BÁO CÁO THỰC HÀNH KỸ THUẬT PHÂN TÍCH VI SINH

BÁO CÁO THỰC HÀNH KỸ THUẬT PHÂN TÍCH VI SINH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM – MÔI TRƯỜNG BÁO CÁO THỰC HÀNH KỸ THUẬT PHÂN TÍCH VI SINH GVHD: ThS Phạm Minh Nhựt Nhóm -Lớp 14DSH04 Tp Hồ Chí Minh-2017 CHƯƠNG I: MỞ ĐẦU 1.1 GIỚI THIỆU Như biết nước thực phẩm nhu cầu cần thiết ni sống người gây ngộ độc gây bệnh cho người, khơng biết cách chế biến hay bảo quản tạo vi sinh vật gây bệnh, độc tố hóa học Có nhiều vụ ngộ độc thực phẩm bệnh đường ruột vi sinh vật diện nước thực phẩm gây nên Ngộ độc thực phẩm biểu triệu chứng vi sinh vật diện thực phẩm hay nước uống mà sử dụng ngày gây Nhiễm bệnh vi sinh vật thực phẩm trường hợp nhiễm bệnh sử dụng thức ăn chứa vi sinh vật gây bệnh E.coli, Coliform, Staphylococus Aureus, Salmonella, TPC Mặt khác, ngộ độc thực phẩm bao gồm trường hợp thức ăn có chứa vi sinh vật gây bệnh diện mật độ thấp nguyên liệu hay bị nhiễm vào trình chế biến, trình chế biến hay bảo quản, vi sinh vật độc tố chúng tăng nhanh đến mức gây ngộ độc 1.2 MỘT SỐ VI SINH VẬT GÂY BỆNH CÓ TRONG NƯỚC VÀ THỰC PHẨM 1.2.1 Tổng vi sinh vật hiếu (TPC) - Vi sinh vật hiếu khí vi sinh vật tăng trưởng hình thành điều kiện có diện oxy phân tử - Chỉ tiêu tổng vi sinh vật hiếu khí (TPC) tổng số vi sinh vật hiếu khí phát triển điều kiện có diện oxy Chỉ thị mức độ vệ sinh thực phẩm 1.2.2 Coliform - Coliforms: trực khuẩn, Gram âm, khơng sinh bào tử, kỵ khí tùy nghi, có khả lên men lactose, sinh acid 37 oC 24 - 48 Có tự nhiên, ruột người động vật - Được xem vi sinh vật thị an toàn vệ sinh thực phẩm số lượng chúng diện mẫu thị khả có diện vi sinh vật gây bệnh khác thực phẩm 1.2.3 Staphylococcus Aureus - Staphylococcus aureus: Là cầu khuẩn gram dương, hiếu khí, thường kết dạng chùm có mặt phổ biến khắp nơi da, xoang mũi, tóc - Staphylococcus Aureus sản sinh độc tố đường ruột enterotoxin bền nhiệt ăn phải thực phẩm có chứa độc tố bị ngộ độc 1.2.4 E.Coli - E.coli là trực khuẩn, Gram âm, khơng sinh bào tử, kỵ khí tùy nghi, có khả lên men lactose, sinh acid 44oC 24 - 48 - Cho kết thử nghiệm IMViC là: Indol(+), Methyl Red (+), Voges Proskauer (-), Citrate (-) 1.2.5 Salmonella - Salmonella: Vi sinh vật thuộc loại trực khuẩn gram âm, kỵ khí tuỳ nghi, không sinh bào tử, di động tiên mao - Samonella không lên men Lactose ( trừ S.arizona ) Sucrose Chúng chịu nhiệt, có dạng bệnh Samonella gây ra: sốt thương hàn S.typhi, nhiễm trùng máu S.cholera-suis, rối loạn tiêu hoá S.typhirium S.enteritidis Chương II TỔNG QUAN Nguồn mẫu phân tích: a Mẫu thực phẩm: + Tên mẫu: Chả lụa + Thời gian thu mẫu: Sáng 7h20 ngày 29/03/2017 + Địa điểm thu mẫu: chợ Hàng xanh, Phường 25, Quận Bình Thạnh + Một số yếu tố cảm quan đặc trưng mẫu: - Màu: trắng đục đặc trưng Mùi: mùi đặc trưng chả lụa không hôi thối Hình thức mẫu: lát trịn b Mẫu nước: + Tên mẫu: trà tắc + Thời gian thu mẫu: Sáng 7h30 ngày 05/04/2017 + Địa điểm thu mẫu: chợ Hàng xanh, Phường 25, Quận Bình Thạnh TP.HCM + Một số yếu tố cảm quan đặc trưng mẫu: - Màu sắc: nâu cam Mùi: thơm mùi trà tắc Hình thức mẫu: lỏng Các tác nhân gây nhiễm mẫu: Ba tác nhân có nguy lớn gây nhiễm thực phẩm ( cụ thể mẫu thí nghiệm: thịt gà công nghiệp nước giếng ): ô nhiễm sinh học, nhiễm hóa học, nhiễm vật lý  Ơ nhiễm sinh học: Các mối nguy gây ô nhiễm sinh học : vi khuẩn, virus, kí sinh trùng Con đường gây ô nhiễm sinh học vào thực phẩm: Súc vật bị bệnh; chế biến thực phẩm không vệ sinh; bảo quản thực phẩm điều kiện vệ sinh không che đậy  Các tác nhân sinh học gây ô nhiễm thực phẩm: Vi khuẩn: Vi khuẩn mối nguy hay gặp mối nguy gây ô nhiễm thực phẩm Theo thống kê 50-60% vụ ngộ độc thực phẩm Việt Nam vi khuẩn gây Vi khuẩn có khắp nơi, đặc biệt phân, nước thải, rác, bụi, thực phẩm tươi sống ổ chứa nhiều loại vi khuẩn gây bệnh Ngay thể người có nhiều loại vi khuẩn, chúng cư trú da, bàn tay, miệng, đường hơ hấp, đường tiêu hố, phận sinh dục, tiết niệu…  Siêu vi trùng(virus) Virus nhỏ vi khuẩn nhiều lần, phải dùng kính hiển vi điện tử phóng đại hàng vạn lần nhìn thấy chúng Nói chung virus chịu lạnh, khơng chịu nóng tia tử ngoại Virus bị ảnh hưởng chất sát khuẩn formol, cồn, acid kiềm mạnh Virus gây ngộ độc thực phẩm bệnh truyền qua thực phẩm thường có ruột người Các loại nhuyễn thể sống vùng nước bị ô nhiễm, rau tưới nước có phân ăn sống chuẩn bị điều kiện thiếu vệ sinh thường hay bị nhiễm virus bại liệt, virus viêm gan Virus lây truyền từ phân qua tay người tiếp xúc từ nước bị ô nhiễm phân vào thực phẩm, với lượng nhỏ, virus gây nhiễm bệnh cho người Virus nhiễm người lây sang thực phẩm trực tiếp lây sang người khác trước phát bệnh  Ký sinh trùng Ký sinh trùng sinh vật sống nhờ (ký sinh) thể sinh vật khác (vật chủ) sống, lấy thức ăn từ sinh vật để tồn phát triển Hầu hết ký sinh trùng bị chết khả gây bệnh nhiệt độ - 150C Các loại ký sinh trùng hay gặp thực phẩm giun, sán  Ơ nhiễm hóa học: Trong sản xuất, chế biến thực phẩm xảy nhiễm hóa học Những chất hố học hay bị ô nhiễm vào thực phẩm gồm: + Các chất ô nhiễm từ mơi trường như: chì khí thải phương tiện vận tải, có sơn, men gốm, mối hàn ô nhiễm vào thực phẩm; ô nhiễm cadimi xử lý nước thải, bùn, đất, rác, quặng + Các chất hố học sử dụng nơng nghiệp như: thuốc bảo vệ thực vật, phân bón, thuốc thú y, chất tăng trọng, kích thích tăng trưởng +Các chất phụ gia thực phẩm (các chất tạo mầu, tạo ngọt, hương liệu, chất ổn định, chất chống ôxy hố, chất tẩy rửa ) sử dụng khơng quy định danh mục cho phép, sử dụng không hướng dẫn nhà sản xuất + Các hợp chất khơng mong muốn có bao bì chứa đựng, đóng gói thực phẩm + Các chất độc tự nhiên có sẵn thực phẩm mầm khoai tây, sắn, măng, nấm độc, cá nóc, cóc, nhuyễn thể hai mảnh vỏ (sò, vẹm, nghêu vỏ cứng), nấm mốc sinh độc tố (độc tố vi nấm Aflatoxin ngô, lạc, đậu, cùi dừa bị mốc ) Ngộ độc chất độc tự nhiện thường cấp tính, nặng, tỷ lệ tử vong cao (như ngộ độc măng, nấm độc, cá nóc, cóc); ảnh khơng tốt đến sức khoẻ lâu dài  Ô nhiễm vật lý: + Các mảnh kim loại, thuỷ tinh, mảnh gỗ, sạn, đất, sỏi, xương, lơng tóc bị lẫn vào thực phẩm, làm nguy hại đến sức khoẻ người làm gẫy răng, hóc xương, làm tổn thương niêm mạc miệng, dầy, ruột + Ô nhiễm phóng xạ từ cố rị rỉ phóng xạ từ trung tâm nghiên cứu phóng xạ, nhà máy điện nguyên tử thực vật, động vật, nuôi vùng môi trường bị ô nhiễm phóng xạ, kể nước uống, sai sót việc bảo quản thực phẩm chiếu xạ làm cho thực phẩm bị nhiễm chất phóng xạ gây hại cho người sử dụng ăn uống phải chúng Chương III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Địa điểm thời gian: 3.1.1 Địa điểm: - Địa điểm thu mẫu: Chả lụa: chợ Hàng Xanh phường 25 quận Bình Thạnh Trà tắc - Địa điểm phân tích: phịng thực hành lầu trường Đại học Cơng Nghệ Tp Hồ Chí Minh 3.1.2 Thời gian: - Thời gian: từ ngày 29/03/2016 đến 05/04/2016 3.2 Vật liệu: 3.2.1 Mẫu: - Chả lụa - Trà tắc 3.2.2 Môi trường cần sử dụng: - Mơi trường pha lỗng mẫu: Saline Pepton Water (SPW) Bufer pepton Water (BPW) - Môi trường nuôi cấy: Plate Count Agar (PCA) - Môi trường Tryptone Soya Agar (TSA) - Môi trường Violet Red Bile Agar (VRB) - Môi trường Brilliant Green Bile Lactose broth (BGBL) - Môi trường Baird Parker (BPA) bổ sung Egg Yolk Tellurite - Môi trường Eosine Methylene blue (EMB) - Canh tryptone - Canh MR-VP - Thạch Simmon Citrate - Môi trường Urea broth - Môi trường Lysine Decarboxylase (LDC) - Mơi trường Lactose broth 3.2.3 Hóa chất: - Nước muối sinh lý - Thuốc thử Kovac’c - Thuốc thử Methyl Red 3.2.4 Dụng cụ: - Ống nghiệm, Đĩa petri, Ống Durnham , Chai thủy tinh (250ml, 100ml…) - Dây cấy thẳng, dây cấy vòng, Đèn cồn - Micropipette 3.2.5 Thiết bị: - Tủ ấm - Bể điều nhiệt - Nồi hấp khử trùng Autoclave 3.3 Phương pháp phân tích mẫu thực phẩm: 3.3.1 Xử lý mẫu phân tích cho tiêu: - Cắt nhỏ 25g mẫu cho vào PE vơ trùng → sau thêm vào 225ml dung dịch BPW → đồng mẫu → thu mẫu có nồng độ 10-1 3.3.2 Chỉ tiêu tổng vi sinh vật hiếu khí (TPC): - Phân tích định lượng phương pháp đổ đĩa - Quy trình phân tích: 25g mẫu + 225ml BPW → đồng mẫu → độ pha loãng 10 -1 Pha loãng mẫu nước muối sinh lý → độ pha loãng 10-3, 10-4, 10-5 Mỗi độ pha loãng hút 1ml mẫu cho vào đĩa petri vơ trùng Sau đổ mơi trường PCA nguội 45 oC vào Lắc nhẹ đều, chờ thạch nguội → úp ngược đĩa → đem ủ nhiệt độ 30oC 72 - Đọc kết tính tốn kết 3.3.3 Chỉ tiêu Coliform: - Phân tích định lượng phương pháp đổ đĩa - Quy trình phân tích: 25g mẫu + 225ml BPW → đồng mẫu → độ pha loãng 10 -2 Hút 1ml mẫu pha lỗng vào đĩa petri vơ trùng Sau đổ mơi trường TSA (khoảng 5ml) nguội chờ 30 phút Sau đổ mơi trường VRB (10 ml) nguội Ủ nhiệt độ 37oC 24 - Chọn đếm khuẩn lạc màu đỏ đến đỏ sậm, có quần tủa muối mật, đường kính lớn 0.5mm Ở đĩa chọn khuẩn lạc đặc trưng cấy sang môi trường BGBL Ủ nhiệt độ 37oC 24 Đếm số ống BGBL dương tính tính tốn kết 3.3.4 Chỉ tiêu Staphylococcus Aureus: - Phân tích định lượng phương pháp cấy trang - Quy trình phân tích: 25g mẫu + 225ml BPW → đồng mẫu → độ pha loãng 10 -1 Hút 0.1ml mẫu vào đĩa petri chứa môi trường BP có bổ sung 5% Egg Yolk Tellurite Sau trang đến khô Ủ nhiệt độ 37oC 48 Ở đĩa chọn khuẩn lạc đặc trưng cấy sang môi trường đông tụ huyết tương.( điều kiện khơng có hut tương nên thực hành không thực bước  R=1 3.3.5 Chỉ tiêu E.coli: - Phân tích định tính - Quy trình phân tích: 25g mẫu + 225ml BPW → đồng mẫu → độ pha loãng 10-1 Hút 1ml mẫu pha lỗng 10 -1 vào ống nghiệm chứa 10ml mơi trường BGBL.Ủ nhiệt độ 44oC 24 Chọn ống BGBL đục có sinh cấy chuyển sang mơi trường EMB Ủ nhiệt độ 37oC 24 Khuẩn lạc đặc trưng E.coli mơi trường EMB có đặc điểm: trịn, dẹt, tâm đen, có ánh kim tím (giả định) Cấy sang môi trường TSA → ủ 37oC 24 Cấy vào môi trường Trypton, MR-VP, Simmons Citrate Ủ 37 0C 24 Sử dụng loại thuốc thử để test thử nghiệm IMVIC (Indol, Methy Red, Voges – Proskauer, Citrate) Kết luận: phát E.Coli mẫu hay không 3.3.6 Chỉ tiêu Salmonella: - Phân tích định tính - Quy trình phân tích: 25g mẫu + 225ml BPW → đồng mẫu → độ pha loãng 10 -2 Ủ 37oC 24 Hút 0.1 ml mẫu sau tăng sinh cho vào ống nghiêm chứa 10ml môi trường RV Ủ 42 oC 24 Sau đó, cấy ria sang môi trường XLD, ủ 37 oC 24 Khuẩn lạc đặc trưng Salmonella XLD: trịn, lồi, có tâm đen, môi trường xung quanh khuẩn lạc chuyển sang màu hồng -Cấy khuẩn lạc vào môi trường thử nghiệm sinh hóa: TSI, LDC, Mannitol phenol red, Urea, canh trypton, MR-VP -Đọc kết môi trường thử nghiệm sinh hóa Kết luận: phát Salmonella mẫu hay không Chương IV: KẾT QUẢ 4.1 Kết đánh giá cảm quan mẫu: Mẫu thực phẩm: Chả lụa Kết cấu: có độ rắn vừa phải Thời gian lấy mẫu: 7g20 sáng ngày 29/03/17 Mẫu nước: Trà tắc Có màu nâu cam, mùi thơm trà tắc Thời gian lấy mẫu: 7g30 sáng ngày 05/04/17 4.2 Kết định lượng TPC Khuẩn lạc TPC nuôi cấy môi trường PCA ủ 370C 72 Nồng độ Đĩa Đĩa Bảng kết đếm khuẩn lạc 10-3 32 34 Mật độ TPC mẫu: A = = = 55.103 (cfu/ml) 10 10-4 26 29 Các thử nghiệm định tính E.coli Bảng kết Kết BGBL (+) Kết EMB (+) Kết sinh hóa Indol: (-) MR: (+) VP: (-) Citrate: (+) - Kết mơi trường BGBL dương tính, EMB dương tính, thử nghiệm imVic không khớp nghiệm pháp → mẫu khơng có E.coli 15 4.6 Kết phân tích Salmonella Khuẩn lạc Salmonella mơi trường XLD 24 - Kết môi trường BPW: môi trường đục - Kết môi trường RV: ống nghiệm chứa RV đục - Kết môi trường XLD dương tính : xuất khuẩn lạc đặc trưng (trịn lồi, suốt, có tâm đen, mơi trường xung quanh khuẩn lạc chuyển sang màu đỏ) - Kết thử nghiệm sinh hóa: 16 TSI Nghiêng vàng, sâu đen, có H2S, có sinh LDC + Mannitol Urea + Indol + VP - Từ kết cho thấy khơng có xuất Salmonella mẫu thí nghiệm TSI âm tính (khơng nghiêng đỏ, sâu vàng) → Salmonella âm tính 4.7 Kết phân tích mẫu nước 17 - Kết quả: ơng nghiệm có Coliform mơi trường LSB - Kết tính tốn A == = 0,72x103 (MPN/ml) V Kết luận kiến nghị 5.1 Kết luận: - Từ kết thí nghiệm mẫu chả lụa ta thấy mật độ vi sinh vật phát triển thấp (mật độ vi sinh vật nuôi cấy môi trường TPC), xuất Staphylococcus Aureus với mật độ thấp, không chứa Coliform, E.coli, Salmonella Chúng ta sử dụng nguồn chả lụa làm thực phẩm không để lâu hay qua ngày - Từ kết thí nghiệm nước trà tắc: nước trà tắc dương tính Colifom Chúng ta nên hạn chế sử dụng loại nước 18 CÂU HỎI ÔN TẬP Bài 2/ 10 Câu 1: Nêu cách thu mẫu nước từ sông, suối, ao hồ? Lấy mẫu từ sông, suối, ao, hồ sau: cầm chai vị trí gần đáy chai, đưa cổ chai hướng xuống đưa sâu vào mặt nước Xoay nhẹ để cổ chai nghiêng lên bề mặt nước miệng chai hướng phía dịng chảy Trong trường hợp khơng có dòng chảy phải tạo dòng chảy nhân tạo cách xoay chai theo hướng nằm ngang đẩy chai hướng miệng chai Trong trường hợp lấy mẫu thuyền, mẫu phải lấy trước mũi thuyền Nếu lấy mẫu cách thức này, buộc vật nặng vào đáy chai từ từ đưa nước vào Trong tất trường hợp tránh không cho dụng cụ lấy mẫu tiếp xúc với bờ hay đáy suối hay bồn chứa Câu 2: Nêu cách thu mẫu thực phẩm quy trình sản xuât? Khi tiến hành thu mẫu việc thu mẫu công đoạn nguyên liệu thành phẩm bắt buộc, giai đoạn bán thành phẩm tùy loại mặt hàng sản phẩm mà có cơng đoạn khác mà số lượng cơng đoạn nhiều khác Tuy nhiên, thu mẫu hết tất công đoạn giai đoạn bán sản phẩm mà thu mẫu hai công đoạn liên tiếp giai đoạn bán thành phẩm lần thu mẫu Câu 3: Các thơng tin cần thiết thu mẫu gì? Việc lấy mẫu phải đảm bảo hai điều kiện sau: Mẫu lấy phải đại diện cho lô hàng nơi lấy mẫu (khi kiểm tra vệ sinh công nghiệp) nhận dạng rõ ràng Hàm lượng chất hay vi sinh vật cần xác định không biến đổi kể từ lấy mẫu đến phân tích Câu 4: Các bước chuẩn bị mẫu? Gồm bước rã đơng mẫu , (nếu có), cắt mẫu, cho vào dịch pha loãng, đồng mẫu 19 Bài 3/ 15 Câu 1: Nêu khái niệm tiêu tổng sinh vật hiếu khí? Tổng vi sinh vật hiếu khí : tống số vi sinh vật hiếu khí diện mẫu thị mức độ vệ sinh thực phẩm Câu 2: Nêu quy trình phân tích tiêu TPC Cân 25g mẫu pha chung với 225 ml SPW BPW sau đồng mẫu 30s ta thu độ pha loãng 10-1 Pha loãng nước muối sinh lý ta thu độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4 Từ độ pha lỗng hút 1ml cho vào hai đĩa petri vơ trùng Sau đổ mơi trường PCA làm nguội 450C Lắc chờ đĩa thạch nguội úp ngược đem ủ nhiệt độ 300C 72 Đọc kết từ kết từ 25 – 250 khuẩn lạc Sau áp dụng cơng thức A = Trong A: số tế bào vi khuẩn (khuẩn lạc) có 1g mẫu N: tổng số khuẩn lạc đếm ni: số lượng đĩa cấy nồng độ pha loãng thứ i V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào mơi trường fi: độ pha lỗng tương ứng Câu 3: Tính tốn kết đối chiếu kết TCVN mẫu thực tế Bài 4/21 Câu 1: Khái niệm Coliform tổng số: số lượng diện chúng thực phẩm, nước hay loại mẫu môi trường Câu 2: Tại phân tích Coliform phải tiến hành đổ mơi trường lớp TSA VRB? Bởi mơi trường VRB dùng để chọn lọc vi khuẩn gram ( - ) tế bào vi sinh vật có khả phát triển tốt mà chọn lọc vi sinh vật mạnh nên dẫn đến tế bào bị tổn thương , xay xát mạnh nên ta cần phải phục hồi té bào nên ta đổ thêm môi trường TSA để phục hồi lại tế bào vi sinh vật để tránh kết bị sai sót làm kết xác 20 Câu 3: Nêu quy trình phân tích Coliform mẫu phương pháp đỗ đĩa 25g mẫu + 225ml SPW sau đồng mẫu 30 giây dduocrj độ pha loãng 10-1 Từ độ pha loãng hút 1ml vào đĩa petri vơ trùng Sau đổ mơi trường TSA làm nguội đến 450C chờ 30 phút Đổ vào môi trường VRB lên môi trường TSA Ủ nhiệt độ 370C 24 Chọn đếm khuẩn lạc có màu đỏ đến đỏ sậm , có quần tủa muối mật , đường kính A< 7,2 x 101 (CFU/ml) b) Kết định lượng Coliform phương pháp đổ đĩa sau: nồng độ 10 đĩa 105 80 khuẩn lạc, nồng độ pha loãng 10 -2 đĩa 20 38 Chọn khuẩn lạc cấy vào mơi trường BGBL  có KL dương tính Hãy tính kết quả? A = = 9,2 x 102 (CFU/ml) c) Tiến hành phân tích tiêu Coliform mẫu thịt heo Quy trình thực sau: cân 1g mẫu sau cho vào 99ml dung dịch pha lỗng Thực phương pháp đổ đĩa mơi trường VRB Kết thu 85 20 Lấy khuẩn lạc cấy vào môi trường BGBL thấy có ống dương tính Hãy tính kết quả? Nồng độ pha loãng mẫu: => 10-2 A = 4,2 x 103 ( CFU/ml) Bài 5/28 21 Câu 1: Nguyên tắc định lượng S aureus Tiến hành cân lượng mẫu định, pha loãng đến độ pha loãng phù hợp Hút mẫu cho vào môi trường đăc trưng cho Staphylococcus aureus tiến hành trang mẫu, ủ nhiệt độ 370C 48 Đếm số khuẩn lạc đặc trưng cho S aureus, khẳng định thử nghiệm coagulase tính tốn kết 1g mẫu Một vài chủng cho coagulase âm tính tạo độc tố đường ruột Câu 2: Đặc điểm khuẩn lạc S aureus mơi trường BPA? Giải thích Trong mơi trường Baird Parker: S aureus có đặc điểm trịn, lồi, có tâm đen, bóng vun có vịng sáng quanh khuẩn lạc Khuẩn lạc Staphylococci có hai đặc điểm: khuẩn lạc có màu đen khử telurite thành telurium, dạng lồi tạo vịng xung quanh khuẩn lạc,đường kính từ – mm thủy phân protein Sau xuất vịng đục vịng (có tác động lecithinase, loại lipase) Đây đặc tính thường thấy có tính chuyên biệt tụ cầu khuẩn gây bệnh Câu 3: Tại khẳng định S aureus huyết tương thỏ ủ 37 oC lại theo dõi 2,4,6,8 24 giờ? Trên môi trường BP: Chọn khuẩn lạc đặc trưng khuẩn lạc không đặc trưng từ môi trường BP cấy vào môi trường TSA Ủ 37 oC 24 Cấy sinh khối vi sinh vật vào ống nghiệm chứa môi trường huyết tương thỏ Ủ 37 oC Theo dõi phản ứng đông tụ huyết tương 2,4,6,8,24 Tính tỉ lệ khẳng định khuẩn lạc đặc trưng không đặc trưng Để khẳng định đặc tính, thời gian đơng tụ máu ngắn độc tính mạnh Câu 4: Nêu quy trình định lượng S aureus mẫu phương pháp đổ đĩa 22 Cấy 0,1 ml dịch mẫu pha lỗng cho vào đĩa petri mơi trường BPA có bổ sung Egg Yolk trang khô mẫu  ủ 37oC 48h  Sau 48 có khuẩn lạc đặc trưng (trịn, lồi, có tâm đen, quầng sáng bao quanh)  Đếm số lượng khuẩn lạc đĩa  chọn khuẩn lạc cấy chuyền sang môi trường TSA  ủ 37oC qua đêm  Cấy chuyền vào ống chứa huyết tương, ủ 37 oC theo dõi sau 2,4,6,8 24 Câu 5: Tính tốn mật độ S aureus tập sau a) Kết phân tích S aureus pp cấy trang nồng độ pha loãng 10 -1 đĩa 55 78 khuẩn lạc Chọn khuẩn lạc cấy vào huyết tương thấy có ống dương tính Hãy tính kết quả? A= = 5,32.102 (CFU/g) b) Kết phân tích S aureus pp đỗ đĩa nồng độ pha loãng 10 -1 đĩa thu 35 78 khuẩn lạc Chọn khuẩn lạc cấy vào huyết tương thấy có ống dương tính Hãy tính tốn kết quả? A= = 4,5.103 (CFU/g) c) Tiến hành phân tích tiêu S aureus mẫu thịt heo Quy trình thực sau: cân 1g mẫu sau cho vào 99 ml dd pha loãng Thực pp đỗ đĩa môi trường BPA Kết thu 85 20 Lấy khuẩn lạc cấy vào môi trường huyết tương thỏ có ống dương tính Tính tốn kết Nồng độ pha lỗng mẫu: => 10-2 A= = 4,2.103 (CFU/g) Bài 6/34 Câu 1: Nguyên tắc định tính E Coli Phương pháp dùng để định tính kết luận phát hay khơng phát E.Coli khối lượng mẫu xác định 23 - Tiến hành tăng sinh chọn lọc môi trường thích hợp (BGBL) Phân lập mơi trường phù hợp (EMB) Khẳng định phản ứng sinh hóa phù hợp (IMViC) Kết luận có diện E.Coli 25 g mẫu hay không? Câu 2: Đặc điểm khuẩn lạc E Coli môi trường EMB? Giải thích Đặc điểm khuẩn lạc E.Coli mơi trường EMB: trịn, dẹt, tâm đen, có ánh kim tím - Đặc điểm khuẩn lạc: trịn, dẹt, tâm đen, có ánh kim tím - Có tâm đen: Do E.Coli phân hủy lưu huỳnh tiết enzyme sulfohydrolase khử S kết hợp Fe2+ tạo kết tủa FeS - Có ánh kim tím: Lactose lên men tạo sản phẩm acid, acid tích tụ nhiều làm cho pH giảm Khi pH giảm xảy tượng cộng hưởng màu sắc Eosine Methylene Blue kết hợp làm nên ánh kim tím Câu 3: Nêu sở sinh hóa thử nghiệm khẳng định E Coli Các thử nghiệm sinh hóa dùng để khẳng định E.Coli sau:  (1): Thử nghiệm Indole: môi trường canh trypton, Indole kết hợp với pdimetylaminobezabdehyde tạo phức màu đỏ hồng cánh sen Indole dùng thuốc thử Kovac’s : (+): Vịng đỏ (-): Khơng đổi màu  (2): Thử nghiệm Methyl Red: có khả lên men đường glucose tạo acid môi trường làm cho pH môi trường giảm; môi trường đổi màu đỏ đậm (+), không đổi màu (-) Methyl Red dùng thuốc thử Methyl Red : (+):Đỏ (-):Vàng  (3): Thử nghiệm Voges – Proskauer: kiểm tra vi sinh vật có khả sinh acetoin Dùng thuốc thử: giọt - napthol 5% giọt KOH 40% : (+): Đỏ (-): Không đổi màu 24  (4): Thử nghiệm Citrate: kiểm tra xem vi sinh vật có khả sử dụng muối Citrate hay không, vi sinh vật có sử dụng sinh NH  pH tăng , môi trường chuyển sang màu xanh dương (+) (+): Xanh dương (-): Xanh STT Thử nghiệm sinh hóa Kết Indole + Methyl Red + Voges Proskauer - Citrate - Câu 4: Nêu quy trình định tính E Coli mẫu 25g mẫu + 225ml SPW  đồng 30 giây  độ pha loãng 10-1 Hút 1ml mẫu độ pha loãng 10 -1 cho vào ống nghiệm chứa 10ml môi trường BGBL Ủ nhiệt độ 44oC 24 Chọn ống BGBL đục có sinh cấy chuyển sang môi trường EMB Ủ nhiệt độ 37oC 24 Sau đó, lấy mơi trường ra, chọn khuẩn lạc có đặc trưng E.Coli EMB: trịn, dẹt, đường kính < 0,5 mm , có ánh kim tím Ủ nhiệt độ 37oC 24 Cấy vào môi trường: trypton, MR-VP, Simmons Citrate Ủ 37oC 24 Sử dụng loại thuốc thử để test thử nghiệm IMViC 25 Bài 7/43 Câu 1: Nguyên tắc định tính Samonella Quy trình phát Salmonella thực phẩm thực qua bước:  Tiền tăng sinh: cân lượng mẫu cho vào mơi trường BPW, sau ủ 370C 24  Tăng sinh chọn lọc: dịch mẫu sau tiền tăng sinh, cấy vào môi tường chọn lọc Rappaport Vassiliadis Soya broth  Phân lập: cấy vào loại môi trường phân lập XLD, BPLS, HE, BSA,…  Khẳng định: khuẩn lạc đặc trưng thử nghiệm thử nghiệm: TSI, LDC, Mannitol, Urea, Indol Voges Proskauer Câu 2: Đặc điểm khuẩn lạc Samonella môi trường XLD? Giải thích XLD (xylose lysine deoxychocolate) Đường xylose giúp VSV khơi phục lại khả (cho vào ít), cho vào VSV sử dụng nhanh, khoảng 4-6 Sau VSV chuyển sang xài lysine, xài lysine VSV tiết emzyme lysinedecarbonxylase tạo thành sản phẩm bazo làm pH mơi trường tăng Sau nhỏ chất thị Phenol red vào, Phenol red làm bazo chuyển sang màu đỏ/hồng Câu 3: Nêu sở sinh hóa thử nghiệm khẳng định Samonella Indole: môi trường chứa triptophan, VSV muốn phân hủy triptophan phải sinh enzyme triptophanase để phân hủy triptophan, phân giải triptophan tạo sản phẩm acid indolepyruvic Sau khử amin tạo thành sản phẩm indole (không màu) acid pyruvic Nhỏ thuốc thử Kovac’s vào có vịng đỏ dương tính, khơng đổi màu âm tính 26 Methyl red:cho thuốc thử Methyl red vào môi trường MR-VP (màu vàng), thấy chuyển sang màu chuyển sang màu đỏ dương tính, màu vàng âm tính VP: từ đường glucose, VSV phân hủy tạo thành acid pyruvic, acid pyruvic chuyển hóa thành 2,3-butanediol; 2,3-butanediol chuyển hóa thành acetoin, sau nhỏ thuốc thử α-napthol 5% mơi trường KOH 40% với tỷ lệ 1:3, sau nhỏ xuất màu đỏ dương tính, khơng đổi màu âm tính Citrate: mơi trường citrate chứa ammonium bromothymol blue, VSV sử dụng citrate để lấy nguồn C chúng bắt buộc phải sử dụng muối ammonium để lấy N, sinh sản phẩm phụ NH3 làm PH môi trường tăng, chất bromothymol blue PH tăng chuyển từ màu xanh sang xanh dương Câu 4: Nêu quy trình định tính Samonella mẫu Cân 25g mẫu + 225ml SPW, sau đồng 30 giây, độ pha lỗng 10-1 Ủ 370C 24 Hút 0,1 ml mẫu sau tăng sinh cho vào ống nghiệm chứa 10ml môi trường RVS Ủ nhiệt độ 420C 24 Cấy chuyển sang môi trường XLD, ủ 370C 24 Khuẩn lạc đặc trưng Salmonella mơi tường XLD: trịn, lồi, suốt, có tâm đen, môi trường xung quanh khuẩn lạc chuyển sang màu đỏ Cấy vào mơi trường thử nghiệm sinh hóa: TSI, LDC, Mannitol phenol red, Urea, anh trypton, MR-VP Nếu thử nghiệm sinh hóa tương ứng với kêt + + + + - - có Salmonella, cịn sai thử nghiệm khơng có Salmonella 27 ... bảo quản, vi sinh vật độc tố chúng tăng nhanh đến mức gây ngộ độc 1.2 MỘT SỐ VI SINH VẬT GÂY BỆNH CÓ TRONG NƯỚC VÀ THỰC PHẨM 1.2.1 Tổng vi sinh vật hiếu (TPC) - Vi sinh vật hiếu khí vi sinh vật... bệnh đường ruột vi sinh vật diện nước thực phẩm gây nên Ngộ độc thực phẩm biểu triệu chứng vi sinh vật diện thực phẩm hay nước uống mà sử dụng ngày gây Nhiễm bệnh vi sinh vật thực phẩm trường... gây ô nhiễm thực phẩm: Vi khuẩn: Vi khuẩn mối nguy hay gặp mối nguy gây ô nhiễm thực phẩm Theo thống kê 50-60% vụ ngộ độc thực phẩm Vi? ??t Nam vi khuẩn gây Vi khuẩn có khắp nơi, đặc biệt phân, nước