Bài thuyết trình về: "Alkali and Halotolerant Catalase from Halomonas sp. SK1: Overexpression in Escherichia coli, Purification, Characterization, and Genetic Modification"

Biểu hiện vượt mức catalase có khả năng chịu muối và chịu kiềm có nguồn gốc từ Halomonas trên vi khuẩn E.coli, tinh sạch, xác định đặc tính và biến đổi di truyềnMỤC TIÊU NGHIÊN CỨUTỪ KHÓATỔNG QUANIV. NỘI DUNG – KẾT QUẢBiểu hiện vượt mức catalase có khả năng chịu muối và chịu kiềm có nguồn gốc từ Halomonas trên vi khuẩn E.coli, tinh sạch, xác định đặc tính và biến đổi di truyềnTừ khóa Alkali and halotolerance CatalaseHalomonasOverexpressionEscherichia coli UM2Genetic modificationCatalaseBản chất hóa học: là enzyme chống oxi hóa trong hệ thống bảo vệ tế bào. 2H2O2 2 H2O + O2Catalases điển hình: 200 – 340 kDa.Có vai trò trong quá trình hô hấp đối với hầu hết sinh vật, có cấu trúc tứ phân với 4 tiền chất.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC   Môn học: Những vấn đề vi sinh đại Chủ đề: Alkali- and Halo-tolerant Catalase from Halomonas sp SK1: Overexpression in Escherichia coli, Purification, Characterization, and Genetic Modification Biosci Biotechnol Biochem 68(4): 814-9 (2004) Le Huyen Ai Thuy, Krisana Phucharoen, Akira Ideno, Tadashi Maruyama and Takao Shinozawa GVHD: PGS.TS Lê Huyền Ái Thúy Th.S Lao Đức Thuận Th.S Trương Kim Phượng I MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU II TỪ KHÓA III.TỔNG QUAN IV NỘI DUNG – KẾT QUẢ I MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Biểu vượt mức catalase có khả chịu muối chịu kiềm có nguồn gốc từ Halomonas vi khuẩn E.coli, tinh sạch, xác định đặc tính biến đổi di truyền II TỪ KHÓA − Alkali - and halo-tolerance Catalase − Halomonas − Overexpression − Escherichia coli UM2 − Genetic modification III TỔNG QUAN Catalase - Bản chất hóa học: enzyme chống oxi hóa hệ thống bảo vệ tế bào 2H2O2 Catalase H2O + O2 - Catalases điển hình: + 200 – 340 kDa + Có vai trò trình hô hấp hầu hết sinh vật, có cấu trúc tứ phân với tiền chất Halomonas sp SK1 − Trực khuẩn, Gram (-) − Thích nghi điều kiện hiếu khí tùy nghi − Có khả sinh trưởng điều kiện nồng độ muối cao kiềm cao − Có hoạt tính tổng hợp catalase điển hình Escherichia coli UM2 − Khuyết gen catalase đột biến gene katE gene katG − Gene katE gene katG mã hóa cho gene kháng ampicillin kanamycin Chaperone + Chuỗi polypeptide tương tác, thúc đẩy gấp cuộn protein + Phân loại chaperone dựa vào trọng lượng phân tử + Ngoài ra, chaperone có vai trò lắp ráp phân tử phức tạp, hỗ trợ protein tạo hình sai kết tụ tái gấp cuộn,… (Yujin E Kim,∗ Mark S Hipp,∗ Andreas Bracher, Manajit Hayer-Hartl, and F Ulrich Hartl 2013 Molecular Chaperone Functions in Protein Folding and Proteostasis Annual Review of Biochemistry 82:323–55.) Vật liệu a Gen mục tiêu b Dòng tế bào chứa gen mục tiêu c Dòng tế bào chủ d Hệ thống vectơ e Yếu tố thị a Gen mục tiêu oHktA (Original Alkali- and Halo-tolerant Catalase) - Có nguồn gốc từ vi khuẩn Halomonas sp SK1 Gen mã hóa cho catalase điển hình oHktA (57.8 kDa) - Đặc tính oHktA: nhạy với nhiệt, hoạt tính 37 C phút Kết tinh oHktA tái tổ hợp hệ thống tế bào E.coli UM2 Phân đoạn Protein tổng Hoạt tính tổng Hoạt tính riêng (mg) (U) (U/mg Năng suất (%) Tinh (Fold) protein) Chiết xuất thô DEAE– Toyapearl Chelating – Sephalose Fast Flow 146 63.0 x 10 27.3 60.9 x 10 7.3 58.9 x 10 4.30 x 10 2.23 x 10 8.07 x 10 4 100 1.0 96.7 5.2 93.5 18.8 => Phân đoạn qua cột Chelating – Sephalose Fast Flow cho độ tinh cao nhất, gấp 18 lần chiết xuất thô Kết phân tích hoạt tính catalase tái tổ hợp oHktA Native-PAGE A Nhuộm CBB (Coomassie Brilliant Blue) Giếng 1: Thang phân tử có trọng lượng cao Giếng 2: Chiết suất thô (30.0 μg protein/giếng) Giếng 3: Phần rửa giải với 10mM imidazole từ cột sắc ký Chelating-Sepharose Fast Flow (3.0 μg protein/giếng) B Nhuộm xác định hoạt tính catalase Giếng 1: Thang phân tử có trọng lượng cao, bao gồm catalase có nguồn gốc từ gan bò 232kDa (BLC) Giếng 2: Chiết suất thô (0.5 μg protein/giếng) Giếng 3: Phần rửa giải với 10mM imidazole từ cột sắc ký Chelating-Sepharose Fast Flow (0.06 μg protein/giếng) A B Hoạt tính catalase tái tổ hợp oHktA (So sánh với enzyme hoang dại HktA) Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính catalase oHktA tái tổ hợp Hoạt tính oHktA tái tổ hợp 15 mM dithionite (DT) Khoảng 90% 15 mM – amino – 1,2,4 – triazole (AT) Mất hoàn toàn 20 µM NaN3, 80 µM NH2OH 100 µM KCl Giảm 50% pH = 10.0 Tối ưu pH = 4.0 21% pH = 12.0 14% 4M KCl 74% 25 C Ổn định 0 37 C, 40 C 55 C phút Giảm đáng kể Biến đổi đặc tính di truyền để tạo catalase tái tổ hợp chịu nhiệt  Thiết lập plasmid pKK233-chktA Phản ứng PCR (hkt1 hkt3) khuếch đại gen C1 từ Phản ứng PCR (hkt4 hkt5) khuếch đại gen C2 từ Halomonas sp SK1 Thermus thermophilus Phản ứng cắt C1 Phản ứng cắt C2 EcoRI PStI PStI HindIII Tinh – Phản ứng nối tạo thành cHktA Phản ứng cắt cHktA pKK223-3 EcoRI HindIII Tinh – Phản ứng nối thành vector tái tổ hợp pKK223-chktA  Thiết lập plasmid pACPhFK -1 Phản ứng PCR PhFKBP29 từ Pyrococcus horikoshii + Phản ứng cắt sản phẩm PCR pET21a NedI HindII Phản ứng nối tạo thành vector pEPhFK-1 Phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen chứa pEPhFK-1* Cắt sản phẩm PCR plasmid pACYC184 SphI SalI Phản ứng nối tạo thành vector pACPhFK-1 Biến nạp vào tế bào E.coli UM2 mang vector pKK223-chktA Sàng lọc môi trường 2xYT, pH=7.4 bổ sung ampicillin (100 µg/ml) chloramphenicol (100 µg/ml) Kết gióng cột trình tự acid amin oHktA với cHktA, VktA (Vibrio rumoiensis S-1), HP II (E.coli), PVC (Penicillium janthinell) Kết phân tích tính chịu nhiệt cHktA oHktA - Từ 370C – 450C Tính chịu nhiệt cHktA tốt oHktA - Từ 40 – 600C  Hoạt tính cHktA bị ức chế - Hoạt tính riêng oHktA 3.25 x 104 cHktA 6.51 x 104 (U/mg protein) => cHktA ổn định nhiệt oHktA Phân tích cấu trúc không gian chiều pKK223-3 – oHktA phần mềm 3D-PSSM + Vùng domain đầu N- kéo dài đến β – barrel + Vùng β – barrel + Connection domain + Domain đầu C- kéo dài TÀI LIỆU THAM KHẢO Phucharoen, K., Hoshino, K., Takenaka, Y., and Shinozawa, T., Purification, characterization, and gene sequencing of a catalase from an alkali- and halo-tolerant bacterium, Halomonas sp SK1 Biosci Bio-technol Biochem., 66, 955–962 (2002) Ideno, A., Furutani, M., Iba, Y., Kurosawa, Y., and Maruyama, T., FK506 binding protein from the hyper-thermophilic archaeon Pyrococcus horikoshii suppresses the aggregation of proteins in Escherichia coli Appl.Environ Microbiol , 68, 464–469 (2002) Molecular Chaperone Functions in Protein Folding and Proteostasis.Yujin E Kim,∗ Mark S Hipp,∗ Andreas Bracher, Manajit Hayer-Hartl, and F Ulrich Hartl Annu Rev Biochem 2013 82:323–55 This second printing of the 10th edition of the pET Manual was published May, 2003 Please check the Novagen website, www.novagen.com The Bradford Method for Protein Quantitation Nicholas J Kruger The Protein Protocols Handbook, 2nd Edition • • • • • • • https://www.addgene.org/mol-bio-reference/plasmid-background/ https://www.addgene.org/vector-database/3332/ https://www.addgene.org/vector-database/1679/ https://www.addgene.org/browse/sequence_vdb/2549/ https://www.addgene.org/mol-bio-reference/sequencing-primers/ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/209037?report=fasta http://www.tandfonline.com/doi/pdf/10.1271/bbb.56.376 • • • http://richsingiser.com/4402/Novagen%20pET%20system%20manual.pdf http://wolfson.huji.ac.il/expression/novagen_ProkExp.pdf http://www.yrbio.com/bioresource/sites/yrbio.com.bioresource/files/document/vector/2 26410/c183-001.pdf • • http://www.csun.edu/~hcbio027/biotechnology/lec4a/petsys.html http://www.bio.davidson.edu/Courses/Molbio/MolStudents/spring2003/Causey/pET.htm l • cgsc.biology.yale.edu/Strain.php?ID=28092 CẢM ƠN THẦY CÔ VÀ CÁC BẠN ĐÃ LẮNG NGHE