BÁO CÁO THỰC HÀNH KỸ THUẬT PHÂN TÍCH VI SINH

BÁO CÁO THỰC HÀNH KỸ THUẬT PHÂN TÍCH VI SINH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM – MÔI TRƯỜNG BÁO CÁO THỰC HÀNH KỸ THUẬT PHÂN TÍCH VI SINH

GVHD: ThS Phạm Minh Nhựt

Nhóm 6 -Lớp 14DSH04

Tp Hồ Chí Minh-2017 CHƯƠNG I: MỞ ĐẦU

1.1 GIỚI THIỆU

Như chúng ta đã biết nước và thực phẩm là những nhu cầu cần thiết nuôi sống con người thế nhưng cũng chính nó có thể gây ngộ độc hoặc gây bệnh cho con người, vì nếu không biết cách chế biến hay bảo quản thì sẽ tạo các vi sinh vật gây bệnh, các độc tố hóa học

Có rất nhiều vụ ngộ độc thực phẩm hoặc các bệnh về đường ruột do các vi sinh vật hiện diện trong nước và thực phẩm gây nên Ngộ độc thực phẩm biểu hiện các triệu chứng do vi sinh vật hiện diện trong thực phẩm hay nước uống mà chúng ta sử dụng hằng ngày gây ra Nhiễm bệnh do vi sinh vật trong thực phẩm là trường hợp nhiễm bệnh do sử

dụng thức ăn chứa các vi sinh vật gây bệnh như E.coli, Coliform, Staphylococus

Aureus, Salmonella, TPC.

Mặt khác, hiện nay ngộ độc thực phẩm còn bao gồm trường hợp thức ăn có chứa các

vi sinh vật gây bệnh hiện diện ở mật độ thấp trong nguyên liệu hay bị nhiễm vào trong quá trình chế biến, vì trong quá trình chế biến hay bảo quản, các vi sinh vật này và độc tố của chúng có thể tăng nhanh đến mức gây ngộ độc.

1.2 MỘT SỐ VI SINH VẬT GÂY BỆNH CÓ TRONG NƯỚC VÀ THỰC PHẨM

1.2.1 Tổng vi sinh vật hiếu khi (TPC)

- Vi sinh vật hiếu khí là những vi sinh vật tăng trưởng và hình thành trong điềukiện có sự hiện diện của oxy phân tử

- Chỉ tiêu tổng vi sinh vật hiếu khí (TPC) là tổng số vi sinh vật hiếu khí phát triểntrong điều kiện có sự hiện diện của oxy Chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm

1.2.2 Coliform

- Coliforms: là trực khuẩn, Gram âm, không sinh bào tử, kỵ khí tùy nghi, có khả

năng lên men lactose, sinh acid và hơi ở 37oC trong 24 - 48 giờ Có trong tự nhiên,ruột người và động vật

- Được xem là vi sinh vật chỉ thị an toàn vệ sinh thực phẩm bởi vì số lượng củachúng hiện diện trong mẫu chỉ thị khả năng có sự hiện diện của các vi sinh vật gâybệnh khác trong thực phẩm

1.2.3 Staphylococcus Aureus

- Staphylococcus aureus: Là cầu khuẩn gram dương, hiếu khí, thường kết dạng

chùm có mặt phổ biến ở khắp nơi như trên da, xoang mũi, tóc

- Staphylococcus Aureus sản sinh ra độc tố đường ruột enterotoxin bền nhiệt khi

ăn phải thực phẩm có chứa độc tố này sẽ bị ngộ độc

- Salmonella: Vi sinh vật thuộc loại trực khuẩn gram âm, kỵ khí tuỳ nghi, không

sinh bào tử, di động bằng tiên mao

- Samonella không lên men được Lactose ( trừ S.arizona ) và Sucrose Chúng kém

chịu nhiệt, có 3 dạng bệnh do Samonella gây ra: sốt thương hàn do S.typhi, nhiễmtrùng máu do S.cholera-suis, rối loạn tiêu hoá do S.typhirium và S.enteritidis

Chương II TỔNG QUAN

1 Nguồn mẫu phân tích:

a Mẫu thực phẩm:

+ Tên mẫu: Chả lụa

+ Thời gian thu mẫu: Sáng 7h20 ngày 29/03/2017.

+ Địa điểm thu mẫu: chợ Hàng xanh, Phường 25, Quận Bình Thạnh

+ Một số yếu tố cảm quan đặc trưng của mẫu:

+ Thời gian thu mẫu: Sáng 7h30 ngày 05/04/2017.

+ Địa điểm thu mẫu: chợ Hàng xanh, Phường 25, Quận Bình Thạnh TP.HCM

+ Một số yếu tố cảm quan đặc trưng của mẫu:

- Màu sắc: nâu cam

- Mùi: thơm mùi trà tắc

- Hình thức mẫu: lỏng

2 Các tác nhân gây nhiễm trên mẫu:

Ba tác nhân có nguy cơ lớn gây nhiễm trên thực phẩm ( cụ thể là mẫu thí nghiệm: thịt

gà công nghiệp và nước giếng ): ô nhiễm sinh học, ô nhiễm hóa học, ô nhiễm vật lý.

 Ô nhiễm sinh học:

Các mối nguy gây ô nhiễm sinh học : vi khuẩn, virus, kí sinh trùng.

Con đường gây ô nhiễm sinh học vào thực phẩm:

Súc vật bị bệnh; chế biến thực phẩm không vệ sinh; bảo quản thực phẩm trong điều kiện mất vệ sinh không che đậy

 Các tác nhân sinh học gây ô nhiễm thực phẩm:

Vi khuẩn: Vi khuẩn là mối nguy hay gặp nhất trong các mối nguy gây ô nhiễm thực phẩm Theo thống kê 50-60% các vụ ngộ độc thực phẩm ở Việt Nam là do vi khuẩn

gây ra Vi khuẩn có ở khắp mọi nơi, đặc biệt phân, nước thải, rác, bụi, thực phẩm tươi sống là ổ chứa nhiều loại vi khuẩn gây bệnh Ngay ở cơ thể người cũng có rất nhiều loại vi khuẩn, chúng cư trú ở da, bàn tay, ở miệng, đường hô hấp, đường tiêu hoá, bộ phận sinh dục, tiết niệu…

 Ký sinh trùng

Ký sinh trùng là những sinh vật sống nhờ (ký sinh) trong cơ thể các sinh vật khác (vật chủ) đang sống, lấy thức ăn từ các sinh vật đó để tồn tại và phát triển Hầu hết ký sinh trùng bị chết và mất khả năng gây bệnh ở nhiệt độ - 150C Các loại ký sinh trùng hay gặp trong thực phẩm là giun, sán

xử lý nước thải, bùn, đất, rác, quặng

+ Các chất hoá học sử dụng trong nông nghiệp như: thuốc bảo vệ thực vật, phân bón, thuốc thú y, chất tăng trọng, kích thích tăng trưởng

+Các chất phụ gia thực phẩm (các chất tạo mầu, tạo ngọt, hương liệu, chất ổn định, chất chống ôxy hoá, chất tẩy rửa ) sử dụng không đúng quy định như ngoài danh mục cho phép, hoặc sử dụng không đúng hướng dẫn của nhà sản xuất + Các hợp chất không mong muốn có trong bao bì chứa đựng, đóng gói thực phẩm.

+ Các chất độc tự nhiên có sẵn trong thực phẩm như ở mầm khoai tây, sắn, măng, nấm độc, cá nóc, cóc, nhuyễn thể hai mảnh vỏ (sò, vẹm, nghêu vỏ cứng), nấm mốc

sinh độc tố (độc tố vi nấm Aflatoxin trong ngô, lạc, đậu, cùi dừa bị mốc ) Ngộ độc do chất độc tự nhiện thường rất cấp tính, rất nặng, tỷ lệ tử vong rất cao (như ngộ độc măng, nấm độc, cá nóc, cóc); hoặc ảnh không tốt đến sức khoẻ lâu dài.

 Ô nhiễm vật lý:

+ Các mảnh kim loại, thuỷ tinh, mảnh gỗ, sạn, đất, sỏi, xương, lông tóc nếu bị lẫn vào thực phẩm, có thể làm nguy hại đến sức khoẻ con người như làm gẫy răng, hóc xương, làm tổn thương niêm mạc miệng, dạ dầy, ruột

+ Ô nhiễm phóng xạ từ các sự cố như rò rỉ phóng xạ từ các trung tâm nghiên cứu phóng xạ, các nhà máy điện nguyên tử hoặc các thực vật, động vật, nuôi trong vùng môi trường bị ô nhiễm phóng xạ, kể cả nước uống, sai sót trong việc bảo quản thực phẩm bằng chiếu xạ sẽ làm cho thực phẩm bị nhiễm các chất phóng xạ và gây hại cho người sử dụng khi ăn uống phải chúng.

Chương III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Địa điểm và thời gian:

3.1.1 Địa điểm:

- Địa điểm thu mẫu:

Chả lụa: chợ Hàng Xanh phường 25 quận Bình Thạnh

- Môi trường nuôi cấy: Plate Count Agar (PCA).

- Môi trường Tryptone Soya Agar (TSA)

- Môi trường Violet Red Bile Agar (VRB).

- Môi trường Brilliant Green Bile Lactose broth (BGBL).

- Môi trường Baird Parker (BPA) bổ sung Egg Yolk Tellurite.

- Môi trường Eosine Methylene blue (EMB).

- Canh tryptone.

- Canh MR-VP.

- Thạch Simmon Citrate.

- Môi trường Urea broth.

- Môi trường Lysine Decarboxylase (LDC).

- Môi trường Lactose broth.

- Ống nghiệm, Đĩa petri, Ống Durnham , Chai thủy tinh (250ml, 100ml…).

- Dây cấy thẳng, dây cấy vòng, Đèn cồn.

3.3 Phương pháp phân tích mẫu thực phẩm:

3.3.1 Xử lý mẫu phân tích cho các chỉ tiêu:

- Cắt nhỏ 25g mẫu cho vào PE vô trùng → sau đó thêm vào 225ml dung dịch BPW → đồng nhất mẫu → thu được mẫu có nồng độ 10 -1

3.3.2 Chỉ tiêu tổng vi sinh vật hiếu khí (TPC):

- Phân tích định lượng bằng phương pháp đổ đĩa.

- Quy trình phân tích:

25g mẫu + 225ml BPW → đồng nhất mẫu → độ pha loãng 10 -1 Pha loãng mẫu bằng nước muối sinh lý → độ pha loãng 10 -3 , 10 -4 , 10 -5 Mỗi độ pha loãng hút 1ml mẫu cho vào 2 đĩa petri vô trùng Sau đó đổ môi trường PCA đã nguội ở 45 o C vào Lắc nhẹ đều, chờ thạch nguội → úp ngược đĩa → đem ủ ở nhiệt độ 30 o C trong 72 giờ

- Đọc kết quả và tính toán kết quả

- Chọn và đếm các khuẩn lạc màu đỏ đến đỏ sậm, có quần tủa muối mật, đường kính lớn hơn 0.5mm Ở mỗi đĩa chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy sang môi trường BGBL Ủ ở nhiệt

độ 37 o C trong 24 giờ Đếm số ống BGBL dương tính và tính toán kết quả.

3.3.4 Chỉ tiêu Staphylococcus Aureus:

- Phân tích định lượng bằng phương pháp cấy trang.

3.3.5 Chỉ tiêu E.coli:

- Phân tích định tính.

- Quy trình phân tích:

25g mẫu + 225ml BPW → đồng nhất mẫu → độ pha loãng 10 -1

Hút 1ml mẫu pha loãng 10 -1 vào ống nghiệm chứa 10ml môi trường BGBL.Ủ ở nhiệt độ

44 o C trong 24 giờ Chọn ống BGBL đục có sinh hơi cấy chuyển sang môi trường EMB.

Ủ ở nhiệt độ 37 o C trong 24 giờ Khuẩn lạc đặc trưng của E.coli trên môi trường EMB có đặc điểm: tròn, dẹt, tâm đen, có ánh kim tím (giả định) Cấy sang môi trường TSA → ủ

37 o C trong 24 giờ.

Cấy vào 1 môi trường Trypton, 2 MR-VP, 1 Simmons Citrate Ủ 37 0 C trong 24 giờ Sử dụng các loại thuốc thử để test thử nghiệm IMVIC (Indol, Methy Red, Voges – Proskauer, Citrate)

Kết luận: phát hiện E.Coli trong mẫu hay không.

3.3.6 Chỉ tiêu Salmonella:

- Phân tích định tính.

- Quy trình phân tích:

25g mẫu + 225ml BPW → đồng nhất mẫu → độ pha loãng 10 -2 Ủ 37 o C trong 24 giờ Hút 0.1 ml mẫu sau khi tăng sinh cho vào ống nghiêm chứa 10ml môi trường RV Ủ 42 o C trong 24 giờ Sau đó, cấy ria sang môi trường XLD, ủ 37 o C trong 24 giờ Khuẩn lạc đặc

trưng của Salmonella trên XLD: tròn, lồi, có tâm đen, môi trường xung quanh khuẩn lạc

chuyển sang màu hồng

-Cấy khuẩn lạc vào môi trường thử nghiệm sinh hóa: TSI, LDC, Mannitol phenol red, Urea, canh trypton, MR-VP.

-Đọc các kết quả trên các môi trường thử nghiệm sinh hóa Kết luận: phát hiện

Salmonella trong mẫu hay không.

Chương IV: KẾT QUẢ

4.1 Kết quả đánh giá cảm quan mẫu:

4.3 Kết quả phân tích định lượng Coliform

Môi trường VRB nuôi cấy Coliform ủ 370 C trng 24 giờ.

Thử nghiệm khẳng định Coliform trên môi trường BGBL

Bảng kết quảNồng độ pha loãng 10-3 Số ống BGBL dương tính

dương tính

- Không có khuẩn lạc Coliform nào xuất hiện → Không có Coliform trong mẫu → Kết

quả phân tích âm tính.

- Mật độ Coliform trong mẫu:

4.4 Kết quả định lượng Staphylococcus Aureus

Khuẩn lạc Staphylococcus Aureus trên môi trường BP

Khuẩn lạc có đặc điểm tròn, lồi, có tâm đen, có quầng sáng bao xung quanh trênmôi trường BPA có bổ sung 5% Egg Yolk Tellurite.

- Có Staphylococcus Aureus trong mẫu

Bảng kết quảNồng độ pha loãng 10-1 Số ống huyết tương dương tính

4.5 Kết quả định tính E.coli

- Kết quả trên môi trường BGBL dương tính, EMB dương tính, trong thử nghiệm

imVic không khớp 2 trong 4 nghiệm pháp → trong mẫu không có E.coli

4.6 Kết quả phân tích Salmonella

Khuẩn lạc Salmonella trên môi trường XLD trong 24 giờ.

- Kết quả trên môi trường BPW: môi trường đục

- Kết quả trên môi trường RV: ống nghiệm chứa RV hơi đục.

- Kết quả trên môi trường XLD dương tính : xuất hiện khuẩn lạc đặc trưng (tròn lồi, trong suốt, có tâm đen, môi trường xung quanh khuẩn lạc chuyển sang màu đỏ).

- Kết quả thử nghiệm sinh hóa:

TSI Nghiêng vàng, sâu đen, có

- Kết quả: các ông nghiệm đều có Coliform trong môi trường LSB

- Từ các kết quả thí nghiệm mẫu chả lụa ta thấy mật độ vi sinh vật phát triển thấp (mật độ

vi sinh vật nuôi cấy trên môi trường TPC), xuất hiện Staphylococcus Aureus nhưng với mật độ thấp, không chứa Coliform, E.coli, Salmonella Chúng ta có thể sử dụng nguồn

chả lụa này làm thực phẩm nhưng không được để quá lâu hay qua ngày.

- Từ kết quả thí nghiệm nước trà tắc: nước trà tắc dương tính Colifom Chúng ta nên hạn chế sử dụng loại nước này.

CÂU HỎI ÔN TẬP

Bài 2/ 10

Câu 1: Nêu cách thu mẫu nước từ sông, suối, ao hồ?

Lấy mẫu từ sông, suối, ao, hồ như sau: cầm chai ở vị trí gần đáy chai, đưa cổ chaihướng xuống dưới và đưa sâu vào dưới mặt nước Xoay nhẹ để cổ chai hơinghiêng lên bề mặt nước và miệng chai hướng về phía dòng chảy Trong trườnghợp không có dòng chảy phải tạo ra một dòng chảy nhân tạo bằng cách xoay chaitheo hướng nằm ngang và đẩy chai về hướng miệng chai Trong trường hợp lấymẫu khi đi trên thuyền, mẫu phải được lấy trước mũi thuyền Nếu không thể lấymẫu bằng cách thức này, có thể buộc một vật nặng vào đáy chai rồi từ từ đưa nướcvào trong Trong tất cả các trường hợp tránh không cho dụng cụ lấy mẫu tiếp xúcvới bờ hay đáy của suối hay bồn chứa

Câu 2: Nêu cách thu mẫu thực phẩm trên 1 quy trình sản xuât?

Khi tiến hành thu mẫu thì việc thu mẫu ở công đoạn nguyên liệu và thành phẩm làbắt buộc, trong khi đó ở giai đoạn bán thành phẩm thì tùy từng loại mặt hàng sảnphẩm mà sẽ có các công đoạn khác nhau mà số lượng công đoạn cũng nhiều ítkhác nhau Tuy nhiên, không thể thu mẫu hết tất cả các công đoạn ở giai đoạn bánsản phẩm mà chỉ thu mẫu ở hai công đoạn liên tiếp của giai đoạn bán thành phẩmtrong một lần thu mẫu

Câu 3: Các thông tin cần thiết khi thu mẫu là gì?

Việc lấy mẫu phải đảm bảo hai điều kiện sau:

Mẫu lấy phải đại diện được cho lô hàng hoặc nơi lấy mẫu (khi kiểm tra vệ sinhcông nghiệp) và nhận dạng được rõ ràng

Hàm lượng các chất hay các vi sinh vật cần xác định không được biến đổi kể từ khilấy mẫu đến khi phân tích

Câu 4: Các bước chuẩn bị mẫu?

Gồm các bước rã đông mẫu , (nếu có), cắt mẫu, cho vào dịch pha loãng, đồng nhất mẫu.

Bài 3/ 15

Câu 1: Nêu khái niệm chỉ tiêu tổng sinh vật hiếu khí?

Tổng vi sinh vật hiếu khí là : là tống số vi sinh vật hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉthị ở mức độ vệ sinh của thực phẩm

Câu 2: Nêu quy trình phân tích chỉ tiêu TPC

1 Cân 25g mẫu pha chung với 225 ml SPW hoặc BPW sau đó đồng nhất mẫu trong 30s ta thu được độ pha loãng 10-1

2 Pha loãng trong nước muối sinh lý ta thu được độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4

3 Từ mỗi độ pha loãng hút 1ml cho vào hai đĩa petri vô trùng Sau đó đổ môi trường PCA đã được làm nguội ở 450C

4 Lắc đều và chờ đĩa thạch nguội úp ngược đem ủ ở nhiệt độ 300C trong 72 giờ

5 Đọc kết quả từ các kết quả từ 25 – 250 khuẩn lạc

6 Sau đó áp dụng công thức A = n N

1V1f1+…+n i V i f i

Trong đó A: số tế bào vi khuẩn (khuẩn lạc) có trong 1g mẫu

N: tổng số khuẩn lạc đếm được

ni: số lượng đĩa cấy tại nồng độ pha loãng thứ i

V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào môi trường

fi: độ pha loãng tương ứngCâu 3: Tính toán kết quả và đối chiếu kết quả trên TCVN đối với mẫu thực tếBài 4/21

Câu 1: Khái niệm Coliform tổng số: là số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm, nước hay các loại mẫu môi trường

Câu 2: Tại sao khi phân tích Coliform phải tiến hành đổ môi trường 2 lớp TSA vàVRB?

Bởi vì môi trường VRB dùng để chọn lọc vi khuẩn gram ( - ) thì các tế bào vi sinhvật có khả năng phát triển tốt mà chọn lọc vi sinh vật rất mạnh nên dẫn đến các tếbào bị tổn thương , xay xát mạnh nên ta cần phải phục hồi các té bào này nên ta đổthêm môi trường TSA để phục hồi lại các tế bào vi sinh vật để tránh kết quả bị saisót làm kết quả chính xác hơn

Câu 3: Nêu quy trình phân tích Coliform trong mẫu bằng phương pháp đỗ đĩa

1 25g mẫu + 225ml SPW sau đó đồng nhất mẫu trong 30 giây dduocrj độ pha loãng 10-1

2 Từ mỗi độ pha loãng hút 1ml vào 2 đĩa petri vô trùng Sau đó đổ môi trường TSA đã được làm nguội đến 450C và chờ trong 30 phút

3 Đổ vào môi trường VRB lên môi trường TSA

4 Ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ

5 Chọn và đếm các khuẩn lạc có màu đỏ đến đỏ sậm , có quần tủa muối mật , đường kính <0.5 mm

6 Ở mỗi đĩa chọn 3 – 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy sang môi trường BGBL

7 Ủ 370C± 0,5 trong 24 giờ

8 Tỷ lệ xác nhận R = Số khuẩn lạc sinh hơi trong BGBL/ số khuẩn lạc đã cấy

9 Tống số Colifroms ( cfu/g) A = n N

1V1f1+…+n i V i f i

Câu 4: Tính toán mật độ coliform trong các bài tập sau:

a) Kết quả phân tích Coliform bằng phương pháp đỗ đĩa ở nồng độ pha loãng

10-1 trên 2 đĩa được kết quả lần lượt là 9 và 8 khuẩn lạc Chọn 5 khuẩn lạccấy vào môi trường BGBL thấy có 4 ống dương tính Hãy tính kết quả?

A ¿ 9 1.10−1.1 x 45 => A< 7,2 x 101 (CFU/ml)b) Kết quả định lượng Coliform bằng phương pháp đổ đĩa như sau: nồng độ 10-

1 ở 2 đĩa là 105 và 80 khuẩn lạc, nồng độ pha loãng 10-2 ở 2 đĩa là 20 và 38