Bước đầu nghiên cứu phương pháp phát hiện nhanh trực trùng mủ xanh (pseudomonas aeruginosa) kháng thuốc kháng sinh nhóm β lactam bằng kỹ thuật PCR

i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN TUẤN ANH Tên đề tài : BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN NHANH TRỰC TRÙNG MỦ XANH (Peudomonas aeruginosa) KHÁNG THUỐC KHÁNG SINH NHÓM β-LACTAM BẰNG KỸ THUẬT PCR KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : CHÍNH QUY Chun ngành : Cơng nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Lớp : K43 - CNSH Khóa học : 2011 - 2015 Giảng viên hƣớng dẫn : BS Nguyễn Thị Huyền TS Nguyễn Văn Duy THÁI NGUYÊN – 2015 i LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên tạo điều kiện cho suốt thời gian học tập trường Các thầy cô Khoa Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm thầy cô trực tiếp giảng dạy tận tình truyền đạt kiến thức cho suốt năm học vừa qua Tơi xin chân thành bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới: TS Nguyễn Văn Duy, Khoa Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên tạo điều kiện thuận lợi hướng dẫn tận tình tơi q trình thực đề tài BS Nguyễn Thị Huyền, CN Trần Trung Anh KTV Nguyễn Thị Thủy, Trương Thùy Vi, Dương Minh Phương, Khoa Vi sinh vật, Bệnh viện đa khoa Trung Ương Thái Nguyên hỗ trợ, giúp đỡ tơi tận tình cung cấp cho tơi chủng vi sinh vật để thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình bạn bè bên cạnh động viên giúp đỡ tơi học tập làm việc hồn thành khóa luận Tôi xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày 28 tháng năm 2015 Sinh viên Nguyễn Tuấn Anh ii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1: Các cặp mồi sử dụng đề tài nghiên cứu 18 Bảng 3.2: Các hóa chất sử dụng đề tài nghiên cứu 18 Bảng 3.3: Các dụng cụ, thiết bị sử dụng đề tài nghiên cứu 19 Bảng 4.1: Bảng khảo sát tỷ lệ vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc bệnh nhân điều trị Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên 30 Bảng 4.2: Kiểu hình chủng Pseudomonas aeruginosa phân lập Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên 33 Bảng 4.3: Nồng độ DNA tổng số tách chiết từ chủng Pseudomonas aeruginosa 38 Bảng 4.4: So sánh có mặt gene kháng metallo β-lactamase với kiểu hình kháng β-lactam chủng Pseudomonas aeruginosa thu thập 41 iii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 4.1: Khảo sát tỷ lệ vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc bệnh nhân điều trị Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên.… 31 Hình 4.2: Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA tổng số số mẫu Pseudomonas aeruginosa 36 Hình 4.3: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi OPRLFOPRLR 38 Hình 4.4: Kết điện di kiểm tra sản phẩm phản ứng multiplex PCR sử dụng cặp mồi blaIMPF-blaIMPR blaVIMF-blaVIMR 40 iv DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT Nghĩa đầy đủ từ, thuật ngữ Từ, thuật ngữ viết tắt CIAA DNA dNTPs OD Hỗn hợp gồm 24 chloroform : isoamylalcohol (v/v) Deoxyribonucleic Acid Deoxyribonucleotide triphosphates (Hỗn hợp gồm dATP, dGTP, dCTP, dTTP) Optical Density - Mật độ quang Polymerase Chain Reaction – Phản ứng tổng hợp PCR chuỗi trùng hợp – trình tổng khuếch đại vùng DNA đặc hiệu in vitro RNA ELISA Ribonucleic Acid Enzyme Linked Immunosorbent Assay – Kỹ thuật hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme v MỤC LỤC Phần 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu yêu cầu đề tài 1.3 Ý nghĩa đề tài Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) 2.1.1 Lịch sử nghiên cứu trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) 2.1.2 Đặc điểm sinh học 2.2 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 2.2.1 Tình hình kháng thuốc Pseudomonas aeruginosa giới 2.2.2 Tình hình kháng thuốc Pseudomonas aeruginosa nước 2.3 Cơ chế kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn 11 2.3.1 Cơ chế enzyme khử hoạt tính thuốc kháng sinh 11 2.3.2 Cơ chế thay đổi đích thuốc kháng sinh 11 2.3.3 Cơ chế ngăn xâm nhập kháng sinh vào tế bào 12 2.3.4 Cơ chế kháng thuốc kháng sinh Pseudomonas aeruginosa 13 2.4 Các phương pháp phát Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc 14 2.4.1 Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán đĩa thạch 14 2.4.2 Kỹ thuật xác định nồng độ tối thiểu kháng sinh (MIC) 15 2.4.3 Kỹ thuật PCR 15 Phần 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 3.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 17 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 17 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 17 3.2 Địa điểm thời gian tiến hành 17 3.2.1 Địa điểm nghiên cứu 17 vi 3.2.2 Thời gian nghiên cứu 17 3.3 Vật liệu nghiên cứu 17 3.3.1 Các cặp mồi sử dụng đề tài 17 3.3.2 Hóa chất sử dụng đề tài 18 3.3.3 Dụng cụ, thiết bị 19 3.4 Nội dung nghiên cứu 19 3.5 Phương pháp nghiên cứu 19 3.5.1 Phương pháp phân lập Pseudomonas aeruginosa từ bệnh nhân 19 3.5.2 Phương pháp xác định kháng sinh đồ 24 3.5.3 Phương pháp nghiên cứu phát Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc kỹ thuật PCR 25 Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 4.1 Khảo sát tỷ lệ kháng thuốc kháng sinh chủng Pseudomonas aeruginosa bệnh nhân điều trị Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên 29 4.2 Kết phân lập chủng Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc kháng sinh Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên 32 4.3 Thử nghiệm khả phát nhanh Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc 35 4.3.1 Tách chiết DNA tổng số 35 4.3.2 Kiểm định chủng Pseudomonas aeruginosa 37 4.3.3 Nghiên cứu khả phát nhanh vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc 39 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 5.1 Kết luận 44 5.2 Kiến nghị 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) nguyên nhân hàng đầu gây nhiễm khuẩn bệnh viện Chúng gây nên bệnh lí với nhiều mức độ khác viêm phổi, nhiễm khuẩn vết thương, nhiễm khuẩn huyết nặng với tỉ lệ tử vong cao Tỉ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện trực trùng mủ xanh (P aeruginosa) tăng dần năm gần giới Việt Nam Cùng với gia tăng tỉ lệ nhiễm khuẩn khả kháng kháng sinh tăng cao Theo báo cáo CDC ước tính năm Hoa Kì có hai triệu người mắc bệnh với bệnh nhiễm trùng kháng thuốc kháng sinh có 23.000 người chết có khoảng 51.000 ca nhiễm bệnh liên quan đến P aeruginosa Trong ca nhiễm bệnh liên quan đến P aeruginosa có 6000 (13%) đa kháng thuốc, với khoảng 400 ca tử vong nhiễm trùng (Fatima A cs, 2012) [22] Theo kết nghiên cứu khác (2013), 112 mẫu P aeruginosa phân lập từ bệnh nhân điều trị bỏng bệnh viện năm 2012 cho thấy tỷ lệ kháng tương đối cao Gentamicine (59,6%), Piperacillin (36,8%) Ciprofloxaxin (33,3%) (Joseph N M cs, 2013) [26] Ở Việt Nam, nghiên cứu 36 bệnh viện tỉnh phía Bắc từ Trung Ương đến địa phương năm 2006 – 2007 cơng bố có tới 7,8% bệnh nhân mắc nhiễm trùng bệnh viện (HAIs) Có loại nhiễm khuẩn bệnh viện gồm viêm phổi, nhiễm khuẩn vết mổ nhiễm khuẩn tiêu hóa P aeruginosa nguyên nhân (chiếm 31,5%) (Nguyễn Văn Hùng cs, 2008) [8] Theo kết nghiên cứu từ bệnh viện Hà Nội: Việt Đức, Xanh Pôn, Bệnh viện 108 Bệnh viện 103 từ năm 2005 – 2008 cho thấy P aeruginosa phân lập từ bệnh phẩm đề kháng cao với loại kháng sinh Tetracycline (92,1%), Ceftriaxone (58,5%) Gentamicin (54%) (Bùi Khắc Hậu cs, 2008) [6] Tình hình đề kháng đa kháng sinh P aeruginosa ghi nhận nghiên cứu cho thấy gia tăng tình hình nhiễm khuẩn bệnh viện P aeruginosa khả kháng lại kháng sinh vi khuẩn gây nên, làm tăng tỉ lệ bệnh tật, tăng tỉ lệ tử vong tăng chi phí điều trị Để phát P aeruginosa kháng thuốc phương pháp thường sử dụng nuôi cấy môi trường thạch kết hợp với thử nghiệm hóa sinh làm kháng sinh đồ Đây phương pháp phức tạp tốn nhiều thời gian, chậm cho kết (4 - ngày) Sự phát chậm P aeruginosa kháng thuốc nguyên nhân làm chậm hướng điều trị góp phần làm giúp cho tác nhân gây bệnh có hội lây lan cộng đồng, ảnh hưởng đến sức khỏe nhiều người Với phát triển sinh học phân tử, vùng gene đặc hiệu cho tính kháng thuốc loài vi sinh vật hiểu biết ngày đầy đủ Nhờ đó, nhiều kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng việc phát nhanh đồng thời nhiều tác nhân gây bệnh mẫu phân tích dựa dấu hiệu phân tử mang tính đặc hiệu Các kỹ thuật bao gồm kỹ thuật PCR, ELISA, DNA arrays… PCR kỹ thuật cho phép phát tác nhân gây bệnh kháng thuốc phép phân tích Đây kỹ thuật đơn giản, không yêu cầu thiết bị phức tạp nên thuận lợi việc áp dụng thực tiễn chẩn đoán Xuất phát từ thực tiễn đời sống, sở vào lực nghiên cứu Khoa CNSH CNTP - Đại học Nông Lâm Thái Nguyên - Đại học Thái Nguyên, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Bƣớc đầu nghiên cứu phƣơng pháp phát nhanh trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) kháng thuốc kháng sinh nhóm β-lactam kỹ thuật PCR” Trong khn khổ khóa luận này, chúng tơi tiến hành khảo sát mức độ kháng thuốc kháng sinh Pseudomonas aeruginosa bệnh nhân điều trị Bệnh viện Đa khoa Thái Nguyên thời gian từ tháng 12 năm 2014 đến tháng năm 2015 bước đầu nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR phát nhanh vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh thuộc nhóm βlactam 1.2 Mục tiêu yêu cầu đề tài - Mục tiêu đề tài Bước đầu nghiên cứu phương pháp phát nhanh trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) kháng thuốc kỹ thuật PCR - Yêu cầu đề tài + Khảo sát tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc bệnh nhân điều trị Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên + Phân lập vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc + Bước đầu nghiên cứu phương pháp phát nhanh Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc kỹ thuật PCR 1.3 Ý nghĩa đề tài - Ý nghĩa khoa học Bước đầu xây dựng thành công kỹ thuật PCR phát Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc - Ý nghĩa thực tiễn + Phục vụ công tác điều trị, khám chữa bệnh Tạo tiền đề cho việc xây dựng kit chẩn đoán nhanh Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc dựa kỹ thuật PCR 36 Kết tách chiết DNA tổng số xác định nồng độ DNA chủng thể bảng 4.3, kết điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết số chủng thể hình 4.2 đây: Hình 4.2: Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA tổng số số mẫu Pseudomonas aeruginosa Bảng 4.3: Nồng độ DNA tổng số tách chiết từ chủng P aeruginosa phân lập đƣợc Nồng Độ DNA STT Chủng OD260/280 P1 1,83 18,5 P2 1,87 13,5 P3 1,89 9,0 P4 1,82 9,7 P5 1,81 10,2 P6 1,91 11,7 P7 1,84 18,0 P8 1,90 19,1 P9 1,80 15,3 (ng/μl) 37 Từ kết điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA tổng số số mẫu P aeruginosa hình 4.2 cho thấy DNA bao gồm băng gần giếng điện di, nồng độ DNA tương đối cao, bị đứt gãy tương đối đồng chủng Các băng DNA thu có cường độ sang khác nồng độ DNA chủng sau tách chiết khác nhau, kết đo nồng độ DNA thể rõ bảng 4.3 Các băng vạch mờ bên RNA Kết tách chiết DNA thể bảng 4.3 cho phép khẳng định DNA tổng số chủng Pseudomonas aeruginosa tách chiết thành công Nồng độ DNA chủng Pseudomonas aeruginosa đạt từ 9,0 ng/μl đến 19,1 ng/μl tùy theo mẫu Dung dịch DNA tổng số chủng có tỷ số OD260/280 nằm khoảng 1,8 đến 2,0 chứng tỏ dung dịch DNA chủng đủ độ tinh cho nghiên cứu 4.3.2 Kiểm định chủng Pseudomonas aeruginosa Để khẳng định chủng vi khuẩn thu thập Pseudomonas aeruginosa, chủng thu thập được kiểm tra đặc điểm di truyền Trong nghiên cứu trước đây, gene oprL mã hóa loại protein màng ngồi Pseudomonas aeruginosa sử dụng làm thị phân tử cho việc định danh P aeruginosa kỹ thuật phân tử (Abdullahi R cs, 2013) [15]; (Aghamiri S cs, 2014) [16] Do đó, nghiên cứu này, gene oprL sử dụng để định danh chủng vi khuẩn thu thập kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu OPRLF-OPRLR theo công bố Aghamiri cộng năm 2014 (Aghamiri S cs, 2014) [16] Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR thể hình 4.2 đây: 38 Hình 4.3: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi OPRLF-OPRLR Đường chạy M Thang chuẩn DNA 100 bp (Enzynomics - Hàn Quốc), đường chạy 1: Mẫu kiểm chứng âm tính; đường chạy - 10: Các mẫu vi khuẩn kiểm tra Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR thể hình 4.2 cho thấy mẫu kiểm chứng âm tính (đường chạy số 1) không xuất băng sản phẩm PCR đồng thời mẫu DNA chủng vi khuẩn phân lập xuất băng DNA nhất, rõ nét có kích thước khoảng 483 bp Đây kích thước sản phẩm PCR theo lý thuyết khuếch đại từ vùng gene oprL cặp mồi OPRLF-OPRLR theo công bố Aghamiri cộng năm 2014 Trong nghiên cứu công bố, gene oprL sử dụng để định danh Pseudomonas aeruginosa với độ đặc hiệu 100% (Abdullahi R cs, 2013) [15]; (Aghamiri S cs, 2014) [16] Do đó, từ kết nghiên cứu trên, khẳng định chủng vi khuẩn phân lập từ bệnh nhân Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên Pseudomonas aeruginosa 39 4.3.3 Nghiên cứu khả phát nhanh vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc Trong loại thuốc kháng sinh thường sử dụng điều trị Pseudomonas aeruginosa, β-lactam nhóm kháng sinh sử dụng phổ biến Trong số chủng thu thập được, chủng thể tính kháng với thuốc kháng sinh thuộc nhóm β-lactam bao gồm loại thuốc Amoxicillin, Amo+A clavulanine, Ampicillin, Cefalexin, Cefoxitin, Ceftazidime, Ceftriaxon, Cephalothin, Piperacillin Trong nghiên cứu này, dựa công bố Aghamiri năm 2014 (Aghamiri S cs, 2014) [16] tập trung nghiên cứu khả phát chủng kháng β-lactam kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu Để kiểm tra khả kháng β-lactam kỹ thuật PCR tiến hành thực phản ứng multiplex PCR cặp mồi blaIMPF-blaIMPR đặc hiệu cho gene kháng metallo β-lactamase họ IMP, cặp mồi blaVIMF-blaVIMR đặc hiệu cho gene kháng metallo β-lactamase họ VIM Pseudomonas aeruginosa Sản phẩm PCR kiểm tra điện di gel agarose 2,5% Chủng Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc đánh giá chủng xuất băng DNA tương ứng với kích thước sản phẩm PCR cặp mồi phát tính kháng thuốc blaIMPF-blaIMPR blaVIMF-blaVIMR Kết kiểm tra chủng kháng khơng kháng β-lactam thể hình 4.3 40 Hình 4.4: Kết điện di kiểm tra sản phẩm phản ứng multiplex PCR sử dụng cặp mồi blaIMPF-blaIMPR blaVIMF-blaVIMR Đường chạy M: Thang chuẩn DNA 100bp (Enzynomics - Hàn Quốc), đường chạy số 1: mẫu kiểm chứng âm tính; đường chạy số - 10: mẫu P aeruginosa kiểm tra Kết nghiên cứu thể hình 4.4 cho thấy mẫu kiểm chứng âm tính (mẫu khơng có DNA khn P aeruginosa) khơng hình thành sản phẩm PCR; mẫu tương ứng với đường chạy từ số đến số đường chạy số 10 không xuất băng DNA chứng tỏ chủng P aeruginosa tương ứng với đường chạy không mang gene đặc hiệu metallo βlactamse họ VIM họ IMP quy định khả kháng β-lactam Các mẫu đường chạy từ số đến số xuất băng DNA có kích thước 459 bp tương ứng với kích thước sản phẩm PCR khuếch đại cặp mồi blaIMPF-blaIMPR theo lý thuyết công bố Aghamiri cộng năm 2014 (Aghamiri S cs, 2014) [16] Kết chứng tỏ chủng P aeruginosa tương ứng với đường chạy mang gene mã hóa metallo β-lactamase họ IMP kháng thuốc kháng sinh họ β-lactam Khơng có chủng mang gene mã hóa metallo β-lactamase họ VIM Kết kiểm tra phản ứng PCR sử dụng riêng rẽ cặp mồi blaVIMF-blaVIMR cho 41 kết tương tự Như khẳng định chủng P aeruginosa tương ứng với đường chạy từ số - kháng β-lactam liên quan đến gene mã hóa metallo β-lactamse họ IMP Kết so sánh kiểm hình kháng β-lactam chủng phân lập với kết phát gene kháng β-lactamase thể bảng 4.4 Bảng 4.4: So sánh có mặt gene kháng metallo β-lactamase với kiểu hình kháng β-lactam chủng Pseudomonas aeruginosa thu thập đƣợc Ký hiệu Sự có mặt gene kháng Kiểu hình kháng chủng metallo β-lactamase β-lactam P1 + + P2 - + P3 + + P4 - + P5 - + P6 - - P7 + + P8 + + P9 - + STT Ghi (+) Dương tính (-) Âm tính Từ kết bảng 4.4 cho thấy, tỷ lệ kháng β-lactam theo kiểu hình 88,89% (8 chủng kháng tổng số chủng), tỷ lệ kháng β-lactam theo kiểu gene (có xuất gene kháng metallo β-lactamase) 44,44% (4 chủng tổng số chủng) Tất chủng mẫn cảm với kháng sinh thuộc nhóm β-lactam cho kết âm tính với gene kháng metallo βlactamase Dựa vào kết trên, nhận thấy có chênh 42 lệch tỷ lệ kháng β-lactam theo kiểu hình (88,89%) kiểu gene (44,44%) Theo kết bảng 4.4, có tổng số chủng kháng β-lactam theo kiểu hình Trong đó, việc tìm gene kháng metallo β-lactamase P aeruginosa kỹ thuật PCR cho kết phát chủng Theo đó, chủng kháng thuốc kháng sinh nhóm β-lactam dương tính với gene kháng metallo βlactamase chiếm 50,00% (phát chủng tổng số chủng kháng β-lactam) Do đó, độ xác kỹ thuật PCR phát P aeruginosa kháng thuốc kháng sinh nhóm β-lactam 50,00% Trong nghiên cứu năm 2014, Aghamiri S.và cộng sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi blaIMPF-blaIMPR blaVIMF-blaVIMR để phát có mặt gene kháng metallo β-lactamase 216 chủng Pseudomonas aeruginosa kháng β-lactam cho kết 90/216 (chiếm 41,67%) chủng kháng β-lactam mang gene metallo β-lactamase Trong có 70/216 (32,41%) chủng kháng β-lactam mang gene metallo β-lactamase thuộc họ IMP 20/216 (9,26%) chủng kháng β-lactam mang gene metallo β-lactamase thuộc họ VIM (Aghamiri S cs, 2014) [16] Từ công bố Aghamiri S cộng (2014) với kết nghiên cứu chủng kháng β-lactam dương tính với gene kháng metallo β-lactamase tương đồng Nghiên cứu Aghamiri S cộng (2014) cho thấy có 41,67% chủng kháng β-lactam nghiên cứu 44,44% Như kết thực nghiệm chúng tơi, có chủng Pseudomonas aeruginosa tổng số chủng kháng β-lactam khơng có mặt gene kháng metallo β-lactamase thuộc nhóm VIM IMP, tính kháng βlactam chủng liên quan đến chế khác 43 Dựa theo nghiên cứu Daniel J W Philip D L (2013) (Daniel J W cs, 2013) [21], gene kháng metallo β-lactamase thuộc nhóm VIM IMP cịn có gene thuộc nhóm GIM SPM Vì vậy, chế kháng P aeruginosa với kháng sinh nhóm β-lactam liên quan đến gene thuộc nhóm GIM SPM 44 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết nghiên cứu đưa số kết luận sau: - Đã khảo sát tỷ lệ kháng kháng sinh Pseudomonas aeruginosa phân lập bệnh nhân điều trị Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên từ tháng 12 năm 2014 đến tháng năm 2015 Kết cho thấy: số loại kháng sinh bị kháng lại mức độ cao Chloramphenicol Rifampicine (93,33%), Clindamyxin Neomycin (86,67%), Clarithromycin Pefloxacine (80,00%) Tuy nhiên có số loại kháng sinh bị kháng lại mức độ thấp (tính nhạy cảm cao) Ampicillin Cefoxitin (13,33%) - Đã phân lập chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc từ bệnh nhân điều trị Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên Trong đó, có1 chủng kháng loại kháng sinh, chủng kháng 11 loại kháng sinh, chủng kháng 13 loại kháng sinh, chủng kháng 14 loại kháng sinh chủng kháng 18 loại kháng sinh Tất chủng khẳng định Pseudomonas aeruginosa kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu với gene oprL - Bước đầu nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR phát nhanh Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc kháng sinh nhóm β-lactam thơng qua thị gene kháng metallo β-lactamase Trong chủng kháng kháng sinh nhóm β-lactam dương tính với gene kháng metallo β-lactamase chiếm 50,00% 45 5.2 Kiến nghị - Tiếp tục khảo sát tỷ lệ chủng P aeruginosa kháng thuốc kháng sinh nhóm β-lactam có mặt gene kháng metallo β-lactamase tập hợp lớn chủng để đưa số liệu thơng kê có ý nghĩa - Tiếp tục nghiên cứu phát P aeruginosa kháng kháng thuốc kháng sinh nhóm β-lactam thông qua thị phân tử khác tính kháng thuốc kháng sinh khác P aeruginosa kỹ thuật PCR TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tiếng Việt Đái Duy Ban, Lương Thị Hồng Vân (2009), Kỹ thuật công nghệ sinh học ứng dụng Nơng - Sinh - Y, Nxb Nơng nghiệp Hồng Dỗn Cảnh cộng (2014), “Tình hình kháng kháng sinh Pseudomonas aeruginosa phân lập bệnh phẩm Viện Pasteur”, Tạp chí Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh, (61) Lê Huy Chính (chủ biên) cộng sự, (2001), Vi sinh vật y học, Nxb Y học, Hà Nội Nguyễn Quốc Định, Hồng Ngọc Hiển, Lê Huy Chính, Nguyễn Văn Việt, (1999), “Nghiên cứu nhiễm khuẩn huyết bỏng Pseudomonas aeruginosa số yếu tố liên quan Viện Bỏng Quốc gia (từ 6/96 - 12/98)”, Tạp chí Y học thực hành, Số 10, tr - 11 Lê Đăng Hà, Nguyễn Đức Hiền (2004), “Tình hình kháng thuốc kháng sinh năm 2003 số vi khuẩn gây bệnh”, Thông tin dược lâm sàng, Số 10, tr.2 -3 Bùi Khắc Hậu nhóm tác giả (2008), Dịch tễ học phân tử chủng Pseudomonas aeruginosa đa kháng thuốc nhiễm trùng bệnh viện Hà Nội, Báo cáo kết nghiên cứu Đề tài cấp Bộ, Đại học Y Hà Nội.] Lê Thu Hồng, Hoàng Ngọc Hiển, (2002), “Nghiên cứu chế tạo huyết kháng Trực khuẩn mủ xanh đa giá, tinh chế đánh giá hiệu điều trị chỗ chế phẩm động vật bệnh nhân bỏng”, Tạp chí Thơng tin y dược, Bộ y tế - Viện thông tin thư viện y học trung ương, Hà Nội Nguyễn Văn Hùng, Nguyễn Thị Tuyết Nga, Vũ Văn Giang, Nguyễn Văn Hà, Trần Quý (2008), “Tỉ lệ yếu tố liên quan đến nhiễm trùng bệnh viện số bệnh viện phía bắc Việt Nam 20062007”, Tạp chí Y học lâm sàng Lê Bảo Huy, Lê Đức Thắng (2005), Khảo sát tác nhân gây viêm phổi bệnh viện tình hình kháng kháng sinh khoa ICU bệnh viện Thống Nhất 2004-2005, Tập thể khoa hồi sức cấp cứu – Khoa vi sinh bệnh viện Thống Nhất, Tài liệu hội thảo khoa học 10 Trần Thị Xuân Mai (2011), “Phát nhanh Salmonella spp, Salmonella enterica diện thực phẩm kỹ thuật PCR đa mồi (multiplex-PCR)”, Tạp chí Khoa học, 20, tr 198-208 11 Võ Thị Chi Mai (1997), Nhận xét tính kháng thuốc in vitro bệnh viện Chợ Rẫy năm 1997, Bộ môn Vi Sinh, Khoa Y, Đại Học Y Dược – Khoa Vi Sinh, Bệnh viện Chợ Rẫy, Tài liệu hội thảo khoa học 12 Hồ Việt Mỹ cộng (2004), Nghiên cứu tình trạng nhiễm khuẩn bệnh viện; đề xuất, áp dụng đánh giá biện pháp phòng chống bệnh viện đa khoa tỉnh BVĐK khu vực Bồng Sơn từ năm 2003-2004, Sở y tế Bình Định 13 Hồng Kim Tuyến, (2006), “Tình hình kháng kháng sinh vi khuẩn phân lập bệnh viện Thống Nhất (8/2002 - 8/2005)”, Thông tin Kháng thuốc vi khuẩn, Nxb Y học, Hà Nội 14 Phạm Hùng Vân (2006), Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng, Nxb Y học II Tiếng Anh 15 Abdullahi R., Lihan S., Carlos B S., Bilung M L., Mikal M K and Collick F (2013), “Detection of oprL gene and antibiotic resistance of Pseudomonas aeruginosa from aquaculture environment”, European Journal of Experimental Biology, 3(6):148-152; 16 Aghamiri S., Amirmozafari N., Mehrabadi J F., Fouladtan B and Kafil H.S (2014), “Antibiotic Resistance Pattern and Evaluation of MetalloBeta Lactamase Genes Including bla-IMP and bla-VIM Types in Pseudomonas aeruginosa Isolated from Patients in Tehran Hospitals” ISRN Microbiolog, yolume 2014, Article ID 941507, pages (http://dx.doi.org/10.1155/2014/941507) 17 Anton Y P, David C Hooper (2010), “Hospital-Acquired Infections Due to Gram-Negative Bacteria”, N Engl J Med, 362(19), 1804-1813 18 Balcht, Aldona, Smith, Raymond (1994), “Pseudomonas aeruginosa: Infections and Treatment”, Informa Health Care, 83–84 19 Bush K., Jacoby G A (2010), “Update functional classification of lactamases”, Antimicrob Agents Chemother, 54, 969-976 20 CLSI (2010), “Performance standards for antimicrobial susceptibility testing twentieth informational supplement M100-S20”, 30(1), 2010 21 Daniel J W., Philip D L (2013), “Mechanisms of β-lactam Resistance Among Pseudomonas aeruginosa”, Current Pharmaceutical Design, 2013, 19, 209-222 22 Fatima A., Naqvi S B., Jabeen S (2012), “Antimicrobial susceptibility pattern of clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa isolated from patients of lower respiratory tract infections”, Springerplus, 2012, 1(1), 70 23 Gales A C., Jones R N., Turnidge J., Rennie R., Ramphal R (2001), “Characterization of Pseudomonas aeruginosa Isolates: Occurrence rates, antimicrobial susceptibility patterns and molecular typing in the global SENTRY antimicrobial surveillance program 1997–1999”, Clinical Infectious Diseases, 2001, 32(2), 146–55 24 Guardabassi L., Courvalin P (2006), Modes of Antimicrobial Action and Mechanisms of Bacterial Resistance, 1-18 In Aarestrup F (ed), Antimicrobial Resistance in Bacteria of Animal Origin, ASM Press, Washington DC 25 Hirulkar N B., Soni B (2011), “Incidence of Antibiotic Resistant Pseudomonas aeruginosa Isolated from Drinking Water”, International Journal of Pharmaceutical & Biological Archives 2011, 2(2), 724-733 26 Joseph N M., Devi S., Shashikala P., Kanungo R (2013), “Changing Trend in the Antibiotic Resistance Pattern of Pseudomonas aeruginosa Isolated from Wound Swabs of Out-Patients and in-Patients of a Tertiary Care Hospital”, J Clin Diagn Res, 7(10), 2170-2172 27 Kumarasamy K K cộng (2010), “Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in India, Pakistan, and the UK: a molecular, biological, and epidemiological study”, Lancet Infect Dis, 10, 597602 28 Lateef A., Oloke J K., Gueguimkana E B (2005), “The prevalence of bacterial resistance in clinical, food, water and some environmental samples in Southwest Nigeria, Environmental Monitoring and Assessment”, 2005, 100: 59–69 29 Livermore D M (2001), “Of Pseudomonas, porins, pumps, and carbapenems” J Antimicrob Chemother, 47, 247-50 30 McGowan JE Jr (1983), “Antimicrobial resistance in hospital organisms and its relation to antibiotic use”, Rev Infect Dis, 5(10) 33-48 31 Mirakhur A., Gallagher M.J., Ledson M.J., Hart C.A., Walshaw M.J (2003), “Fosfomycin therapy for multiresistant Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis”, J Cyst Fibros., 2(1):19-24 32 Mulvey M R., Simor A E (2009), “Antimicrobial resistance in hospitals: How concerned should we be?”, CMAJ, 180(4), 408-415 33 Mutharia L M., Nicas T I., Hancock R E W., (1982), “Outer membrane proteins of Pseudomonas aeruginosa serotyping strains”, J Infect Dis 46:770 34 Oguntibeju O O., Nwobu R A U (2004), “Occurrence of Pseudomonas aeruginosa in postoperative wound infection”, Pak J Med Sci JulySeptember 2004, 20(3), 187-191 35 Wilson M A R., Rimler B and Hofman L J (1992), “Comparisom of DNA fingerprints and somatic serotypes of serogroup B and E Pasteurella multocida”, J Clin Microbiol, 30 (6): 1518-1524 ... 2015 bước đầu nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR phát nhanh vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh thuộc nhóm ? ?lactam 1.2 Mục tiêu yêu cầu đề tài - Mục tiêu đề tài Bước đầu nghiên cứu phương pháp phát nhanh. .. aeruginosa kháng thuốc + Bước đầu nghiên cứu phương pháp phát nhanh Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc kỹ thuật PCR 1.3 Ý nghĩa đề tài - Ý nghĩa khoa học Bước đầu xây dựng thành công kỹ thuật PCR phát. .. phát nhanh trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) kháng thuốc kháng sinh nhóm β- lactam kỹ thuật PCR? ?? Trong khn khổ khóa luận này, tiến hành khảo sát mức độ kháng thuốc kháng sinh Pseudomonas