Bài thực tập tốt nghiệp Tìm hiểu tính chất methyl hóa trên vùng promoter thuộc gen DAPK và gen RARB ở bệnh nhân Việt Nam với yếu tố nhiễm HPV

Ung thư cổ tử cung (cervical cancer) là bệnh ung thư đứng hàng thứ tư trong nhóm ung thư gây tử vong cao nhất ở phụ nữ trên thế giới. Theo báo cáo của tổ chức Y tế Thế giới (WHO, 2012), hàng năm có khoảng 528.000 trường hợp mới mắc bệnh ung thư cổ tử cung và có khoảng 266.000 trường hợp ung thư cổ tử cung bị tử vong. Ở Việt Nam, hàng năm có khoảng 5.146 trường hợp ung thư cổ tử cung mới được phát hiện81. Theo WHO, tỷ lệ chữa khỏi bệnh ung thư cổ tử cung tăng cao nếu các trường hợp mắc bệnh được phát hiện sớm và có phác đồ điều trị thích hợp. HPV (Human Papillomavirus) thuộc họ Papillomaviridae77, có hơn 100 type HPV. Nhóm HPV nguy cơ cao là nguyên nhân gây bệnh ung thư cổ tử cung, gồm có các type: 16, 18, 31, 33, 35,... Nhóm HPV nguy cơ thấp là nguyên nhân dẫn đến bệnh lý sùi mào gà (Condyloma Acuminata) gồm các type: 6, 11, 42, 43, 44. Đáng lưu ý, HPV type 16 và HPV type 18 là yếu tố nguy cơ cao dẫn đến khoảng 70% các trường hợp ung thư cổ tử cung trên toàn thế giới14167696. Bên cạnh đó, một số yếu tố nguy cơ khác dẫn đến sự hình thành và diễn tiến của ung thư cổ tử cung như sự biến đổi epigenetics trong bộ gen, sử dụng thuốc tránh thai, hút thuốc lá,…16.Một số công trình nghiên cứu xác định tính chất methyl hóa trên đảo CpG thuộc vùng promoter gen ức chế khối u (tumor suppressor gene) liên quan đến quá trình sinh ung526991. Tính chất methyl hóa vượt mức (hypermethylation) DNA ở nhóm gen nêu trên được xem là dấu chứng sinh học (biomarker) trong tiên lượng, chẩn đoán sớm nhiều bệnh ung thư, trong đó có bệnh ung thư cổ tử cung41. Sự methyl hóa liên quan đến việc hình thành khối u ở ung thư cổ tử cung đã được phát hiện trên nhiều gen, ví dụ như DAPK, RARB, p16,…91.Gene DAPK (Deathassociated protein kinase) nằm trên nhiễm sắc thể 9q21. Protein DAPK là nhân tố điều hòa dương cho cơ chế chết theo chương trình của tế bào (apoptosis)100. Ở trạng thái bình thường, DAPK ức chế khối u, tuy nhiên trong trường hợp đảo CpG trên vùng promoter bị methyl hóa thì hoạt động của DAPK bị ức chế dẫn đến ung thư cổ tử cung5991.Gene RARB (Retinoic Acid Receptor Beta) nằm trên nhiễm sắc thể mã hóa cho thụ thể Retinoic acid beta. Protein RARB thuộc siêu họ thụ thể hormon thyroid steroid điều hòa quá trình phiên mã, tham gia vào đường truyền tín hiệu trung gian nội bào trong quá trình hình thành phôi, sự phát triển và biệt hóa tế bào101. Ở trạng thái bình thường, RARB ức chế khối u8, tuy nhiên trong trường hợp đảo CpG trên vùng promoter bị methyl hóa vượt mức thì hoạt động của RARB bị ức chế dẫn đến ung thư cổ tử cung5974.Do vậy, chúng tôi thực hiện đề tài tốt nghiệp: “Tìm hiểu tính chất methyl hóa trên vùng promoter thuộc gen DAPK và gen RARB ở bệnh nhân Việt Nam với yếu tố nhiễm HPV”.Mục tiêu: Xác định tính chất methyl hóa DNA trên vùng promoter thuộc gen DAPK và gen RARB liên quan đến bệnh ung thư cổ tử cung ở Việt Nam, dựa trên bộ mẫu có tính chất nhiễm HPV type nguy cơ caonguy cơ thấp hoặc không nhiễm HPV (mẫu lành).Nội dung nghiên cứu:Khảo sát dữ liệu: Thu thập bộ dữ liệu về tính chất methyl hóa gen DAPK và gen RARB liên quan đến bệnh ung thư cổ tử cung, tập trung xác định tần số methyl hóa bất thường (hypermethylation) trên đảo CpG thuộc vùng promoter các gen DAPK, RARB. Xác định phương pháp sinh học phân tử (MSP, NestedMSP) phù hợp nhằm khảo sát tính chất methyl hóa trên các gen DAPK, RARB.Khảo sát in silico: Thu thập trình tự các gen DAPK, RARB và các đảo CpG trên vùng promoter thuộc các gen DAPK, RARB. Thu thập và khảo sát bộ mồi methyl và unmethyl phù hợp với sinh học phân tử (MSP, NestedMSP) phù hợp nhằm khảo sát tính chất methyl hóa trên các gen DAPK, RARB trên bộ mẫu có tính chất không nhiễm HPV (mẫu lành)nhiễm HPV type nguy cơ thấp hoặc nguy cơ cao.

Báo cáo Thực tập tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến người thầy, người cô khoa Công nghệ sinh học, trường Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh tận tình tâm huyết truyền đạt kiến thức tảng ngành học cho em suốt năm qua Những kiến thức thầy cô truyền đạt thật cần thiết quan trọng giúp em có sở để viết lên Thực tập tốt nghiệp Tiếp theo, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Lê Huyền Ái Thúy cô Trương Kim Phượng bảo tận tình tạo điều kiện tốt cho em hoàn thành đề tài tốt nghiệp Em trân trọng biết ơn điều Cảm ơn người bạn lớp, phòng bạn nhóm thí nghiệm bên động viên, chia sẻ giúp đỡ lúc khó khăn Cuối cùng, điều thiếu sót, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình sinh ra, nuôi dưỡng đem đến cho điều tốt đẹp sống Con biết ơn nhiều ba mẹ tạo cho điều kiện tốt để yên tâm học hành suốt năm qua Em xin gửi lời chúc sức khỏe đến thầy cô khoa Công nghệ sinh học, kính mong thầy cô có thật nhiều sức khỏe, đồng hành sinh viên thân yêu nghiệp giáo dục đất nước Tôi xin chúc người bạn hoàn thành xuất sắc đề tài thực tập tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn! Bình Dương, ngày 01/2016 Sinh viên thực tập Trần Thị Thùy Trinh SVTH: Trần Thị Thùy Trinh Báo cáo Thực tập tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT i DANH MỤC BẢNG iii DANH MỤC HÌNH iv ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN I: TỔNG QUAN I.1 Tổng quan ung thƣ I.1.1 Khái niệm ung thư I.1.2 Phân loại khối u I.1.3 Tình hình ung thư giới 4_Toc440832480 I.1.4 Tình hình ung thư Việt Nam I.2 Ung thƣ cổ tử cung .6 I.2.1 Các giai đoạn ung thư cổ tử cung I.2.2 Phân loại ung thư cổ tử cung .7 I.2.3 Yếu tố nguy dẫn đến ung thư cổ tử cung I.2.4 Tình hình ung thư cổ tử cung giới I.2.5 Tình hình ung thư cổ tử cung Việt Nam 10_Toc440832489 I.3 Tổng quan HPV 11 I.3.1 Human papillomavirus (HPV) 11 I.3.2 Phân loại type HPV 12 I.3.3 Ung thư gây HPV 12 I.3.4 Cơ chế gây bệnh ung thư HPV 13 I.4 Epigenetics, methyl hóa DNA đảo CpG 14 I.4.1 Epigenetics 14 SVTH: Trần Thị Thùy Trinh Báo cáo Thực tập tốt nghiệp I.4.2 Sự methyl hóa DNA 15 I.4.3 Đảo CpG 16 I.5 Gen DAPK (Death-Associated Protein Kinase) .16 I.5.1 Vị trí, cấu trúc 16 I.5.2 Chức 17 I.5.3 Sự methyl hóa gen DAPK 18 I.6 Gen RARB (Retinoic Acid Receptor Beta) .19 I.6.1 Vị trí, cấu trúc 19 I.6.2 Chức 20 I.6.3 Sự methyl hóa gen RARB 21 I.7 Phƣơng pháp xác định trạng thái methyl hóa DNA 22 I.7.1 Phương pháp MSP (Methylation – specific PCR) .22 I.7.2 Phương pháp Nested-MSP 24 PHẦN II: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 II.1 Phƣơng pháp nghiên cứu .25 II.1.1 Khảo sát liệu 25 II.1.2 Khảo sát in silico 25 PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 27 III.1 Kết khai thác liệu .27 III.1.1 Gen DAPK (Death – Associated Protein Kianase) 27 III.1.2 Gen RARB (Retinoic Acid Receptor Beta) 33 III.2 Kết khảo sát in silico .39 III.2.1 Gen DAPK (Death – Associated Protein Kianase) 39 III.2.2 Gen RARB (Retinoic Acid Receptor Beta) 45 SVTH: Trần Thị Thùy Trinh Báo cáo Thực tập tốt nghiệp PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51 IV.1 Kết luận 51 IV.2 Đề nghị 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 PHỤ LỤC PL1 SVTH: Trần Thị Thùy Trinh Báo cáo Thực tập tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Bp Base pairs CIS Carcinomar in situ CIN Cervical intraepithelial neoplasia CpG Cytosine phosphodiester guanine DAPK Death-Associated Protein Kinase DNA Deoxyribonucleotic acid HPV Human papillomavirus IARC International Agency for Research on Cancer IDT Integrated DNA Technologies kD KiloDalton MF Methylated forward MR Methylated reverse MS-MLPA Methylation specific multiplex ligation-dependent probe amplification MSP Methylation specific PCR NCBI National Center for Biotechnology Information NSCLC Non-small cell lung carcinoma NST Nhiễm sắc thể PCR Polymeration chain reaction QMSP Quantitative MSP RARB Retinoic Acid Receptor Beta RNA Ribonucleic acid SCC Squamous cell carcinomar SVTH: Trần Thị Thùy Trinh Trang i Báo cáo Thực tập tốt nghiệp SIL Squamous intraepithelial lesion STT Số thứ tự TP.HCM Thành phố Hồ Chí Minh Tm Temperature melt UF Unmethylated forward UR Unmethylated reverse UTCTC Ung thƣ cổ tử cung WHO World Health Organization SVTH: Trần Thị Thùy Trinh Trang ii Báo cáo Thực tập tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Bộ liệu tài liệu gen DAPK Bảng 3.2: Tần suất methyl hóa gen DAPK loại ung thƣ Bảng 3.3: Bộ liệu tài liệu gen RARB Bảng 3.4: Tần suất methyl hóa gen RARB loại ung thƣ Bảng 3.5: Trình tự mồi methyl unmethyl gen DAPK Bảng 3.6: Khảo sát thông số vật lý mồi methyl unmethyl gen DAPK Bảng 3.7: Trình tự mồi methyl unmethyl gen RARB Bảng 3.8: Khảo sát thông số vật lý mồi methyl unmethyl gen RARB SVTH: Trần Thị Thùy Trinh Trang iii Báo cáo Thực tập tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Sự phân chia tế bào bình thƣờng tế bào ung thƣ Hình 1.2: Dự đoán trƣờng hợp ung thƣ toàn cầu năm 2012 – 2035 Hình 1.3: Vị trí cổ tử cung cổ tử cung bị ung thƣ Hình 1.4: Tỷ lệ mắc tử vong ung thƣ tính 100.000 ngƣời/ năm giới (2012) Hình 1.5: Tỷ lệ mắc tử vong ung thƣ tính 100.000 ngƣời/ năm Việt Nam (2012) Hình 1.6: Một số bệnh ung thƣ gây HPV Hình 1.7: Sự methyl hóa bất thƣờng ung thƣ Hình 1.8: Vị trí gen DAPK NST số Hình 1.9: Gen DAPK đƣờng apoptosis Hình 1.10: Vị trí gen RARB NST số Hình 1.11: Một đƣờng phân tử ức chế tăng sinh tế bào đƣợc kích hoạt RARB Hình 1.12: Một chế chuyển đổi nucleotide từ Cytosine thành Uracil với sodium bisulfite Hình 1.13: Sự biến đổi DNA gốc sodium bisulfite Hình 1.14: Bộ mồi cho phƣơng pháp methylation-specific PCR Hình 1.15: Sơ đồ phƣơng pháp Nested–MSP Hình 3.1: Đồ thị mô tả phƣơng pháp sinh học phân tử đƣợc sử dụng để khảo sát tính chất methyl hóa vùng promoter gen DAPK Hình 3.2: Đồ thị mô tả loại mẫu đƣợc sử dụng công trình nghiên cứu khảo sát tính chất methyl hóa vùng promoter gen DAPK SVTH: Trần Thị Thùy Trinh Trang iv Báo cáo Thực tập tốt nghiệp Hình 3.3: Đồ thị khảo sát loại ung thƣ liên quan đến tính chất methyl hóa vùng promoter gen DAPK Hình 3.4: Đồ thị mô tả phƣơng pháp sinh học phân tử đƣợc sử dụng để khảo sát tính chất methyl hóa vùng promoter gen RARB Hình 3.5: Đồ thị khảo sát loại ung thƣ liên quan đến tính chất methyl hóa vùng promoter gen RARB Hình 3.6: Định vị gen DAPK NST số Hình 3.7: Định vị đảo CpG vùng promoter gen DAPK (Methprimer) Hình 3.8: Kết Annhyb cặp mồi xuôi mồi ngƣợc methyl trình tự vùng promoter gen DAPK Hình 3.9: Kết Annhyb cặp mồi xuôi mồi ngƣợc unmethyl trình tự vùng promoter gen DAPK Hình 3.10: Cấu trúc đảo CpG vùng promoter gen DAPK, vị trí nhận biết nhân tố phiên mã đảo CpG vị trí bắt cặp mồi gen DAPK Hình 3.11: Định vị gen RARB NST số Hình 3.12: Định vị đảo CpG vùng promoter gen RARB (Methprimer) Hình 3.13: Kết Annhyb cặp mồi xuôi mồi ngƣợc methyl trình tự vùng promoter gen RARB Hình 3.14: Kết Annhyb cặp mồi xuôi mồi ngƣợc unmethyl trình tự vùng promoter gen RARB Hình 3.15: Cấu trúc đảo CpG vùng promoter gen RARB, vị trí nhận biết nhân tố phiên mã đảo CpG vị trí bắt cặp mồi gen RARB SVTH: Trần Thị Thùy Trinh Trang v Báo cáo Thực tập tốt nghiệp ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thƣ cổ tử cung (cervical cancer) bệnh ung thƣ đứng hàng thứ tƣ nhóm ung thƣ gây tử vong cao phụ nữ giới Theo báo cáo tổ chức Y tế Thế giới (WHO, 2012), hàng năm có khoảng 528.000 trƣờng hợp mắc bệnh ung thƣ cổ tử cung có khoảng 266.000 trƣờng hợp ung thƣ cổ tử cung bị tử vong Ở Việt Nam, hàng năm có khoảng 5.146 trƣờng hợp ung thƣ cổ tử cung đƣợc phát hiện[81] Theo WHO, tỷ lệ chữa khỏi bệnh ung thƣ cổ tử cung tăng cao trƣờng hợp mắc bệnh đƣợc phát sớm có phác đồ điều trị thích hợp HPV (Human Papillomavirus) thuộc họ Papillomaviridae[77], có 100 type HPV Nhóm HPV nguy cao nguyên nhân gây bệnh ung thƣ cổ tử cung, gồm có type: 16, 18, 31, 33, 35, Nhóm HPV nguy thấp nguyên nhân dẫn đến bệnh lý sùi mào gà (Condyloma Acuminata) gồm type: 6, 11, 42, 43, 44 Đáng lƣu ý, HPV type 16 HPV type 18 yếu tố nguy cao dẫn đến khoảng 70% trƣờng hợp ung thƣ cổ tử cung toàn giới[14][16][76][96] Bên cạnh đó, số yếu tố nguy khác dẫn đến hình thành diễn tiến ung thƣ cổ tử cung nhƣ biến đổi epigenetics gen, sử dụng thuốc tránh thai, hút thuốc lá,…[16] Một số công trình nghiên cứu xác định tính chất methyl hóa đảo CpG thuộc vùng promoter gen ức chế khối u (tumor suppressor gene) liên quan đến trình sinh ung[52[69][91] Tính chất methyl hóa vƣợt mức (hypermethylation) DNA nhóm gen nêu đƣợc xem dấu chứng sinh học (biomarker) tiên lƣợng, chẩn đoán sớm nhiều bệnh ung thƣ, có bệnh ung thƣ cổ tử cung[41 Sự methyl hóa liên quan đến việc hình thành khối u ung thƣ cổ tử cung đƣợc phát nhiều gen, ví dụ nhƣ DAPK, RARB, p16,…[91] Gene DAPK (Death-associated protein kinase) nằm nhiễm sắc thể 9q21 Protein DAPK nhân tố điều hòa dƣơng cho chế chết theo chƣơng trình tế bào (apoptosis)[100] Ở trạng thái bình thƣờng, DAPK ức chế khối u, nhiên trƣờng hợp đảo CpG vùng promoter bị methyl hóa hoạt động DAPK bị ức chế dẫn đến ung thƣ cổ tử cung[59][91] SVTH: Trần Thị Thùy Trinh Trang Báo cáo Thực tập tốt nghiệp 64 Peng Z., Shan C., Wang H (2010), Value of promoter methylation of RASSF1A, p16, and DAPK genes in induced sputum in diagnosing lung cancers, Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban, 35(3), pp 247-253 65 Pierini S., Jordanov S H., Mitkova A V., Chalakov I J., Melnicharov M B., Kunev K V., Mitev V I., Kaneva R P., Goranova T E (2014), Promoter hypermethylation of CDKN2A, MGMT, MLH1, and DAPK genes in laryngeal squamous cell carcinoma and their associations with clinical profiles of the patients, Head Neck, 36(8), pp 1103-1108 66 Pirouzpanah S., Taleban F A., Mehdipour P., Atri M (2015), Association of folate and other one-carbon related nutrients with hypermethylation status and expression of RARB, BRCA1, and RASSF1A genes in breast cancer patients, Journal of Molecular Medicine, 93(8), pp 917-934 67 Raveh T and Kimchi A (2001), DAP Kinase—A Proapoptotic Gene That Functions as a Tumor Suppressor, Experimental Cell Research 264, pp 185–192 68 Schiffman M., Castle P E., Jeronimo J., Rodriguez A C and Wacholder S (2007), Human papillomavirus and cervical cancer, Lancet 370, pp 890– 907 69 Sharma S., Kelly T K., Jones P A (2009), Epigenetics in cancer, Carcinogenesis, 31(1), pp 27–36 70 Stamatelli A., Vlachou C., Aroni K., Papassideri I., Patsouris E., Saetta A A (2014), Epigenetic alterations in sporadic basal cell carcinomas, Archives of Dermatological Research, 306(6), pp 561-569 71 Sugita H., Iida S., Inokuchi M., Kato K., Ishiguro M., Ishikawa T., Takagi Y., Enjoji M., Yamada H., Uetake H., Kojima K., Sugihara K (2011), Methylation of BNIP3 and DAPK indicates lower response to chemotherapy and poor prognosis in gastric cancer, Oncology Reports, 25(2), pp 513-518 72 Tahara T., Shibata T., Arisawa T., Nakamura M., Yamashita H., Yoshioka D., Okubo M., Yonemura J., Maeda Y., Maruyama N., Kamano T., Kamiya SVTH: Trần Thị Thùy Trinh Trang 61 Báo cáo Thực tập tốt nghiệp Y., Fujita H., Nakagawa Y., Nagasaka M., Iwata M., Hirata I (2010), CpG island promoter methylation (CIHM) status of tumor suppressor genes correlates with morphological appearances of gastric cancer, Anticancer Research, 30(1), pp 239-244 73 Tang X., Khuri F R., Lee J J., Kemp B L., Liu D., Hong W K., Mao L (2000), Hypermethylation of the Death-Associated Protein (DAP) Kinase Promoter and Aggressiveness in Stage I Non-Small-Cell Lung Cancer, Journal of the National Cancer Institute, 92(18) 74 Thuan L D., Phuong T K., Thai Q A., Sharma N., Thuy L H A (2013), DNA Methylation at the RARB promoter: A Potential Biomarker for Cervical Cancer, Current Trends in Biotechnology and Pharmacy, 7(3), pp 708715 75 Twelves D., Nerurkar A., Osin P., Dexter T., Ward A., Gui G P., Isacke C M (2013), DNA promoter hypermethylation profiles in breast duct fluid, Breast Cancer Research and Treatment, 139(2), pp 341-350 76 Villa L L., Denny L (2006), Methods for detection of HPV infection and its clinical utility, International Journal of Gynecology and Obstetrics 94 (Supplement 1), S71-S80 77 Villiers E M., Fauquet C., Broker T R., Bernard H U and Hausen H (2004), Classification of papillomaviruses, Virology 324, pp 17 – 27 78 Vinci S., Giannarini G., Selli C., Kuncova J., Villari D., Valent F., Orlando C (2011), Quantitative methylation analysis of BCL2, hTERT, and DAPK promoters in urine sediment for the detection of non-muscle-invasive urothelial carcinoma of the bladder: a prospective, two-center validation study, Urologic Oncology, 29(2), pp 150-156 79 Virmani A K., Rathi A., Zochbauer-Muller S., Sacchi N., Fukuyama Y., Bryant D., Maitra A., Heda S., Fong K M., Thunnissen F., Minna J D., Gazdar A F (2000), Promoter Methylation and Silencing of the Retinoic Acid Receptor- Gene in Lung Carcinomas, Journal of the National Cancer Institute 92, pp 1303–1307 SVTH: Trần Thị Thùy Trinh Trang 62 Báo cáo Thực tập tốt nghiệp 80 Walboomers J M M., Jacobs M V., Manos M M., Bosch F X., Kummer J A., Shah K V., Snijders P J F., Peto J., Meijer C L M and Mun˜ oz N (1999), Human Papillomavirus Is A Necessary Cause Of Invasive Cervical Cancer Worldwide, Journal of pathology 189, pp 12–19 81 WHO/ICO Information Centre on HPV and Cervical Cancer (HPV Information Centre), Human Papillomavirus and Related Diseases in Viet Nam, Summary Report (2014) 82 Widschwendter M., Berger J., Hermann M., Müller H M., Amberger A., Zeschnigk M., Widschwendter A., Abendstein B., Zeimet A G., Daxenbichler G., Marth C (2000), Methylation and silencing of the retinoic acid receptor-beta2 gene in breast cancer, Journal of the National Cancer Institute, 92(10), pp 826-832 83 Winkelstein W (1977), Smoking and cancer of the uterine cervix: hypothesis, American Journal of Epidemiology, 106(4), pp 257 – 259 84 Wisman G B A., Nijhuis E R., Hoque M O., Peters N R , Koning A J., Volders H H., Buikema H J., Boezen H M., Hollema H., Schuuring E., Sidransky D and Zee A G J (2006), Assessment of gene promoter hypermethylation for detection of cervical neoplasia, International Journal Cancer 119, pp 1908–1914 85 Xiong J., Li Y., Huang K., Lu M., Shi H., Ma L., Luo A., Yang S., Lu Z., Zhang J., Yang L., Wang S (2014), Association between DAPK1 promoter methylation and cervical cancer: a meta-analysis, PLoS One, 9(9) 86 Xu X C (2006), Tumor-suppressive activity of retinoic acid receptor- b in cancer, Cancer Letters 253, pp 14–24 87 Yamamoto H., Min Y., Itoh F., Imsumran A., Horiuchi S., Yoshida M., Iku S., Fukushima H., Imai K (2002), Differential involvement of the hypermethylator phenotype in hereditary and sporadic colorectal cancers with high-frequency microsatellite instability, Genes Chromosomes Cancer, 33(3), pp 322-325 SVTH: Trần Thị Thùy Trinh Trang 63 Báo cáo Thực tập tốt nghiệp 88 Yang M and Park J Y (2012), DNA Methylation in Promoter Region as Biomarkers in Prostate Cancer, Cancer Epigenetics: Methods and Protocols 863, pp 69 89 Zhang C Y., Jin Y T., Xu H Y., Zhang H., Zhang W M., Sun X Y., Tan C., Chen C M (2011), Relationship between promoter methylation of p16, DAPK and RAR beta genes and the clinical data of non-small cell lung cancer, Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi, 28(1), pp 23-28 90 Zhang Y., Wang R., Song H., Huang G., Yi J., Zheng Y., Wang J., Chen L (2011), Methylation of multiple genes as a candidate biomarker in nonsmall cell lung cancer, Cancer Letters, 303(1), pp 21-28 91 Zhao X L., Meng Z Y., Qiao Y H and Zhang H L (2008), Promoter methylation of DAPK gene in cervical carcinoma, Chinese Journal of Cancer, 27(9), pp 212-215 Internet 92 http://atlasgeneticsoncology.org/Genes/DAPK1ID417ch9q21.html, The Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology 93 http://benhvienungbuouhungviet.vn/tim-hieu-benh-ung-thu/ung-thu-co-tucung/trieu-chung-ung-thu-co-tu-cung.aspx, Bệnh viên ung bƣớu Hƣng Việt 94 http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_cancer.aspx, Globocan 95 http://india.columbiaasia.com/health-articles/cervical-cancer-signs-symptomsstages-treatment, Columbia Asia 96 http://tudu.com.vn/vn/y-hoc-thuong-thuc/suc-khoe-phu-nu/benh-phu-khoa/ungthu-co-tu-cung-can-benh-nguy-hiem-nhung-co-the-phong-ngua/, Bệnh viện Từ Dũ 97 http://tuoitrenews.vn/society/8725/death-rate-in-vn-cancer-patients-amongworlds-highest, The news gateway of Vietnam 98 http://ungbuouvietnam.com/thong-tin/ung-thu-co-tu-cung/, Bệnh viện đa khoa quốc tế Thu Cúc SVTH: Trần Thị Thùy Trinh Trang 64 Báo cáo Thực tập tốt nghiệp 99 http://www.cancer.org/cancer/cervicalcancer/detailedguide/cervical-cancerwhat-is-cervical-cancer, American Cancer Society 100 http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=DAPK1&keywords=dapk, GeneCards Human gene database 101 http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=RARB&keywords=rarb, GeneCards Human gene database 102 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1612, National Center for Biotechnology Information 103 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/5915, National Center for Biotechnology Information 104 http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en/, World health Organization 105 https://www.aacrfoundation.org/Pages/what-is-cancer.aspx, American Association for Cancer Reseach (AACR) 106 http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer_results.cgi, MethPrimer 107 http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer_results.cgi, MethPrimer SVTH: Trần Thị Thùy Trinh Trang 65 Báo cáo Thực tập tốt nghiệp SVTH: Trần Thị Thùy Trinh Trang 66 Báo cáo Thực tập tốt nghiệp PHỤ LỤC Phụ lục 1: Sử dụng phần mềm MethPrimer cho vùng promoter gen DAPK Phụ lục 2: Sử dụng phần mềm MethPrimer cho vùng promoter gen RARB SVTH: Trần Thị Thùy Trinh PL1 Báo cáo Thực tập tốt nghiệp Phụ lục 3: Kết Blast trình tự promoter gen DAPK NCBI SVTH: Trần Thị Thùy Trinh PL2 Báo cáo Thực tập tốt nghiệp SVTH: Trần Thị Thùy Trinh PL3 Báo cáo Thực tập tốt nghiệp Phụ lục 4: Kết Blast trình tự promoter gen RARB NCBI SVTH: Trần Thị Thùy Trinh PL4 Báo cáo Thực tập tốt nghiệp SVTH: Trần Thị Thùy Trinh PL5 Báo cáo Thực tập tốt nghiệp Phụ lục 5: Bảng công trình nghiên cứu methyl hóa DNA vùng promoter gen DAPK STT Tên Tổng Tần suất methyl hóa Loại ung thƣ mẫu (%) mẫu LEUC 102 36,0 Huyết Phƣơng pháp TLTK MSP 13 LEUC 95 13,0 Mô MSP BLC 42 64,3 Huyết MSP 38 BLC 80 77,0 Mô MSP 20 BLC 108 48,0 Mô QMSP 78 OVC 32 50,0 Mô MSP 31 OVC 32 56,0 Huyết MSP 31 CC 52 65,4 Mô MSP 91 CC 78 44,9 Mô MSP 40 10 CC 82 45,1 Mô MSP 59 11 CC 53 75,5 Mô MSP 10 12 CC 17 35,3 Mô MSP 38 13 CC 30 23,8 Huyết MSP 38 14 CC 30 63,3 Mô MSP 49 15 CUTC 35 14,0 Mô MSP 70 16 CUTC 20 15,0 Mô MSP 58 SVTH: Trần Thị Thùy Trinh PL6 Báo cáo Thực tập tốt nghiệp 17 GASC 69 47,8 Mô MSP 45 18 GASC 80 41,0 Mô MSP 71 19 GASC 146 87,0 Mô MSP 73 20 GASC 81 22,2 Mô MSP 42 21 COLC 80,0 Mô MSP 22 COLC 100 Mô MSP 23 COLC 43 27,6 Mô MSP 44 24 COLC 43 48,3 Mô MSP 44 25 OC 32 46,9 Mô QMSP 50 26 LC 23 22,0 Huyết MSP 26 27 LC 135 44,0 Mô MSP 73 28 LC 314 17,0 Mô Nested-MSP 30 29 LC 107 58,5 Mô MSP 64 30 LC 70 34,0 Huyết MSP 61 QMSP 35 31 LC 76 68,4 Huyết 32 LC 107 15,9 Mô MSP 48 33 KIDC 90 41,0 Mô MSP 21 34 KIDC 110 74,0 Mô QMSP 22 35 LARC 53 11,0 Mô MSP 50 SVTH: Trần Thị Thùy Trinh PL7 Báo cáo Thực tập tốt nghiệp Phụ lục 6: Bảng công trình nghiên cứu methyl hóa DNA vùng promoter gen RARB STT Phƣơng pháp TLTK Tên ung Tổng Tần suất methyl hóa Loại thƣ mẫu (%) mẫu BLC 96 38,7 Mô MS-MLPA 15 BLC 54 81,6 Mô MSP 46 OVC 134 31,0 Mô MSP 12 OVC 23 52,0 Mô MSP 12 OVC 26 69,0 Mô MSP 12 CC 37 41,0 Mô MSP 19 CC 47 18,0 Mô QMSP 84 CC 20 40,0 Mô MSP 37 CC 82 29,3 Mô MSP 59 10 CC 82 33,3 Mô MSP 59 11 CC 72 40,0 Mô MethyLight 27 12 COLC 40 58,0 Mô MSP 87 13 HNC 166 31,0 Mô MS-MLPA 63 14 HNC 28 39,0 Mô QMSP 17 15 EC 25 20,0 Mô MSP 36 16 LC 87 72,0 Mô MSP 79 17 LC 127 41,0 Mô MSP 79 18 LC 200 58,0 Mô MSP 89 19 LC 31 63,0 Mô MethyLight 28 SVTH: Trần Thị Thùy Trinh PL8 Báo cáo Thực tập tốt nghiệp 20 ESOC 22 73,0 Mô MSP 46 21 ESOC 47 55,0 Mô MSP 46 22 ESOC 47 38,0 Mô MSP 46 23 ESOC 140 55,0 Mô QMSP 36 24 BC 54 83,0 Mô MSP 75 25 BC 146 34,9 Mô MSP 66 26 BC 10 25,0 Mô MethyLight 18 27 BC 16 37,5 Mô MSP 82 SVTH: Trần Thị Thùy Trinh PL9 [...]... hợp đảo CpG trên vùng promoter bị methyl hóa vƣợt mức thì hoạt động của RARB bị ức chế dẫn đến ung thƣ cổ tử cung[59][74] Do vậy, chúng tôi thực hiện đề tài tốt nghiệp: Tìm hiểu tính chất methyl hóa trên vùng promoter thuộc gen DAPK và gen RARB ở bệnh nhân Việt Nam với yếu tố nhiễm HPV Mục tiêu: Xác định tính chất methyl hóa DNA trên vùng promoter thuộc gen DAPK và gen RARB liên quan đến bệnh ung thƣ... khảo sát tính chất methyl hóa trên các gen DAPK, RARB Khảo sát in silico:  Thu thập trình tự các gen DAPK, RARB và các đảo CpG trên vùng promoter thuộc các gen DAPK, RARB Thu thập và khảo sát bộ mồi methyl và unmethyl phù hợp với sinh học phân tử (MSP, Nested-MSP) phù hợp nhằm khảo sát tính chất methyl hóa trên các gen DAPK, RARB trên bộ mẫu có tính chất không nhiễm HPV (mẫu lành) /nhiễm HPV type nguy... thƣ cổ tử cung ở Việt Nam, dựa trên bộ mẫu có tính chất nhiễm HPV type nguy cơ cao/nguy cơ thấp hoặc không nhiễm HPV (mẫu lành) Nội dung nghiên cứu: Khảo sát dữ liệu:  Thu thập bộ dữ liệu về tính chất methyl hóa gen DAPK và gen RARB liên quan đến bệnh ung thƣ cổ tử cung, tập trung xác định tần số methyl hóa bất thƣờng (hypermethylation) trên đảo CpG thuộc vùng promoter các gen DAPK, RARB  Xác định... cung nói riêng trên nguồn dữ liệu NCBI, Google Xử lý số liệu xác định tần số methyl hóa gen DAPK và gen RARB II.1.2 Khảo sát in silico II.1.2.1 Thu thập trình tự gen DAPK và gen RARB Thu thập trình tự gen DAPK và gen RARB trên Ngân hàng dữ liệu NCBI (GenBank) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, National Center for Biotechnology Information) Thu thập trình tự vùng promoter gen DAPK và RARB trên nguồn dữ liệu... tập tốt nghiệp PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN III.1 Kết quả khai thác dữ liệu III.1.1 Gen DAPK (Death – Associated Protein Kianase) III.1.1.1 Bộ dữ liệu về tính chất methyl hóa vùng promoter trên gen DAPK III.1.1.1.1 Các công trình nghiên cứu trên các loại ung thư khác nhau liên quan đến tính chất methyl hóa vùng promoter trên gen DAPK Bằng cách khai thác nguồn cơ sở dữ liệu (PubMed) trên. .. Choi và cộng sự (2007) ghi nhận tính chất methyl hóa trên vùng promoter thuộc gen RARB Kết quả nghiên cứu xác định tần suất methyl hóa ở mẫu mô ung thƣ cổ tử cung và mẫu mô cổ tử cung bình thƣờng (mẫu lành) lần lƣợt là 41% (15/37 mẫu bệnh phẩm ung thƣ) và trạng thái methyl hóa vƣợt mức không đƣợc phát hiện ở mô bình thƣờng[19] Công trình nghiên cứu của Narayan và cộng sự (2007) ghi nhận tính chất methyl. .. nhóm methyl (CH3) từ S-adenosyl-methionine (SAM) đến vị trí C5 của phân tử Cytosine tạo thành dạng 5-methylcytosine (5mC)[54] Sự methyl hóa bất thƣờng gồm có methyl hóa vƣợt mức (hypermethylation) và giải methyl hóa (hypomethylation) Sự methyl hóa vƣợt mức tại vùng đảo CpG thuộc vùng promoter của gen ức chế khối u dẫn đến sự ―im lặng‖ của các gen này Ngƣợc lại, sự giải methyl hóa tại vùng đảo CpG thuộc. .. trình sinh lý và bệnh lý ở động vật có vú: biểu hiện gen, phát triển của phôi thai, tăng sinh tế bào, biệt hóa, in dấu bộ gen, bất hoạt nhiễm sắc thể X và ổn định nhiễm sắc thể[47][54] Sự methyl hóa DNA thƣờng xảy ra ở base Cytosine (C) đứng trƣớc base Guanosine (G) ở vùng điều hòa gen thuộc vùng promoter[ 4][47] Sự methyl hóa DNA đƣợc xúc tác bởi nhóm enzym DNA methyltransferase, là phản ứng hóa học chuyển... DAPK) và 31 công bố khoa học khảo sát tính chất methyl hóa vùng promoter trên gen DAPK ở các loại ung thƣ nói chung và UTCTC nói riêng Bảng 3.1: Bộ dữ liệu tài liệu khoa học về gen DAPK STT 1 Nội dung Số lƣợng bài báo Tổng quan gen DAPK 2 3 Tài liệu tham khảo [51][67][88] Nghiên cứu thực [5][13][38][20][78][31][91][40][59] nghiệm về tính [10][62][49][70][58][45][71][72][42] chất methyl hóa trên gen DAPK. .. Information), GeneCards (http://www.genecards.org/, GeneCards Human gene database) và các công trình nghiên cứu khoa học đã đƣợc công bố II.1.2.2 Xác định vị trí đảo CpG và vị trí nhận biết nhân tố phiên mã trên vùng promoter thuộc gen DAPK và gen RARB Công cụ tin sinh học đƣợc sử dụng: - Methprimer (http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi): Xác định vị trí các đảo CpG trên vùng promoter của gen