Nghiên cứu phương pháp xác định nhanh aflatoxin m1 trong sữa

Luận văn Thạc sĩ khoa học MỤC LỤC MỤC LỤC MỞ ĐẦU PHẦN TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu Aflatoxin 1.1.1 Aflatoxin gì? [1][2] 1.1.2 Cấu tạo 1.1.3 Tính chất hóa lý 1.1.4 Phân loại Aflatoxin [3] 1.1.5 Tính chất độc hại Aflatoxin [4] 10 1.1.6 Sự chuyển hóa Aflatoxin thể 12 1.2 Giới thiệu Aflatoxin M1 13 1.2.1 Thông tin chung 13 1.2.2 Sự hình thành Aflatoxin M1 [9] 13 1.2.3 Đặc tính [11] 14 1.2.4 Tình hình nhiễm Aflatoxin M1 14 1.2.5 Giới hạn cho phép 16 1.3 Các phương pháp xác định Aflatoxin M1 18 1.3.1 Phương pháp ELISA ( enzyme – linked immunosorbent assay ) 18 1.3.2 Phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao HPLC (high performance liquid chromatography) 19 1.3.3 Phương pháp sắc kí lớp mỏng TLC ( thin layer chromatography ) 19 1.4 Aptamer 20 1.4.1 Quy trình SELEX tổng quát 21 1.4.2 Quy trình SELEX sử dụng màng lọc Nitrocellulose 22 1.4.3 Quy trình SELEX sử dụng sắc ký lực hạt từ 23 1.4.4 Quy trình SELEX sử dụng điện di mao quản 24 1.4.5 SELEX trực tiếp tế bào (Cell-SELEX) 25 1.5 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC 26 1.5.1 Nguyễn tắc chung HPLC 26 Nguyễn Quỳnh Trang Luận văn Thạc sĩ khoa học 1.5.2 1.5.3 1.5.4 1.5.5 Pha tĩnh HPLC 27 Pha động HPLC 28 Các loại detector HPLC 29 Phân tích định tính định lượng HPLC [1] 29 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1 Vật liệu 31 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 31 2.1.2 Thiết bị dụng cụ 31 2.2 Phương pháp nghiên cứu 33 2.2.1 Phân tích định tính Aflatoxin M1 33 2.2.2 Phân tích định lượng Aflatoxin M1 sữa 36 2.2.3 Kiểm định độ xác phép đo phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 37 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 3.1 Kết phân tích định tính Aflatoxin M1 40 3.1.1 Thu nhận tổng hợp Aptamer đặc hiệu aflatoxin M1 40 3.1.2 Ứng dụng Aptamer phân tích định tính Aflatoxin M1 sữa 40 3.2 Kết phân tích định lượng AFM1 sữa phương pháp điện hóa sử dụng aptamer 41 3.2.1 Phổ đồ điện hóa 41 3.2.2 Phương trình Hồi quy tuyến tính điện trở kháng EIS nồng độ Aflatoxin M1 44 3.3 Kiểm định độ xác phép đo phương pháp HPLC 48 3.3.1 Xây dựng đường chuẩn HPLC 48 3.3.2 Hàm lượng AFM1 mẫu tính sau: 48 KẾT LUẬN 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 Nguyễn Quỳnh Trang Luận văn Thạc sĩ khoa học MỞ ĐẦU Vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm nhận quan tâm người dân điều liên quan trực tiếp đến sức khoẻ họ Đặc biệt thời gian gần đây, nhiều nghiên cứu công bố số liệu khảo sát tình hình nhiễm chất gây hại đến sức khoẻ người số loại thực phẩm Các chất độc hại xâm nhập vào thể gây nhiều chứng bệnh mà khoa học thời kì nghiên cứu để chữa trị, ví dụ bệnh ung thư Việt Nam nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, gió mùa, điều kiện thuận lợi cho loại vi sinh vật mà đặc biệt nấm mốc phát triển Hoạt động mạnh mẽ loại vi sinh vật có hại gây tổn thất lớn cho loại nông sản trước sau thu hoạch, tổn thất nấm mốc gây chiếm phần đáng kể Ngoài việc gây tổn thất chất lượng cảm quan, dinh dưỡng, tổn thất khối lượng, nấm mốc sinh độc tố có tính chất nguy hiểm đến sức khỏe người, động vật ảnh hưởng tới kinh tế Nấm mốc phát triển lương thực, thực phẩm sử dụng chất dinh dưỡng hạt protein, lipid, gluxid…đồng thời tiết độc tố Độc tố Aflatoxin dòng nấm Aspegillus tạo độc tố nguy hiểm thường nhiễm nông sản gây độc cho người gia súc Độc tố Aflatoxin chia thành nhiều nhóm B, M, G Aflatoxin tác nhân gây phá huỷ gan, xơ gan, ung thư gan cách cấp tính kinh niên người (cũng động vật nhạy cảm), gây dị tật thai nhi phụ nữ mang thai, rối loạn dinh dưỡng suy dinh dưỡng, thiếu protein; còi cọc, chậm phát triển trẻ em Aflatoxin nhiễm thức ăn bò tạo thành sản phẩm chuyển hoá sữa có độc tính cao Aflatoxin M1 Aflatoxin M2 Nguyễn Quỳnh Trang Luận văn Thạc sĩ khoa học Aflatoxin M1 hợp chất chuyển hoá Aflatoxin B1 (chất có độc tính mạnh nhất) có khả xâm nhập vào ADN Điều đặc biệt nguy hiểm cho sức khoẻ người tiêu dùng người già trẻ em đối tượng tiêu thụ sữa lớn Xuất phát từ thực tế thức ăn cho gia súc đặc biệt thức ăn cho loài gia súc sinh sữa thường ẩm mốc chứa hàm lượng lớn Aflatoxin, dẫn đến sữa chứa hàm lượng Aflatoxin M1 có độc tính cao, gây nguy hiểm cho sức khỏe người dùng, mà đặc biệt trẻ em, tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Nghiên cứu phương pháp xác định nhanh Aflatoxin M1 sữa” với mục tiêu sau: - Xây dựng test thử định tính nhanh Aflatoxin M1 sản phẩm sữa - Định lượng lượng Aflatoxin M1 có sản phẩm Nguyễn Quỳnh Trang Luận văn Thạc sĩ khoa học PHẦN TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu Aflatoxin 1.1.1 Aflatoxin gì? [1][2] Aflatoxin (AF) nhóm độc tố vi nấm sinh bởi: chủng nấm mốc Aspegillus flavus, A.parasiticus A.nomius Bào tử chủng nấm mốc nhiễm vào trồng phát triển sinh độc tố vi nấm thời kỳ sinh trưởng hay trình phơi sấy khô bảo quản sau thu hoạch Những điều kiện khắc nghiệt hạn hán, côn trùng tàn phá gió xoáy, mưa dầm, thu hoạch chậm, phơi sấy không kịp thời có độ ẩm cao, thiếu phương tiện bảo quản khoa học yếu tố thuận lợi cho xâm nhập nấm mốc sinh hàm lượng AF cao thực phẩm Hình 1.1: Aspegillus parasiticus Nguyễn Quỳnh Trang Hình 1.2: Aspegillus flavus Luận văn Thạc sĩ khoa học Các đối tượng lương thực, thực phẩm dễ bị nhiễm AF là: - Các thực phẩm giàu tinh bột: lạc, ngô, gạo, bột mì sản phẩm chế biến - Các loại hạt có dầu khác: hạt hướng dương, hạt dưa, bí ngô, hạt điều, đậu tương, cám gạo - Các loại sữa sản phẩm chế biến từ sữa - Thức ăn gia súc 1.1.2 Cấu tạo AF có nhiều loại có kiểu cấu trúc khác nhau, đố đặc biệt ý đến loại AF B1, B2, G1, G2 Đó loại AF xuất phổ biến tự nhiên môi trường nuôi cấy AF G1 G2 tương ứng dẫn xuất dihydroxyl AF B1 B2 Trong sữa loại gia sức, AF B1 B2 chuyển hóa thành AF M1 M2 AF B1 độc tố nguy hiểm loại AF, với lượng nhỏ (0,03ppm) AF khô lạc gây u gan Tiếp theo AF G1, B2 G2 tồn nồng độ thấp Về mặt cấu tạo, coi AF B1 hợp chất mẹ, AF M1 M2 chất trao đổi hydroxylat hóa B1 B2 theo thứ tự hình 1.3 Nguyễn Quỳnh Trang Luận văn Thạc sĩ khoa học Hình 1.3 Công thức cấu tạo Aflatoxin 1.1.3 Tính chất hóa lý AF tinh thể màu trắng, có khả phát quang mạnh ánh sáng cực tím (λ = 360nm) Dựa vào tính chất cho phép phát hợp chất AF nồng độ thấp (0,5ng hay thấp vết sắc ký mỏng), sở để phân tích định đính định lượng AF phương pháp hóa lý Nguyễn Quỳnh Trang Luận văn Thạc sĩ khoa học AF hòa tan tốt dung môi phân cực nhẹ chloroform methanol, đặc biệt dimetyl sulfoxit dung môi sử dụng phương tiện việc đưa AF vào thể động vật Độ hòa tan nước dao động từ 10- 20 mg/l Các AF bền nhiệt độ cao, không bị phân hủy đun nóng thông thường mà bị phân hủy hấp 1200C 30 phút Do tồn thực phẩm nấm mốc bị tiêu diệt trình xử lý nhiệt Tuy nhiên để môi trường không khí, đăc biệt có tia tử ngoại, AF lại tương đối không bền AF bền vững dung môi chloroform, benzene giữ điều kiện tối nhiệt độ thấp Các AF có thẻ bị phá hủy hoàn toàn việc xử lý mạnh amoniac hypoclorit Sự có mặt vòng lacton phân tử AF làm chúng nhạy cảm với việc thủy phân môi trường kiềm, đặc tính quan trọng chế biến thực phẩm xử lý kiềm làm giảm nhiễm AF sản phẩm thực phẩm Tuy nhiên sau trình xử lý kiềm mà có axit hóa làm phản ứng ngược lại để tạo AF Các AF bền với enzyme tiêu hóa, AF B1 phân tử mỡ có trọng lượng phân tử thấp, dễ dàng hấp thụ sau ăn Sự chuyển hóa AF B1 đường tiêu hóa nhờ hoạt động tương tác protein niêm mạc ống tiêu hóa tạo sản phẩm AF B1- epoxie, AF B1- dihydrodio AF B2α AF B1 sản phẩm chuyển hóa tiết qua đường qua mật, sữa nước tiểu (sản phẩm AF B1 qua sữa AF M1) Người ta dã xác định có tương quan tuyến tính AF B1 ăn vào lượng AF M1 sữa Lượng AF M1 sữa nước tính khoảng 1% lượng AF B1 ăn vào Nguyễn Quỳnh Trang Luận văn Thạc sĩ khoa học 1.1.4 Phân loại Aflatoxin [3] Đến có 16 cấu trúc hoá học gần AF xác định song song với độc tính chúng Dựa tính chất lý hoá tính độc khác nhau, AF chia thành nhiều nhóm:  Nhóm B: Aflatoxin B1 (AF B1), Aflatoxin B2 (AF B2) tạo Aspergillus flavus A.paraciticus , phát màu huỳnh quang, xanh lơ thẫm  Nhóm G: Aflatoxin G1(AF G1), Aflatoxin G2 (AF G2) tạo A.parasiticus, có màu xanh  Nhóm M: Aflatoxin M1 (AF M1), Aflatoxin M2 (AF M2)  Nhóm P1 Q1 Các loại AF khác biệt hoá học không nhiều khác biệt độc tính lớn Trong AF B1 chất có tính độc Năm 1988, tổ chức quốc tế nghiên cứu ung thư IARC đưa AF B1 vào danh sách hợp chất gây ung thư gan nguy hiểm Sự khác nhóm B1và G1 chỗ có thêm vòng Cyclopentanon nhóm G Còn AF B2, G2 dẫn chất khử hydro tương ứng AF B1 G1 AF B1, G1 có khả gây ung thư cao nhiều so với AF B2 AF G2 AFB1, B2 nhiễm thức ăn bò tạo thành sản phẩm chuyển hoá sữa có độc tính cao có tên thứ tự AFM1 AFM2 Nguyễn Quỳnh Trang Luận văn Thạc sĩ khoa học 1.1.5 Tính chất độc hại Aflatoxin [4] Độc tố AF bền vững, nhiệt độ nấu nướng thông thường phân huỷ AF, tồn nhiệt độ 2600C Do đó, nhiễm độc tố AF không gây thiệt hại đơn mặt kinh tế, mà tác hại lớn ảnh hưởng đến sức khoẻ người tiêu dùng, tác động nguy hiểm đến người không chất độc hại có nguồn gốc hoá học khác Trong tất loại độc tố nấm mốc AF độc tố nguy hiểm nhất, nồng độ giới hạn WHO quy định có thực phẩm 5ppb, có sữa 0,5 ppb (theo QCVN 8-1:2011/BYT) Các kết thí nghiệm cho thấy AF liên kết với DNA nhân tế bào (một phân tử gam AF có mối liên kết với 600 phân tử DNA) gây ức chế enzyme polymerase RNA Mặt khác, tác dụng hạn chế tổng hợp RNA tác dụng ức chế polymerase t-RNA nguyên nhân làm giảm sút tổng hợp protein tế bào Người ta chứng minh vòng α, β- lacton không bão hòa có phân tử AF làm cho hoạt chất có hoạt tính gây ung thư vòng lacton gây ức chế tổng DNA nhân tế bào làm rối loạn tăng trưởng bình thường tế bào [5] Bệnh nhiễm độc tố vi nấm (Aflatoxicosis) tiêu thụ thực phẩm bị nhiễm AF AF vào thể, thực nhiều phản ứng chuyển hoá gan tạo thành hợp chất trung gian có độc tính khác Độc tính AF động vật thí nghiệm gây loạt triệu chứng cấp tính mãn tính Nhiễm độc cấp thường biểu chết động vật thí nghiệm với triệu chứng hoại tử nhu mô gan, chảy máu gan viêm cầu thận cấp Nhiễm độc mãn tính thường biểu ăn ngon, chậm lớn, gan tụ máu, chảy máu hoại tử nhu mô Loại mãn tính tác động tới yếu tố di truyền tương ứng với kiểu gây ung thư, quái thai đột biến Nguyễn Quỳnh Trang 10 Luận văn Thạc sĩ khoa học Kết phản ứng đổi mầu dung dịch phân tích chứa phức hệ aptamer-Au trình bày hình 3.2 sau: Hình 3.2: Sự đổi mầu dung dịch sữa có chứa AFM1 phân tích Mẫu số số mẫu phân tích chứa AFM1 với nồng độ tương ứng 0,25 0,5 ppb có đổi từ mầu đỏ thẫm sang màu xanh Mẫu số tương ứng mẫu nước mẫu đệm PBS sử dụng làm đối chứng âm, mẫu số mẫu sữa tiệt trùng không chứa AFM1 mẫu sữa sử dụng để pha AFM1 với nồng độ 0,25 0,5 ppb Phương pháp ELISA xác định AFM1 mức 0,25 ppb [9], thời gian ủ 150 phút phương pháp định tính AFM1 dựa kết phản ứng đổi mầu dung dịch phân tích chứa phức hệ aptamer-Au có thời gian ủ ngắn (120 phút) xác định AFM1 mức tương đương (0,25 ppb) 3.2 Kết phân tích định lượng AFM1 sữa phương pháp điện hóa sử dụng aptamer 3.2.1 Phổ đồ điện hóa So sánh kết thu với tín hiệu thu quét điện cực Au chưa gắn SH-DNA đo trước điều kiện đo trình bày Nguyễn Quỳnh Trang 41 Luận văn Thạc sĩ khoa học Duong Von - Ampe dung dich Fero/Feri vs Ag/AgCl - v =200mV/s 80 60 40 i / A 20 -20 -40 Au Au-DNA tngam=2h Au-DNA tngam=5h -60 -80 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 E / V vs.Ag/AgCl Hình 3.3: Phổ đồ điện hóa Kết Hình 3.3 cho thấy tín hiệu dòng đỉnh dung dịch Fero/Feri cyanua điện cực Au sau ngâm gắn SH-DNA đến giảm dần hiệu đỉnh đỉnh oxi hóa khử tăng lên thời gian ngâm tăng Điện cực làm việc ∆Ep (V) Ipa (uA) - Ipc(uA) Au 0.307 65.11 73.91 Au-DNA 2h 0.312 47.95 68.35 Au-DNA 5h 0.690 20.02 56.67 Bảng 3.1 Tín hiệu dòng đỉnh (peak) điện cực vàng Nguyễn Quỳnh Trang 42 Luận văn Thạc sĩ khoa học Mẫu sữa thêm chuẩn sử dụng phân tích có nồng độ aflatoxin M1 thêm vào giá trị nồng độ 0,25 ppb, 0,5ppb Các mẫu sữa sau ủ phức hệ Au-Aptamer Khi ủ điện cực vàng gắn Aptamer tín hiệu dòng peak thu Bảng 3.2 Điện cực làm việc Thế đỉnh oxi hóa Epa(V) Thế đỉnh khử Epc(V) Hiệu đỉnh Ep(V) Dòng đỉnh oxi hóa Ipa(A) Dòng đỉnh khử Au 0,3090 0,1939 0,1151 20,9580 17,736 Au-Apt 0,3514 0,0454 0,3060 10,5536 4,8200 0,4787 0,1363 0,3424 6,4810 7,8540 Au-Apt-Sữa 0,25 ppb AFM1 0,4780 0,0879 0,3901 5,0680 3,2760 Au-Apt-Sữa 0,5 ppb AFM1 0,6120 0,1424 0,4696 4,6940 2,5960 Au-Apt-Sữa ppb AFM1 -Ipc(A) Bảng 3.2 Tín hiệu dòng đỉnh (peak) ủ điện cực vàng gắn Aptamer Ep(V) Ep(V) Hình 3.4: Hiệu đỉnh gắn Aptamer lên điện cực vàng Nguyễn Quỳnh Trang 43 Luận văn Thạc sĩ khoa học Ep(V) Hình 3.5: So sánh dòng đỉnh khử dòng đỉnh oxi hóa Trong đó: - Epa : Thế đỉnh oxi hóa - Ep=Epa - Epc : Hiệu đỉnh; - Epc : Thế đỉnh khử; - Ipa : Dòng đỉnh oxi hóa; - Ipc: Dòng đỉnh khử 3.2.2 Phương trình Hồi quy tuyến tính điện trở kháng EIS nồng độ Aflatoxin M1 Hệ số tương quan (r) số thống kê đo lường mối liên hệ tương quan hai biến số Hệ số tương quan có giá trị từ -1 đến Hệ số tương quan (hay gần 0) có nghĩa biến số liên hệ với nhau; ngược lại hệ số -1 hay có nghĩa hai biến số có liên hệ tuyệt đối Nếu giá trị hệ số tương Nguyễn Quỳnh Trang 44 Luận văn Thạc sĩ khoa học quan âm (r0) có nghĩa x tăng cao y tăng cao, x giảm y giảm theo Thực có nhiều hệ số tương quan thống kê, hệ số tương quan thông dụng hệ số tương quan Pearson r, Spearman ρ Kendall τ Hệ số tương quan Pearson r Cho hai biến số x y từ n mẫu, hệ số tương quan Pearson r ước tính công thức: n ∑(xi – x )(yi - y) r= √ i =1 (1) n n i =1 i =1 ∑(xi – x) 2∑ (yi - y) Trong đó, Ẍ Ȳ giá trị trung bình biến số x y Để xây dựng phương trình tương quan tuyến tính phổ trở kháng điện hóa (Electrochemical Impedance Spectroscopy, EIS) nồng độ aflatoxin M1 tính toán EIS sở sử dụng giá trị quét vòng (CV) Nguyễn Quỳnh Trang 45 Luận văn Thạc sĩ khoa học Điện cực làm Nồng độ Điện trở kháng (Ẍ việc chuyên AFM1 EIS (Y) Xi)2 biến với (X) (Ȳ -Yi) (Ẍ -Xi)(Ȳ - (Ẍ -Xi)2(Ȳ Yi) Yi)2 Au 0,005491936 0,0225 0,002244376 0,007106 227 5,04985E05 Au-Apt 0,028994845 0,0225 0,000569869 0,003580 79 1,28221E05 Au-Apt-Sữa 0,0 ppb 0,052831353 AFM1 0,0225 1,25516E-09 5,31424E -06 2,82412E-11 Au-Apt-Sữa 0,25 ppb 0,076973165 0,25 AFM1 0,01 0,000581118 0,002410 638 5,81118E-06 Au-Apt-Sữa 0,5 ppb 0,100042608 0,5 AFM1 0,1225 0,002225559 0,016511 539 0,00027263 Tổng cộng 0,2 0,029614 509 0,00112418 0,264333907 0,75 0,005620923 Bảng 3.3: Giá trị quét vòng Trong đó: Au: hạt nano vàng; Apt: aptmaer đặc hiệu Aflatoxin M1, sữa với nồng độ aflatoxin M1 xác định Nguyễn Quỳnh Trang 46 Luận văn Thạc sĩ khoa học Kết giá trị tương quan xác định theo công thức (1) r = 0,883 Điều cho thấy khoảng nồng độ từ 0,1 ppb AFM1 điện trở kháng lại trình truyền điện tích điện cực có tương quan mạnh Vì theo lý thuyết thống kê nếu:  r = +1: tương quan hoàn toàn đồng biến;  r = -1: tương quan hoàn toàn nghịch biến; /r/ gần 1, tương quan mạnh (0,8