Enzyme
1. Các đặc tính enzyme DNA polymerase và định nghĩa đơn vị (unit) của mỗi loại (hãng) sản xuất là khác nhau. Cần kiểm tra thơng tin trên các tờ hướng dẫn đi kèm hĩa chất.
2. Lượng enzyme cần thiết là phụ thuộc vào lượng DNA template và kích thước phản ứng PCR. Tuy nhiên, thành phần này chỉ nên hiệu chỉnh khi 1) sản phẩm PCR lớn hơn 5kb; 2) cĩ khả năng hoạt tính của enzyme bị giảm sút do thiếu sĩt ở khâu bảo quản; 3) đã tiến hành hiệu chỉnh bằng nhiều cách nhưng sản phẩm PCR vẫn thấp hoặc khơng cĩ gì.
3. Khơng nên tăng enzyme quá 2U (5µl) trên 50 µl tổng thể tích phản ứng 4. Việc thay đổi loại DNA polymerase cĩ thể làm thay đổi hiệu suất của phản
5. Khi tính tốn chiến lược cloning bằng hệ thống TA vector, cần lưu ý DNA polymerase cĩ đặc tính tạo đầu treo A ở đầu 3' hay khơng. Nếu khơng thì cần phản ứng bổ sung sử dụng Klenow và ATP.
6. Tính chính xác của enzyme DNA polymerase phụ thuộc vào hoạt tính 3´→5´ exonuclease. Tùy thuộc mục đích thí nghiệm mà cần lựa chọn loại DNA polymerase cĩ hay khơng cĩ hoạt tính này.
Các dung dịch đệm (Buffers)
1. Hiệu suất, tính chính xác của enzyme DNA polymerase phụ thuộc nhiều vào hệ buffer sử dụng. Thơng thường nên sử dụng đúng loại buffer tương ứng với enzyme do nhà sản xuất khuyến cáo.
2. Một số buffer chứa chất hoạt động bề mặt cĩ thể ảnh hưởng đến các phản ứng microarray hoặc DHPLC.
3. Nhiều loại buffer đã cĩ sẵn một lượng nhất định ion Mg2+ nên cần lưu ý khi tối ưu hĩa nồng độ Mg2+
Nồng độ Mg2+ và dNTP
1. Việc tăng nồng độ ion Mg2+ cĩ thể làm xuất hiện thêm các sản phẩm khơng đặc hiệu. Tuy nhiên nếu thiếu ion Mg2+ thì dẫn đến lượng sản phẩm PCR thấp.
2. Nồng độ ion Mg2+ tối ưu phụ thuộc vào loại DNA polymerase, loại DNA template và thành phần buffer (một số buffer thương mại đã cĩ sẵn 1 lượng nhất định ion Mg2+).
3. Dị tìm nồng độ Mg2+ tối ưu thơng thường bằng gradien nồng độ từ 0.5 đến 2 mM với các khoảng cách mỗi bước là 0.2 mM.
4. dNTPs là loại hĩa chất kém bền cần lưu ý khi sử dụng và bảo quản. Nên chia nhỏ lượng dNTPs để giảm số lần làm tan, sử dụng lại.
5. Lượng dNTP tối ưu là 200 µM of mỗi loại dNTP. Việc tăng dNTP khơng làm tăng đáng kể lượng sản phẩm PCR so với việc hiệu chỉnh các yếu tố khác.
DNA khuơn (Template) và mồi (Primers)
1. Nồng độ tối ưu DNA template là từ 1) đối với các mẫu DNA tương đối đồng nhất (plasmid, lambda hoặc BAC DNA): 1 pg - 10 ng / 50 µl tổng thể tích phản ứng; 2) đối với mẫu DNA genome thì từ 50 - 500 ng/50 µl tổng thể tích.
Chất khác
1. Đối với các DNA template lớn, giàu GC thì cĩ thể sử dụng các chất biến tính như DMSO, formamide, glycerol, and betaine trong thành phần PCR. Tuy nhiên, phải kiểm tra độ tương thích đối với enzyme DNA polymerase. 2. Tăng lượng DMSO trong PCR sẽ cần giảm nhiệt bắt mồi xuống.
3. Một số buffer đã cĩ chứa sẵn loading buffer để cĩ thể điện di ngay sau PCR. Tuy nhiên, độ nhạy của PCR với những buffer này khơng cao.
4. Đối với các máy luân nhiệt (thermocycler) khơng cĩ gia nhiệt trên nắp thì nên bổ xung mineral oil để tránh bay hơi mẫu.
