PHẦN IPHƯƠNG PHÁP THU – BẢO QUẢN CHUẨN BỊ MẪU1.Tại sao các quy trình kiểm nghiệm vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm đều có thêm các bước nuôi tăng sinh và bước tăng sinh chọn lọc?2.Trình bày những yêu cầu chung trong việc lấy và xử lý mẫu?3.Mật độ vi sinh vật trong mẫu các mẫu nước, thực phẩm và mỹ phẩm khác với mẫu bệnh phẩm như thế nào?PHẦN IIPHÂN TÍCH VI SINH TRONG THỰC PHẨMBài 1PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS Escherichia coli 1.Coliform, Coliform chịu nhiệt, E. coli giả định, E. Coli là gì? Thí nghiệm cấy từ ống (+) BGBL qua ống môi trường EC, ủ 44,50C có cần thiết không? Giải thích tại sao?2.Trình bày cơ chế môi trường EMB, EC, BGBL?3.Sau khi hiểu được nguyên tắc của quy trình định lượng chỉ tiêu trên, các bạn thử xây dựng quy trình định lượng E.coli theo một phương pháp đếm đĩa?Bài 2PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG Streptococcus faecalisTRONG SỮA VÀ CÁC SẢN PHẨM SỮA1.Giải thích sự hình thành khuẩn lạc S. faecalis trên môi trường thạch TTC natri azit?2.Trình bày cơ chế môi trường canh thang Natri azit , môi trường thạch TTC natri azit?3.Tại sao kiểm tra chỉ tiêu S. faecalis phải đồng nhất mẫu vào đệm muối 3%? Có thể thay thế bằng môi trường khác được không?4.Sau khi hiểu được nguyên tắc của quy trình định lượng chỉ tiêu trên, các bạn thử xây dựng quy trình định lượng S. faecalis theo một phương pháp đếm đĩa?Bài 3PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG Staphylococcus aureusTRONG THỰC PHẨM1.Giải thích sự hình thành khuẩn lạc S. aureus trên môi trường Baird – Parker?2.Trình bày cơ chế môi trường Baird – Paker?3.Trình bày cơ chế của phản ứng coagulase?4.Sau khi hiểu được nguyên tắc của quy trình định lượng chỉ tiêu trên, các bạn thử xây dựng quy trình định lượng S. aureus theo phương pháp MPN?Bài 4PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG Bacillus cereusTRONG THỰC PHẨM1.Giải thích sự hình thành khuẩn lạc B. cereus trên môi trường Mossel?2.Trình bày cơ chế môi trường Mossel?3.Sau khi hiểu được nguyên tắc của quy trình định lượng chỉ tiêu trên, các bạn thử xây dựng quy trình định lượng B.cereus theo phương pháp đếm đĩa?Bài 5PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH Vibrio parahaemolyticusTRONG SẢN PHẨM THUỶ SẢN1.Giải thích sự hình thành khuẩn lạc V. parahaemolyticus trên môi trường TCBS?2.Trình bày cơ chế môi trường TCBS?3. Có thể bỏ qua bước tăng sinh mẫu trong peton kiềm, ủ 24h trong quy trình kiểm tra chỉ tiêu này được không?
PHẦN I PHƯƠNG PHÁP THU – BẢO QUẢN- CHUẨN BỊ MẪU Tại quy trình kiểm nghiệm vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm có thêm bước ni tăng sinh bước tăng sinh chọn lọc? - Nuôi tăng sinh: Phục hồi vi sinh vật bị tổn thương tăng sinh cho vi sinh vật mạnh lên Đây giống môi trường tăng sinh sở cho vi sinh vật - Tăng sinh chọn lọc: Trên môi trường đặc hiệu tạo điều kiện cho vi sinh vật cần phát phát triển, ức chế vi sinh vật khác Trình bày yêu cầu chung việc lấy xử lý mẫu? - Lấy mẫu: + Thời gian: • Nên: Lấy mẫu nhiều công đoạn, tốt công đoạn trọng tâm vào nhiều thời điểm • Có thể: Tập trung lấy mẫu công đoạn thành phẩm + Dụng cụ: • Lấy mẫu: Sát trùng để tách thành lượng mẫu cần thiết, dùng dụng cụ thích hợp (dao, thìa, kéo ) đưa mẫu vào dụng cụ chứa mẫu • Chưa mẫu: Nên sử dụng bình nhựa, chất dẻo có nắp, tránh sử dụng bình thủy tinh dễ bị bể vỡ + Vận chuyển bảo quản: • Mẫu bảo quản bao nước đá không tan chảy trọng q trình vận chuyển • Mẫu bảo quản tủ - 20 0C tủ lạnh – 40C (Tùy thuộc vào thời gian phân tích mẫu, phân tích sớm để tủ lạnh 0C, chưa có thời gian phân tích để tủ - 20 0C) - Xử lý mẫu: + Giải đông mẫu: Thực 0C – 50C/18h ( Tùy thuộc vào người làm thí nghiệm xử lý mẫu) Lắc mẫu liên tục để giải đông đồng nhiệt độ + Đông mẫu: Mẫu đồng nhất, phân bố + Cân mẫu Mật độ vi sinh vật mẫu mẫu nước, thực phẩm mỹ phẩm khác với mẫu bệnh phẩm nào? - Mật độ vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm THẤP HƠN NHIỀU lần (vài chục đến vài triệu) so với mẫu bệnh phẩm PHẦN II PHÂN TÍCH VI SINH TRONG THỰC PHẨM Bài PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS/ Escherichia coli CÂU HỎI: Coliform, Coliform chịu nhiệt, E coli giả định, E Coli gì? Thí nghiệm cấy từ ống (+) BGBL qua ống mơi trường EC, ủ 44,50C có cần thiết khơng? Giải thích sao? - Coliform: trực khuẩn đường ruột, gram âm, khơng sinh bào tử, hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi, lên men sinh lactose 370C/24-48h - Coliform chịu nhiệt: Vi sinh vật có khả nnawg lên men sinh lactose môi trường EC/44.50C 24h - E.coli giả định: coliform chịu nhiệt sinh endole canh Tryptone/44.5 0C 24h - E.coli: coliform giả định cho kết IMViC + + - - - Thí nghiệm cấy từ ống + BGBL cho qua ống môi trường EC, ủ 44,5 0C cần thiết Vì bước cần thiết để vừa để tăng sinh chọn lọc, vừa bước xác định Coliform chịu nhiệt Trình bày chế mơi trường EMB, EC, BGBL? • Mơi trường EC: - Pep ton: Cung cấp nguồn lượng (Nguồn N) - Lactose: Cung cấp nguồn lượng (Nguồn C) - Bile salt: Ức chế vi khuẩn Gram (+) - Sodium chloride: Cân áp suất thẩm thấu - Di-potassium hydrogenphosphate: Đệm Ổn định pH môi trường - Potassium di-hydrogenphosphate: Đệm Ổn định pH môi trường - Nước cất vừa đủ - pH sau trùng: 6.9 ± 0.2 - Hấp trùng 121oC/15 phút • - Mơi trường BGBL: Pepton: Cung cấp nguồn lượng (Nguồn N) Lactose: Cung cấp nguồn lượng (Nguồn C) Ox bile: Ức chế vi khuẩn Gram (+) - Brilliant green: + Ức chế vi khuẩn Gram (+) + Chất thị màu Nước cất vừa đủ pH sau trùng: 7.2 ± 0.2 Hấp trùng 121oC/15 phút Môi trường EMB: Pep ton: Cung cấp nguồn lượng (Nguồn N) Lactose: Cung cấp nguồn lượng (Nguồn C) Eosin Y, yellowish: + Ức chế vi khuẩn Gram (+) + Chất thị màu - Methylene blue: + Ức chế vi khuẩn Gram (+) + Chất thị màu - Di-potassium hydrogenphosphate: Đệm Ổn định pH môi trường - Agar - Nước cất vừa đủ - pH sau trùng: 7.1 ± 0.2 - Hấp trùng 121oC/15 phút Sau hiểu nguyên tắc quy trình định lượng tiêu trên, bạn thử xây dựng quy trình định lượng E.coli theo phương pháp đếm đĩa? • - Mẫu Đồng 10ml mẫu 90ml dung dịch NaCl 0,85% Pha loãng mẫu nồng độ liên tiếp Cấy lên mơi trường EMB Ủ 370C/24h Đếm khuẩn lạc điển hình (Khuẩn lạc màu tím ánh kim) Thử nghiệm sinh hóa (IMViC (++ )) Bài PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG Streptococcus faecalis TRONG SỮA VÀ CÁC SẢN PHẨM SỮA KẾT QUẢ KIỂM TRA ST T Bước thí nghiệm Cấy canh thang natri azit Kết Giải thích kết - Cấy Entero - - Kết 1 (ở nồng độ 10-2 10-3 cho kết dương tính) Giải thích: Kết dương tính vi khuẩn sử dụng nguồn đường glucose làm acid hóa mơi trường Chỉ thị màu Brommocresol purple chuyển màu môi trường thành màu vàng Kết quả: (Chọn ống dương canh thang natri azit cấy ria lên môi trường Entero) Hai đĩa nồng độ 10-2 10-3 khơng có khuẩn lạc mọc Giải thích: + Trường hợp 1: Khơng có diện vi khuẩn Streptococcus faecalis + Trường hợp 2: Nếu có diện vi khuẩn mà khơng phân lập đồng mẫu chưa đồng đều, thao tác cấy chưa tốt 3 Thử nghiệm sinh hóa: - Catalase - Nitrate Khơng có kết khơng có khuẩn lạc Tính số lượng S feacalis có mẫu thực phẩm Khơng có kết khơng có khuẩn lạc CÂU HỎI: Giải thích hình thành khuẩn lạc S faecalis môi trường thạch TTC natri azit? Khuẩn lạc đặc trưng có màu nâu đỏ Giải thích: Trên mơi trường TTC natri azit có chất thị màu TTC, TTC bị khử thành formazan _ chất khó tan có màu nâu đỏ Tạo màu nâu đỏ cho khuẩn lạc Trình bày chế môi trường canh thang Natri azit , môi trường thạch TTC natri azit? • Mơi trường canh thang Natri azit - Peptone: Cung cấp nguồn lượng (Nguồn N) - Glucose: Cung cấp nguồn lượng (Nguồn C) - NaCl: Cân áp suất thẩm thấu - K2HPO4: Đệm Ổn định pH môi trường - Natri azit: Ức chế phần lớn vi khuẩn gram (-) - Bromocresol màu tía: chất thị màu - • - Mơi trường thạch TTC natri azit Peptone: Cung cấp nguồn lượng (Nguồn N) Cao nấm men: Cung cấp nguồn lượng (Dinh dưỡng, vitamin) - Glucose: Cung cấp nguồn lượng (Nguồn C) K2HPO4: Đệm Ổn định pH môi trường Natri azit: Ức chế phần lớn vi khuẩn gram (-) Triphenyltetrazoiumchlorit (TTC): Chất màu nhận diện khuẩn lạc vi khuẩn (Màu đỏ, màu đỏ hồng) Agar Nước cất pH 7,2 Tại kiểm tra tiêu S faecalis phải đồng mẫu vào đệm muối 3%? Có thể thay môi trường khác không? - Phải đồng mẫu vào đệm muối 3%: Bản thân vi khuẩn Streptococcus loài ưa muối nên nồng độ thích hợp cho Streptococcus phát triển lại ức chế nhiều hệ vi sinh vật khác - Có thể thay đệm pepton 3% muối Sau hiểu nguyên tắc quy trình định lượng tiêu trên, bạn thử xây dựng quy trình định lượng S faecalis theo phương pháp đếm đĩa? Mẫu Đồng mẫu dung dịch NaCl 3% Pha loãng mẫu nồng độ liên tiếp Cấy lên môi trường TTC Natri azit Ủ 350C/ 18-24h Đếm khuẩn lạc điển hình (khuẩn lạc màu nâu đỏ) Nhuộm Gram (+) Thử nghiệm test sinh hóa Catalase (-) Nitrate (-) Bài PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG Staphylococcus aureus TRONG THỰC PHẨM KẾT QUẢ KIỂM TRA ST T Bước thí nghiệm Kết Giải thích kết Cấy BP - - Thử nghiệm Coagulase (Chưa chụp hình ảnh) - Coagulase (-) - Kết quả: Xuất khuẩn lạc điển hình tâm đen, vịng trắng đục hai nồng độ pha loãng 10-2 10-3 Ở nồng độ pha loãng 10-2 khuẩn lạc dày so với nồng độ pha lỗng 10-3 Giải thích: Do vi khuẩn có khả sinh enzyme lecithinase phân hủy lịng đỏ trứng làm xuất vòng sáng xung quanh khuẩn lạc; vi khuẩn có hoạt tính làm giảm Potassium tellurite làm khuẩn lạc có màu đen Kết quả: Coagulase âm tính Giải thích: Trường hợp 1: + Do khuẩn lạc đặc trưng lấy thử nghiệm nhỏ, làm ảnh hưởng đến kết + Do thao tác thí nghiệm Trường hợp 2: + Khuẩn lạc lấy khơng phải Staphylococcus aureus mà thuộc chi Staphylococcus nên cho khuẩn lạc điển hình tâm đen vòng trắng đục bao quanh khuẩn lạc Số lượng Staphylococci dương tính coagulase có mẫu thực phẩm Khơng có Staphylococcus dương tính coagulase CÂU HỎI: Giải thích hình thành khuẩn lạc S aureus môi trường Baird – Parker? - Khuẩn lạc đặc trưng: vịng sáng, tâm đen - Giải thích: + Vi khuẩn có khả sinh enzyme lecithinase phân hủy lòng đỏ trứng làm xuất vòng sáng xung quanh khuẩn lạc; + Vi khuẩn có khả giảm Potassium tellurite làm khuẩn lạc có màu đen Trình bày chế môi trường Baird – Paker? Peptone: Cung cấp nguồn lượng (nguồn N) Meat extract: Cung cấp protein, vitamin Yeast extract: Cung cấp protein, vitamin, khoáng Sodium pyruvate: Chất chọn lọc cho phát triển Staphylococci Glycine: Chất chọn lọc cho phát triển Staphylococci Lythium chloride: Chất ức chế vi khuẩn khác Potassium tellurite: Chất ức chế vi khuẩn khác Egg – yolk tellurite: + Vi khuẩn có khả sinh enzyme lecithinase phân hủy lòng đỏ trứng làm xuất vòng sáng xung quanh khuẩn lạc + Vi khuẩn có khả giảm Potassium tellurite làm khuẩn lạc có màu đen Sulfamethazine/ litre: Chất ức chế proteus 3 Trình bày chế phản ứng coagulase? - Staphylococcus có khả tổng hợp enzyme coagulase làm đông huyết tương người thỏ Sau hiểu nguyên tắc quy trình định lượng tiêu trên, bạn thử xây dựng quy trình định lượng S aureus theo phương pháp MPN? Mẫu Đồng mẫu dung dịch NaCl 0,85% Pha loãng mẫu nồng độ liên tiếp Tăng sinh môi trường MSB Ủ 370C/ 24h Chọn ống dương (màu vàng) cấy lên môi trường BP Ủ 370C/ 24h Chọn khuẩn lạc điển hình Thử nghiệm Coagulase Tra bảng MPN tính mật độ Bài PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG Bacillus cereus TRONG THỰC PHẨM CÂU HỎI: Giải thích hình thành khuẩn lạc B cereus mơi trường Mossel? - Khuẩn lạc đặc trưng: có màu hồng, vịng sáng xung quanh - Giải thích: + B cereus khơng có khả lên men đường manitol nên khuẩn lạc sử dụng nguồn pepton kiềm hóa mơi trường không làm đổi màu chất thị phenol red Màu khuẩn lạc màu mơi trường + Enzyme lecithinase thủy phân lecithin có lòng đỏ trứng tạo vòng sáng xung quanh Trình bày chế mơi trường Mossel? - Pepton: Cung cấp nguồn lượng (nguồn N) - Manitol: Cung cấp nguồn lượng (nguồn C) - Meat extract: Cung cấp protein, vitamin - Sodium chloride: Duy trì áp suất thẩm thấu - Phenol red: Chất thị màu - Polymycin B sulfate : Chất ức chế vi khuẩn Gram (-), tạo điều kiện cho vi khuẩn gram (+) phát triển Egg – yolk: Vi khuẩn có khả sinh enzyme lecithinase phân hủy lòng đỏ trứng làm xuất vòng sáng xung quanh khuẩn lạc - Agar - pH sau trùng: 7.2 ± 0.2 - Hấp trùng 121oC/15 phút Sau hiểu nguyên tắc quy trình định lượng tiêu trên, bạn thử xây dựng quy trình định lượng B.cereus theo phương pháp đếm đĩa? - \ Mẫu Đồng dung dịch NaCl 0,85% Pha loãng mẫu nồng độ liên tiếp Cấy trang môi trường Mosel Ủ 370C/24h Chọn khuẩn lạc đặc trưng nồng độ thích hợp (Màu hồng, vịng sáng) Làm mơi trường NA Nhuộm Gram (+) Thử nghiệm sinh hóa Nitrate(+) VP (+) Bài PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH Vibrio parahaemolyticus TRONG SẢN PHẨM THUỶ SẢN KẾT QUẢ KIỂM TRA STT Chỉ tiêu kiểm tra Kết Giải thích kết Cấy TCBS - - Thử nghiệm sinh hóa: - KIA - Oxidase - Indol - VP - Di động - LDC - TSB 0% NaCl - TSB 3% NaCl - TSB 6% NaCl - TSB 8% NaCl - TSB 10% NaCl Thử nghiệm Indol (-): khuẩn lạc lấy thử nghiệm test sinh hóa khơng Cho kết sai khác (Do nhóm lấy khuẩn lạc khóm khác nhau, khơng phải chung khuẩn lạc) - Thử nghiệm TSB: 0% muối vi khuẩn lên men làm đục mơi trường khuẩn lạc đem test sinh hóa khơng thuần, diện vi khuẩn khác làm đục môi trường TSB 0% Có diện V paraheamolyticus Tuy nhiên nhóm phân lập khuẩn lạc chưa dẫn đến sai lệch kết test sinh hóa cho diện V paraheamolyticus - Kết quả: Xuất khuẩn lạc màu xanh môi trường TCBS Giải thích: Mẫu nghi ngờ có nhiễm Vibrio parahaemolyticus khơng có khả lên men đường Sucrose sử dụng nguồn pepton làm kiềm hóa môi trường Thay đổi màu chất thị Bromithymol blue Thymol blue Có hay khơng V paraheamolyticus mẫu thực phẩm? CÂU HỎI: Giải thích hình thành khuẩn lạc V parahaemolyticus môi trường TCBS? Khuẩn lạc đặc trưng: dạng trịn, lồi, nhơ cao màu xanh Giải thích: + V parahaemolyticus khơng có khả lên men nguồn đường sucrose + Chúng sử dụng nguồn peptone làm nguồn dinh dưỡng nên làm kiềm hóa môi trường dẫn đến thay đổi màu chất thị màu Bromothymol blue Thymol blue Trình bày chế môi trường TCBS? Peptone : Cung cấp nguồn lượng (nguồn N) Sucrose: Cung cấp nguồn lượng (nguồn C) Yeast extract: Cung cấp protein, vitamin NaCl (CM cao): Tạo môi trường muối mặn Sodium citrate: Chất ức chế trực khuẩn đường ruột Sodium thiosunfate: Chất ức chế trực khuẩn đường ruột, khảo sát khả sinh khí H2S Sodium cholate: Ức chế cầu khuẩn đường ruột Mật bò:Ức chế cầu khuẩn đường ruột Ferico citrate: Khảo sát khả sinh H2S Bromothymol blue (6 -7,6): Chỉ thị màu Thymol blue (8 -9,6): Chỉ thị màu pH = 8,6 (kiềm cao) Có thể bỏ qua bước tăng sinh mẫu peton kiềm, ủ 24h quy trình kiểm tra tiêu khơng? - Khơng bỏ qua bước tăng sinh mẫu peton kiềm - Giải thích: Theo TCVN theo tiêu chuẩn xét nghiệm thủy sản khơng bỏ qua bước - Giải thích thêm: Bước tăng sinh pepton kiềm tạo điều kiện cho V.parahaemolyticus tăng sinh với số lượng lớn Trong quy trình định tính, lợi nhằm phát có mặt V parahaemolyticus Mặt khác, pepton kiềm ức chế hầu hết hệ vi sinh vật khác lại điều kiện thuận lợi cho Vibrio phát triển Đây bước quan trọng q trình ĐỊNH TÍNH V.parahaemolyticus