Nghiên cứu phương pháp xác định một số nitrosamin trong thịt nướng bằng sắc ký khí khối phổ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN KHÁNH VY NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ NITROSAMIN TRONG THỊT NƯỚNG BẰNG SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2018 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN KHÁNH VY MÃ SINH VIÊN: 1301482 NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ NITROSAMINE TRONG THỊT NƯỚNG BẰNG SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Trần Cao Sơn TS Đặng Thị Ngọc Lan Nơi thực hiện: Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia HÀ NỘI – 2018 LỜI CẢM ƠN Khóa luận thực hoàn thành Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc Gia, 65 Phạm Thận Duật, Mai Dịch, Cầu Giấy, Hà Nội Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn TS Trần Cao Sơn TS Đặng Thị Ngọc Lan giao đề tài, tận tình hướng dẫn, góp ý giúp đỡ em thực khóa luận Em xin gửi lời cám ơn tới ThS Bùi Cao Tiến nhiệt tình hướng dẫn em trình hồn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn thầy mơn Hóa phân tích, trường Đại học Dược Hà Nội nhiệt tình dạy dỗ, cung cấp cho em kiến thức cần thiết, quan trọng bổ ích Đồng thời, em xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, TS Trần Cao Sơn cán khoa Độc học dị nguyên, Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia tạo điều kiện giúp e hoàn thành đề tài Cuối cùng, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới bố mẹ, gia đình bạn bè bên quan tâm, động viên em suốt thời gian qua Trong trình thực đề tài, trình độ lý luận kinh nghiệm thực tiễn hạn chế nên khóa luận khơng thể tránh khỏi thiếu sót, mong nhận góp ý q thầy bạn sinh viên Em xin chân thành cám ơn! Hà Nội, ngày 17 tháng 05 năm 2018 Sinh viên Trần Khánh Vy i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ vii ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu nitrosamin 1.1.1 Công thức cấu tạo nitrosamin 1.1.2 Sự tạo thành nitrosamin 1.1.3 Tính chất hóa lý nitrosamin .3 1.1.4 Độc tính 1.1.5 Nitrosamin thực phẩm 1.1.6 Quy định hành nitrosamin 1.2 Phương pháp xác định nitrosamin thực phẩm 1.2.1 Phương pháp xử lý mẫu 1.2.1.1 Chưng cất .5 1.2.1.2 Chiết lỏng – lỏng 1.2.1.3 Vi chiết pha rắn (SPME) 1.2.1.4 Chiết pha rắn (SPE) 1.2.1.5 Kỹ thuật QuEChERS 1.2.2 Phương pháp phân tích 1.2.2.1 Sắc ký lỏng 1.2.2.2 Sắc ký khí .9 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .12 2.1 Đối tượng nghiên cứu 12 ii 2.2 Nội dung nghiên cứu 12 2.2.1 Nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời số nitrosamin sản phẩm thịt nướng 12 2.2.1.1 Khảo sát điều kiện xác định nitrosamin GC-MS/MS 12 2.2.1.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 12 2.2.2 Thẩm định phương pháp xác định đồng thời số nitrosamin sản phẩm thịt nướng 12 2.2.3 Sơ đánh giá hàm lượng nitrosamin số sản phẩm thịt nướng địa bàn Hà Nội 13 2.3 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất .13 2.3.1 Thiết bị 13 2.3.2 Dụng cụ 13 2.3.3 Hóa chất, chất chuẩn 13 2.3.4 Pha dung dịch chuẩn 14 2.3.4.1 Dung dịch chuẩn hỗn hợp nitrosamin 10 µg/mL µg/mL 14 2.3.4.2 Dung dịch nội chuẩn gốc 1000 µg/mL 14 2.3.4.3 Dung dịch nội chuẩn 10 µg/mL µg/mL .14 2.3.4.4 Dung dịch chuẩn làm việc 14 2.4 Phương pháp nghiên cứu 15 2.4.1 Quy trình xử lý mẫu .15 2.4.2 Phương pháp phân tích GC-MS/MS .17 2.4.3 Phương pháp thẩm định 17 2.4.3.1 Tính chọn lọc 17 2.4.3.2 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 17 2.4.3.3 Khoảng tuyến tính đường chuẩn 17 2.4.3.4 Độ lặp lại độ thu hồi 18 2.4.4 Phương pháp xử lý kết 18 iii 2.4.5 Phương pháp lấy mẫu 18 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19 3.1 Nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời số nitrosamin thịt nướng 19 3.1.1 Khảo sát điều kiện GC-MS/MS .19 3.1.1.1 Điều kiện MS/MS 19 3.1.1.2 Điều kiện GC 20 3.1.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu .22 3.1.2.2 Khảo sát phương pháp chiết .24 3.1.2.3 Khảo sát thời gian chiết 25 3.1.2.4 Khảo sát bột làm 26 3.1.2.5 Khảo sát khối lượng bột làm 26 3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng 28 3.2 Thẩm định phương pháp 29 3.2.1 Tính chọn lọc 29 3.2.1.1 Tính số điểm Index Period 29 3.2.1.2 Tỷ lệ ion .29 3.2.1.3 Phân tích mẫu trắng, mẫu chuẩn mẫu thêm chuẩn 30 3.2.2 3.2.3 3.2.4 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 31 Khoảng tuyến tính đường chuẩn 32 Độ lặp lại độ thu hồi 34 3.3 Sơ đánh giá hàm lượng nitrosamin số sản phẩm thịt nướng địa bàn Hà Nội 37 3.4 Bàn luận 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .40 TÀI LIỆU THAM KHẢO .1 PHỤ LỤC iv DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt ACN AOAC Giải nghĩa Acetonitril Association of Official Analytical Communities (Hiệp hội cộng đồng phân tích thức) CE Collision energy (Năng lượng va chạm) CI Chemical ionization (Ion hóa hóa học) DCM Dichloromethan d-SPE Dispersive solid phase extraction (Chiết pha rắn phân tán) EI GC-MS/MS LC-MS/MS Electron impact (va chạm electron) Gas chromatography tandem mass spectrometry (Sắc ký khí khối phổ hai lần) Liquid chromatography tandem mass spectrometry (Sắc ký lỏng khối phổ hai lần) LOD Limit of Detection (Giới hạn phát hiện) LOQ Limit of Qualification (Giới hạn định lượng) ME Matrix effect (Ảnh hưởng nền) NDMA N-Nitroso dimethyl amine NDPA N-Nitroso dipropyl amine NDPhA N-nitroso diphenyl amine IP PSA QuEChERS Identification point (Điểm nhận dạng) Primary secondary amine (amin bậc 2) Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe (Nhanh, dễ, rẻ, hiệu quả, ổn định, an toàn) SPE Solid phase extraction (Chiết pha rắn) TEA Thermal energy analyser (Bộ phân tích lượng nhiệt) v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số nitrosamin thường gặp Bảng 1.2 Một số thực phẩm thường có chứa nitrosamin Bảng 1.3 Quy định hàm lượng nitrosamin nước uống Bảng 1.4 So sánh số nghiên cứu chiết nitrosamin kỹ thuật QuEChERS Bảng 1.5 Tóm tắt số nghiên cứu xác định nitrosamin GC-MS/MS…… 11 Bảng 2.1 Các nitrosamin sử dụng nghiên cứu………………………….12 Bảng 2.2 Pha dung dịch chuẩn làm việc…………………………………………….15 Bảng 3.1 Các điều kiện MS/MS phân tích nitrosamin 19 Bảng 3.2 Chương trình nhiệt độ xác định nitrosamin 21 Bảng 3.3 Tỷ lệ ion sai số cho phép 29 Bảng 3.4 Khoảng làm việc độ chệch 34 Bảng 3.5 Độ lặp lại độ thu hồi NDMA 34 Bảng 3.6 Độ lặp lại độ thu hồi NDPA 34 Bảng 3.7 Độ lặp lại độ thu hồi NDPhA 36 Bảng 3.8 So sánh độ lặp lại phương pháp với tiêu chuẩn AOAC 36 Bảng 3.9 So sánh độ thu hồi phương pháp với tiêu chuẩn AOAC 37 Bảng 3.10 Kết phân tích mẫu thực tế 37 Bảng 3.11 Tóm tắt kết phân tích mẫu thực 39 vi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo chung nitrosamin Hình 2.1 Quy trình chiết mẫu dự kiến 16 Hình 3.1 Sắc ký đồ phân tích nitrosamin với cột DB5-MS cột DB1701 20 Hình 3.2 Sắc ký đồ tổng ion (TIC) nitrosamin nghiên cứu 21 Hình 3.3 Sắc ký đồ nitrosamin dung môi ACN ACN:DCM (1:1/v:v) 22 Hình 3.4 Tóm tắt quy trình xử lý mẫu dự kiến số yếu tố cần khảo sát 23 Hình 3.5 Khảo sát ảnh hưởng muối chiết 24 Hình 3.6 Khảo sát ảnh hưởng phương pháp chiết 25 Hình 3.7 Khảo sát ảnh hưởng thời gian chiết 25 Hình 3.8 Khảo sát ảnh hưởng bột làm 26 Hình 3.9 Khảo sát ảnh hưởng khối lượng bột làm 26 Hình 3.10 Quy trình xử lý mẫu tối ưu 27 Hình 3.11 Ảnh hưởng mẫu 29 Hình 3.12 Tỷ lệ ion nitrosamin (mẫu thêm chuẩn mẫu chuẩn) 30 Hình 3.13 Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn mẫu trắng thêm chuẩn 31 Hình 3.14 Sắc ký đồ mẫu thêm chuẩn mức nồng độ LOQ = 0,5 ng/g 32 Hình 3.15 Đường chuẩn nitrosamin nghiên cứu 33 vii ĐẶT VẤN ĐỀ Trong năm trở lại đây, đồ nướng giới trẻ ưa chuộng Một phần chịu ảnh hưởng từ xu hướng ẩm thực Hàn Quốc quan trọng đồ nướng hội tủ nhiều yếu tố thơm – ngon – rẻ Số lượng quán nướng vỉa hè tăng lên với tốc độ chóng mặt Tuy nhiên, đáng buồn theo ước tính, năm Việt Nam có khoảng 7.000 người chuẩn đốn mắc bệnh ung thư, có 5.000 ca tử vong thực phẩm cho ngun nhân gây tình trạng Nitrosamin nhóm hóa chất có khả gây ung thư cho người tiếp xúc với môi trường số loại thực phẩm, có thịt chế biến Để bảo quản, thịt thường tiêm chất bảo quản có chứa muối nitrit, nitrat Amin từ trình phân hủy protein nấu kết hợp với nitrit tạo thành nitrosamin Mức độ tạo thành nitrosamin phụ thuộc vào yếu tố: phương pháp nấu, nhiệt độ, thời gian, nồng độ nitrit/nitrat, quy trình sơ chế, điều kiện bảo quản Vấn đề cấp bách đặt phải kiểm soát hàm lượng nitrosamin sản phẩm chế biến từ thịt, đặc biệt thịt nướng để đảm bảo sức khỏe cho người tiêu dùng Hiện nay, giới có số nghiên cứu phương pháp xác định nitrosamin thực phẩm Tuy nhiên, Việt Nam quan tâm cho vấn đề hạn chế Khóa luận “Nghiên cứu phương pháp xác định số nitrosamin thịt nướng sắc ký khí khối phổ” thực khơng có ý nghĩa mặt khoa học mà có ý nghĩa thực tiễn lớn Mục tiêu khóa luận sau: Xây dựng thẩm định phương pháp xác định đồng thời số nitrosamin thịt nướng Ứng dụng phương pháp để sơ đánh giá hàm lượng nitrosamin số sản phẩm thịt nướng địa bàn Hà Nội [11] EPA (2005), “EPA Method 521: Determination of nitrosamines in drinking water by solid phase extraction and capillary column gas chromatography with large volume injection and chemical ionization tandem mass spectrometry (MS/MS)”, Environmental Protection Agency [12] Fiddler W and Pensabene J W (1996), “Supercritical fluid extraction of volatile N-nitrosamines in fried bacon and its drippings: method comparison”,Journal of AOAC International, 79(4), 895–901 [13] Grebel J E and Suffet I M (2007), “Nitrogen–phosphorus detection and nitrogen chemiluminescence detection of volatile nitrosamines in water matrices: optimization and performance comparison”,Journal of Chromatography A, 1175(1), 141–144 [14] Herrmann S S , Duedahl-Olesen L , and Granby K (2014), “Simultaneous determination of volatile and non-volatile nitrosamines in processed meat products by liquid chromatography tandem mass spectrometry using atmospheric pressure chemical ionisation and electrospray ionisation”,Journal of Chromatography a, 1330, 20–29 [15] Herrmann S S , Duedahl-Olesen L , Granby K (2015),"Occurrence of volatile and non-volatile N-nitrosamines in processed meat products and the role of heat treatment", Food Control, 48, 163−169 [16] Huang M C , Chen H C , Fu S C , and Ding W H (2013), “Determination of volatile N-nitrosamines in meat products by microwave-assisted extraction coupled with dispersive micro solid-phase extraction and gas chromatography–Chemical ionisation mass spectrometry”,Food chemistry, 138(1), 227–233 [17] Jakszyn P and González C A (2006), “Nitrosamine and related food intake and gastric and oesophageal cancer risk: a systematic review of the epidemiological evidence”,World journal of gastroenterology: WJG, 12(27), 4296 [18] Kocak D , Ozel M Z , Gogus F , Hamilton J F , and Lewis A C (2012), “Determination of volatile nitrosamines in grilled lamb and vegetables using comprehensive gas chromatography–Nitrogen chemiluminescence detection”,Food chemistry, 135(4), 2215–2220 [19] Krasner S W , Mitch W A , McCurry D L , Hanigan D , and Westerhoff P (2013), “Formation, precursors, control, and occurrence of nitrosamines in drinking water: a review”,Water research, 47(13), 4433–4450 [20] Krauss M and Hollender J (2008), “Analysis of nitrosamines in wastewater: exploring the trace level quantification capabilities of a hybrid linear ion trap/orbitrap mass spectrometer”,Analytical Chemistry, 80(3), 834–842 [21] Lehotay S J , Sapozhnikova Y , Han L , and Johnston J J (2015), “Analysis of nitrosamines in cooked bacon by QuEChERS sample preparation and gas chromatography–tandem mass spectrometry with backflushing”,Journal of agricultural and food chemistry, 63(47), 10341–10351 [22] McDonald J A , Harden N B , Nghiem L D , and Khan S J (2012), “Analysis of N-nitrosamines in water by isotope dilution gas chromatography–electron ionisation tandem mass spectrometry”,Talanta, 99, 146–154 [23] Ozel M Z , Gogus F , Yagci S , Hamilton J F , and Lewis A C (2010), “Determination of volatile nitrosamines in various meat products using comprehensive gas chromatography–nitrogen chemiluminescence detection”,Food and Chemical Toxicology, 48(11), 3268–3273 [24] Pensabene J W , Fiddler W , Maxwell R J , Lightfield A R , and Hampson J W (1995), “Supercritical fluid extraction of N-nitrosamines in hams processed in elastic rubber nettings”,Journal of AOAC International, 78(3), 744–748 [25] Pérez D M , Alatorre G G , Álvarez E B , Silva E E , and Alvarado J F J (2008), “Solid-phase microextraction of N-nitrosodimethylamine in beer”,Food Chemistry, 107(3), 1348–1352 [26] Qiu Y , Chen J H , Yu W , Wang P , Rong M , and Deng H (2017), “Contamination of Chinese salted fish with volatile N-nitrosamines as determined by QuEChERS and gas chromatography–tandem mass spectrometry”,Food Chemistry, 232, 763–769 [27] Raoul S , Gremaud E , Biaudet H , and Turesky R J (1997), “Rapid solid-phase extraction method for the detection of volatile nitrosamines in food”,Journal of Agricultural and Food Chemistry, 45(12), 4706–4713 [28] Sannino A and Bolzoni L (2013), “GC/CI–MS/MS method for the identification and quantification of volatile N-nitrosamines in meat products”,Food chemistry, 141(4), 3925–3930 [29] Scanlan R A (1983), “Formation and occurrence of nitrosamines in food”,Cancer Research, 43(5), 2435–2440 [30] Sen N P and Seaman S (1981), “Volatile N-nitrosamines in dried foods”,Journal-Association of Official Analytical Chemists, 64(5), 1238–1242 [31] Tricker A R and Preussmann R (1991), “Carcinogenic N-nitrosamines in the diet: occurrence, formation, mechanisms and carcinogenic potential”,Mutation Research/Genetic Toxicology, 259(3–4), 277–289 [32] Yurchenko S and Mölder U (2006), “Volatile N-nitrosamines in various fish products”,Food chemistry, 96(2), 325–333 [33] Yurchenko S and Mölder U (2007), “The occurrence of volatile N-nitrosamines in Estonian meat products”,Food Chemistry, 100(4), 1713–1721 [34] Zeng X , Bai W , Xian Y , Dong H , and Luo D (2016), “Application of QuEChERS-based purification coupled with isotope dilution gas chromatographymass spectrometry method for the determination of N-nitrosamines in soy sauce”,Analytical Methods, 8(26), 5248–5254 [35] Herrmann S S , Duedahl-Olesen L , Granby K (2015),"Occurrence of volatile and non-volatile N-nitrosamines in processed meat products and the role of heat treatment", Food Control, 48, 163−169 PHỤ LỤC PHỤ LỤC I QUY TRÌNH THAO TÁC CHUẨN XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ NITROSAMIN TRONG CÁC SẢN PHẨM THỊT BẰNG SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ HAI LẦN GS-MS/MS Nguyên lý Nitrosamin mẫu chiết kỹ thuật QuEChERS sử dụng muối NH4Cl, làm loại béo n-hexan C18, sau phân tích GC-MS/MS Phạm vi áp dụng Phương pháp áp đụng để xác định hàm lượng nitrosamin mẫu thịt sản phẩm thịt Tài liệu viện dẫn -S J Lehotay, Y Sapozhnikova, L Han, and J J Johnston (2015), “Analysis of nitrosamines in cooked bacon by QuEChERS sample preparation and gas chromatography–tandem mass spectrometry with backflushing”, Journal of agricultural and food chemistry, vol 63, no 47, pp 10341–10351 -Z Zhao, Y Xu, X Liu, X Shi, and Y Lu (2017), “Rapid determination of 10 volatile N-nitrosamines in sour meats by modified QuEChERS and gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry”, Se pu = Chinese journal of chromatography, vol 35, no 10, pp 1086–1093 Định nghĩa Không Thiết bị, dụng cụ 5.1 Thiết bị 5.1.1 Máy sắc ký khí khối phổ hai lần GC-MS/MS (kiểu ba tứ cực) 5.1.2 Cột sắc ký DB-1701 5.1.3 Bể rung siêu âm 5.1.4 Cân phân tích, có độ xác đến 0,1 mg 5.1.5 Máy đồng mẫu 5.1.6 Máy lắc vortex 5.1.7 Máy ly tâm đạt 6000 rpm 13000 rpm phút 5.1.8 Máy 5.2 Dụng cụ 5.2.1 Micropipet 10 – 100 μL, 100-1000 μL, 500 – 5000 μL đầu côn tương ứng 5.2.2 Ống ly tâm 50 mL 5.2.3 Vial 1,8 mL 5.2.4 Bình định mức loại Hóa chất, thuốc thử Tất hóa chất loại tinh khiết phân tích 6.1 Chuẩn mix nitrosamin (NDMA, NDPA, NDPhA) 2000 µg/mL methanol (Dr Ehrenstorfer).Nội chuẩn NDMA-d6 (Dr Ehrenstorfer) 6.2 Nội chuẩn NDMA-d6 (Dr Ehrenstorfer) 6.3 BSTFA (N,O-Bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide) (Sigma tương đương) 6.4 Acetonitril (Merck) 6.5 Dichloromethan (Merck) 6.6 PSA (Agilent) 6.7 C18 (Agilent) 6.8 Hexan (Merck) 6.9 NH4Cl (Merck) 6.10 MgSO4 (Merck) Các bước tiến hành 7.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn Dùng pipet (5.2.1) hút xác 100 µL dung dịch chuẩn gốc (6.1) vào bình định mức (5.2.4) 20 mL, định mức ACN (6.4), thu dung dịch chuẩn hỗn hợp 10 µg/mL Bảo quản nhiệt độ -18oC, sử dụng tháng Dùng pipet hút xác 100 µL dung dịch chuẩn hỗn hợp 10 µg/mL vào vial (5.2.3), thêm 900 µL ACN, lắc đều, thu dung dịch chuẩn hỗn hợp µg/mL Pha sử dụng 7.2 Chuẩn bị dung dịch nội chuẩn 7.2.1 Dung dịch nội chuẩn gốc Cân xác 10 mg nội chuẩn NDMA-d6 (6.2) cân phân tích (5.1.4) vào bình định mức 100 mL (5.2.4), định mức ACN (6.4) thu dung dịch nội chuẩn gốc có nồng độ 100 µg/mL Bảo quản -18oC, sử dụng năm Chú ý: Nồng độ dung dịch nội chuẩn tính tốn theo khối lượng cân thực tế 7.2.2 Dung dịch nội chuẩn trung gian Dùng pipet (5.2.1) hút xác mL dung dịch nội chuẩn gốc (7.2.1) vào bình định mức (5.2.4) 10 mL, định mức ACN (6.4), thu dung dịch nội chuẩn trung gian 10 µg/mL Bảo quản nhiệt độ -18oC, sử dụng tháng 7.3 Chuẩn bị mẫu 7.3.1 Chuẩn bị mẫu sơ Mẫu thịt đồng máy đồng mẫu, tối thiểu kg 7.3.2 Mẫu thử • Cân xác khoảng g mẫu vào ống ly tâm 50 mL • Thêm 50 µL dung dịch nội chuẩn 10 µg/mL để yên khoảng 15 phút • Thêm vào mẫu 10 mL acetonitril : nước (1:1), lắc phút • Thêm 5,5 g NH4Cl, lắc phút, siêu âm 30 phút • Ly tâm 6000 vòng/phút phút • Hút mL pha hữu phía sang ống ly tâm 15 mL có chứa hỗn hợp muối gồm 300 mg MgSO4 + 100 mg C18 mL n-hexan bão hòa ACN • Lắc ly tâm 6000 vòng/phút phút Dùng pipet pasteur loại bỏ lớp nhexan • Hút 0,5 mL lớp ACN vào vial, thêm 0,5 mL DCM, lắc • Phân tích GC-MS/MS 7.3.3 Mẫu trắng Sử dụng mẫu thịt xác định không chứa nitrosamin Tiến hành tương tự với mẫu thử 7.3.4 Mẫu kiểm sốt Sử dụng mẫu trắng, thêm 10 µL dung dịch chuẩn µg/mL để yên 15 phút Tiến hành tương tự với mẫu thử Nồng độ thêm chuẩn mẫu 20 ng/g 7.4 Điều kiện sắc ký 7.4.1 Điều kiện GC • Cột sắc ký DB-1701 • Khí mang: Helium, tốc độ mL/min • Injector: 250oC, splitless Th tớch bm àL Transferline: 260oC • Chương trình nhiệt độ Tốc độ Nhiệt độ o Thời gian giữ Tổng thời gian C (min) (min) 50 1 o C/min (Ban đầu) Tăng nhiệt 10 160 12 Tăng nhiệt 30 250 16 7.4.2 Điều kiện MS • Detector MS/MS • Chế độ theo dõi MRM Chất phân Ion mẹ tích (m/z) Định lượng Xác nhận Ion CE Ion CE (m/z) (eV) (m/z) (eV) NDMA 74 44 42 NDMA-d6 80 50 48 NDPA 130 113 43 10 NDPhA 169 168 20 66 10 Tính toán kết Từ kết thực nghiệm, hàm lượng nitrosamin tính theo cơng thức sau: X (µg/kg) = Cx.V /m Trong đó: Cx: Là nồng độ nitrosamin dịch chiết tính theo đường chuẩn (ng/mL) V : Thể tích dịch chiết cuối (10 mL) m: Khối lượng mẫu cân ban đầu (~ g) Kiểm soát chất lượng Độ thu hồi mẫu kiểm soát phải nằm khoảng từ 80-110% 10 Biểu mẫu kèm theo H.BM.QT.476: Xác định đồng thời số nitrosamin sản phẩm thịt sắc ký khí khối phổ hai lần GC-MS/MS PHỤ LỤC II Sắc đồ mẫu lặp lại NDMA Sắc đồ mẫu lặp lại NDPA Sắc đồ mẫu lặp lại NDPhA Sắc ký đồ ảnh hưởng muối chiết x10 6.5 NDMA + TIC MRM NH4Cl-72889 + TIC MRM MgSO4l-75914 + TIC MRM NH4)2CO3-81614 5.5 4.5 3.5 2.5 1.5 0.5 800 850 900 Counts vs Acquisition Time (scans) 950 x10 1050 1100 1150 NDPA 2.8 1000 + TIC MRM (** -> **) NH4Cl-31010 2.6 + TIC MRM (** -> **)MgSO4-21525 2.4 + TIC MRM (** -> **)(NH4)2CO3-29245 2.2 1.8 1.6 1.4 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 9.3 x10 9.35 9.4 9.45 Counts vs Acquisition Time (min) 9.5 9.55 9.6 3.6 NDPhA 3.4 3.2 + TIC MRM (** -> **) NH4Cl-406501 2.8 + TIC MRM (** -> **)MgSO4-299824 2.6 + TIC MRM (** -> **)(NH4)2CO3-368385 2.4 2.2 1.8 1.6 1.4 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 14.9 14.95 Counts vs Acquisition Time (min) 15 15.05 9.65 Sắc ký đồ ảnh hưởng phương pháp chiết x10 + TIC MRM sieuam-75018 NDMA 6.5 + TIC MRM lac ngang-72889 5.5 4.5 3.5 2.5 1.5 0.5 600 x10 3.2 800 Counts vs Acquisition Time (scans) + TIC MRM sieuam-31150 1000 1200 1400 NDPA + TIC MRM lac ngang-31010 2.8 2.6 2.4 2.2 1.8 1.6 1.4 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 9.35 x10 3.6 3.4 9.4 9.45 Counts vs Acquisition Time (min) + TIC MRM sieuam-402260 9.5 9.55 9.6 9.65 NDPhA + TIC MRM lac ngang-406501 3.2 2.8 2.6 2.4 2.2 1.8 1.6 1.4 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 14.9 14.95 Counts vs Acquisition Time (min) 15 15.05 Sắc ký đồ ảnh hưởng thời gian chiết x10 + TIC MRM sieuam-75018 NDMA 6.5 + TIC MRM lac ngang-72889 5.5 4.5 3.5 2.5 1.5 0.5 600 x10 3.2 800 Counts vs Acquisition Time (scans) + TIC MRM sieuam-31150 1000 1200 1400 NDPA + TIC MRM lac ngang-31010 2.8 2.6 2.4 2.2 1.8 1.6 1.4 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 9.35 x10 3.6 3.4 9.4 9.45 Counts vs Acquisition Time (min) + TIC MRM sieuam-402260 9.5 9.55 9.6 9.65 NDPhA + TIC MRM lac ngang-406501 3.2 2.8 2.6 2.4 2.2 1.8 1.6 1.4 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 14.9 14.95 Counts vs Acquisition Time (min) 15 15.05 Sắc ký đồ ảnh hưởng bột làm x10 + TIC MRM sieuam-75018 NDMA 6.5 + TIC MRM lac ngang-72889 5.5 4.5 3.5 2.5 1.5 0.5 600 x10 3.2 800 Counts vs Acquisition Time (scans) + TIC MRM sieuam-31150 1000 1200 1400 NDPA + TIC MRM lac ngang-31010 2.8 2.6 2.4 2.2 1.8 1.6 1.4 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 9.35 x10 3.6 3.4 9.4 9.45 Counts vs Acquisition Time (min) + TIC MRM sieuam-402260 9.5 9.55 9.6 9.65 NDPhA + TIC MRM lac ngang-406501 3.2 2.8 2.6 2.4 2.2 1.8 1.6 1.4 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 14.9 14.95 Counts vs Acquisition Time (min) 15 15.05 Sắc ký đồ ảnh hưởng lượng bột làm x10 + TIC MRM sieuam-75018 NDMA 6.5 + TIC MRM lac ngang-72889 5.5 4.5 3.5 2.5 1.5 0.5 600 x10 3.2 800 Counts vs Acquisition Time (scans) + TIC MRM sieuam-31150 1000 1200 1400 NDPA + TIC MRM lac ngang-31010 2.8 2.6 2.4 2.2 1.8 1.6 1.4 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 9.35 x10 3.6 3.4 9.4 9.45 Counts vs Acquisition Time (min) + TIC MRM sieuam-402260 9.5 9.55 9.6 9.65 NDPhA + TIC MRM lac ngang-406501 3.2 2.8 2.6 2.4 2.2 1.8 1.6 1.4 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 14.9 14.95 Counts vs Acquisition Time (min) 15 15.05 Sắc đồ mẫu thực (dương tính với NDMA) Sắc đồ mẫu thực (dương tính với NDPhA) ... HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN KHÁNH VY MÃ SINH VIÊN: 1301482 NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ NITROSAMINE TRONG THỊT NƯỚNG BẰNG SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS... luận Nghiên cứu phương pháp xác định số nitrosamin thịt nướng sắc ký khí khối phổ thực khơng có ý nghĩa mặt khoa học mà có ý nghĩa thực tiễn lớn Mục tiêu khóa luận sau: Xây dựng thẩm định phương. .. nướng thịt gia cầm nướng mua địa bàn Hà Nội 2.2 Nội dung nghiên cứu 2.2.1 Nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời số nitrosamin sản phẩm thịt nướng 2.2.1.1 ❖ Khảo sát điều kiện xác định nitrosamin