Bài thuyết trình Phát hiện nhanh chóng và chuyên biệt cho loài mới Xanthomonas oryzae pv. oryzae K3a bằng phương pháp PCR dựa vào Marker có nguồn gốc từ phương pháp AFLP.

Phát hiện nhanh chóng và chuyên biệt cho loài mới Xanthomonas oryzae pv. oryzae K3a bằng phương pháp PCR dựa vào Marker có nguồn gốc từ phương pháp AFLP. 1. Bệnh cháy bìa lá lúa (bacterial blight of rice) 2. Vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) 3. Phương pháp PCR 4. Phương pháp AFLP Sử dụng 119 chủng vi khuẩn Xanthomonas trong nghiên cứu. a. Nuôi cấy vi khuẩn b. Xây dựng marker nhận biết chuyên biệt cho loài Xoo K3a nhờ phương pháp AFLP

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC   • Mơn học: Vi sinh nơng nghiệp • Chủ đề: PCR-Based Assay for Rapid and Specific Detection of the New Xanthomonas oryzae pv oryzae K3a Race Using an AFLP-Derived Marker J Microbiol Biotechnol (2014),24(6), 732–739 Eun-Sung Song, Song-Yi Kim, Tae-Hwan Noh, Heejung Cho, Soo-Cheon Chae, and Byoung-Moo Lee GVHD: Th.S Trương Kim Phượng I MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU II TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU III.NỘI DUNG NGHIÊN CỨU IV KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU I MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU • Phát nhanh chóng chuyên biệt cho loài Xanthomonas oryzae pv oryzae K3a phương pháp PCR dựa vào Marker có nguồn gốc từ phương pháp AFLP II TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.Bệnh cháy bìa lúa (bacterial blight of rice) - Bệnh nghiêm trọng lúa nước châu Á, gây thiệt hại cao đến 50% đồng ruộng bị nhiễm bệnh nghiêm trọng - Bệnh vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo) gây - Cách thức lây truyền: xâm nhập thông qua lỗ thủy khổng vết thương (Mew TW, Alvarez AM, Leach JE, Swing J 1993 Focus on bacterial blight of rice Plant Dis 77:5-12) • Triệu chứng: Phiến có đường kẻ dài khơng đều, có vết có màu vàng khơ chạy dọc theo hai bìa (Agrios, 2005), rìa bị quăn queo lan khắp (Shamar, 2006) Hình 1: Biểu bệnh cháy bìa lúa 2 Vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo) - Vi khuẩn Gram (–), hình que ngắn, đầu trịn, có - Có vỏ giáp mơ bao bọc (capsule) bảo vệ nước - Nhiệt độ thích nghi vi khuẩn từ 26-30°C - Nguồn lây nhiễm: Nước kênh rạch, nước ruộng, gốc rạ rễ lúa 3 Phương pháp PCR (Polymerase chain reaction) Hình 2: Minh họa phương pháp PCR Phương pháp AFLP ( Amplified Fragment Length Polymorphisms) - Là đa dạng đoạn DNA nhân lên có định hướng sau bị cắt enzyme giới hạn, sử dụng phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch đại PCR - Hình 3: Quy trình thực AFLP Bước 1: Phản ứng cắt Bước 2: Phản ứng nối Bước 3: Tiền khuếch đại Bước 4: Khuếch đại chọn lọc III NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Vật liệu - Sử dụng 119 chủng vi khuẩn Xanthomonas nghiên cứu - Nguồn vật liệu: Korean Agricultural Culture Collection (KACC, Hàn Quốc), the Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries (MAFF, Nhật Bản), Belgian Coordinated Collections of Micro-organisms (BCCM, Bỉ) Tiến sĩ T H Noh National Institute of Crop Science (RDA, Hàn Quốc) 2 Phương pháp a Nuôi cấy vi khuẩn - Chủng Xanthomonas nuôi cấy môi trường YDC (2% D-glucose, 2% CaCO3, 1% chiết xuất nấm men, 1,5% agar) 28°C/ 48 - Các dòng Escherichia coli tăng trưởng 37°C/24 h mơi trường Luria-bertani (LB) có chứa 200μg/ml Ampicillin b Xây dựng marker nhận biết chuyên biệt cho loài Xoo K3a nhờ phương pháp AFLP - Hình 4: Quy trình xây dựng marker nhận biết chun biệt lồi Xoo K3a  Dựa vào trình tự có từ phương pháp AFLP, mồi K3aF K3aR thiết kế để nhận biết chuyên biệt cho loài Xoo K3a - Bảng 2: Oligonucleotide adapters primers sử dụng cho phương pháp AFLP c Thiết kế mồi PCR đặc hiệu - Thiết kế mồi - Phản ứng PCR đặc hiệu: Thành phần phản ứng PCR – 50ng DNA mạch khuôn – 10pmol K3aF – 10pmol K3aR – Tổng thể tích phản ứng: 20μl - Chu trình nhiệt phản ứng: 96 oC 960C 5s 5m 1X 600C 15s 720C 720C 5m 30s 25x 1X 40C ∞ d Thử nghiệm PCR để xác định tác nhân gây bệnh ruộng lúa • Những giống lúa IR24 50 ngày tuổi làm nhiễm nhân tạo cách cắt đỉnh lá, ngâm vào dịch vi khuẩn Xoo chủng HB0100 với mật độ 109 tế bào/ 1ml, trồng nhà kính với nhiệt độ 25300C, với độ ẩm tương đối 60% • Mẫu thu nhận với kích thước từ 1-8 cm từ vị trí tổn thương vào ngày thứ 1, 2, 3, 4, ngày • Mỗi mẫu ngâm 200μl nước cất 20 phút Lấy 10 μl dịch tiết làm mẫu cho thử nghiệm PCR IV KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Nhận biết chuyên biệt loài Xoo K3a nhờ marker có nguồn gốc từ AFLP - Bộ mồi K3aF K3aR khuếch đại sản phẩm có kích thước 1.024 bp  Nhận biết chuyên biệt loài Xoo K3a - Kết quả: Bộ mồi nhận biết chuyên biệt 13 mẫu thuộc loài Xoo K3a 119 mẫu thuộc chủng Xanthomonas - Bảng 1: Danh sách dòng vi khuẩn sử dụng - Hình 5: Điện di gel agarose sản phẩm PCR khuếch đại dòng Xoo sử dụng mồi chuyên biệt K3aF K3aR - Hình 6: Điện di gel agarose sản phẩm PCR khuếch đại từ loài Xoo K3a chủng Xanthomonads khác, sử dụng mồi chuyên biệt K3aF K3aR + Lane – 13: loài Xoo K3a ( thứ tự 73 – 85 bảng 1) + Lane 14 – 39: dòng Xanthomonads khác ( thứ tự 94 – 119 bảng 1) Phương pháp PCR xác định loài Xoo K3a gây bệnh ruộng lúa - Hình 7: Phương pháp PCR phát lồi Xoo K3a lúa (A) Lá lúa sau ngày tiêm nhiễm nhân tạo vi khuẩn Xoo HB01001 (B) Phương pháp PCR phát tác nhân từ vị trí khác mẫu lúa (A) Lane M: Thang kích thước phân tử Lane C: Đối chứng dương Xoo HB01001 Lane 1-8: Mẫu lầy từ vị trí – cm từ vị trí thương tổn - Hình 8: Phương pháp PCR phát tác nhân lúa từ -5 ngày sau tiêm nhiễm nhân tạo Xoo HB01001 Lane M: Thang kích thước phân tử Lane C: Đối chứng dương Xoo HB01001 Lane -5: Mẫu sau -5 ngày tiêm nhiễm nhân tạo Xoo HB01001 NHÓM THỰC HIỆN – NHÓM Trần Thị Thùy Trinh 1253012428 Nguyễn Thị Nga 1253012214 Phạm Thị Thu An1253010003 Thiều Hồng Huệ 1253010139 Nguyễn Thị Hương 1253012147 Nguyễn Anh Khuyến 1253010136 Lâm Thị Thanh Tâm1253010325 Nguyễn Quỳnh Anh 1253012008 Nguyễn Trần Hải Nam 1253012208 10.Trương Thị Xuân Diểm 1253010048 11.Lương Thị Bích Thuận 1253010378 12 Phan Trần Anh Tuấn 0853011035 Xin cảm ơn cô bạn lắng nghe