Xây dựng phương pháp xác định ciprofloxacin và ofloxacin trong nước thải bằng sắc ký lỏng khối phổ

1 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ LOAN XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CIPROFLOXACIN VÀ OFLOXACIN TRONG NƯỚC THẢI BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2015 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ LOAN XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CIPROFLOXACIN VÀ OFLOXACIN TRONG NƯỚC THẢI BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. DS.Lê Xuân Kỳ 2. DS.Nguyễn Thị Hạnh Nơi thực hiện : Viện công nghệ dược phẩm quốc gia HÀ NỘI – 2015 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên em xin chân thành cảm ơn DS. Lê Xuân Kỳ, người đã tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện cho em hoàn thành đề tài này. Em xin chân thành cảm ơn DS. Dương Thị Vân, DS. Nguyễn Thị Hạnh đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ và hỗ trợ em hoàn thành khóa luận. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh, người đã tận tình chỉ bảo, đóng góp ý kiến quý báu cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài và viết khóa luận Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Hóa phân tích và Độc chất, Bộ môn Vật lý – Hóa lý – Trường Đại học Dược Hà Nội,Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện cho em thực hiện đề tài. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn chia sẻ, động viên em hoàn thành khóa luận. Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2015 Sinh viên TRẦN THỊ LOAN MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN 3 1.1. NHÓM KHÁNG SINH QUINOLON 3 1.1.1. Vài nét về quinolon 3 1.1.2. Đặc tính của các quinolon nghiên cứu 4 1.2. KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG KẾT NỐI VỚI PHÔI KHÔ 5 1.2.1. Sắc ký lỏng 5 1.2.2. Khối phổ (Mass Spectrometry) 7 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 13 2.2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 13 2.2.1. Hóa chất 13 2.2.2. Thiết bị, dụng cụ 14 2.3. NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.3.1. Nội dung nghiên cứu 14 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu 15 CHƯƠNG 3.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19 3.1. XÂY DỰNG ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH CÁC CHẤT BẰNG LC-MS/MS 19 3.1.1. Khảo sát các điều kiện đo phổ khối 19 3.1.2.Khảo sát điều kiện LC 21 3.1.3. Quy trình phân tích 26 3.2.XỬ LÝ MẪU 28 3.3. ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP 29 3.3.1. Độ thích hợp của hệ thống 29 3.3.2. Tính đặc hiệu của phương pháp 31 3.2.3. Độ tuyến tính 33 3.2.4.Giới hạn định lượng (LOQ), giới hạn phát hiện (LOD) 36 3.2.5. Độ đúng 38 3.2.6. Bàn luận 41 KẾT LUẬN 43 KIẾN NGHỊ 44 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu ACN BP 2010 C18 CIPRO DAD OFLO IS HPLC LC - MS/MS MeOH MS MW ppm ppb LOD LOQ SPE R(%) SD RSD Tiếng Anh Acetonitril The Bristist Pharmacopoeia 2010 Octadecyl carbon chain Diode array detector Internal standard High perform liquid chromatography High perform liquid chromatography – Tandem Mass Spectrometry Methanol Mass Spectrometry Molecular Weight Parts per million Parts per billion Limit of Detection Limit of Quantitation Dispersive Solid Phase Extraction Recovery Standard Deviation Relative Standard Deviation Tiếng Việt Acetontril Dược điển Anh 2010 Gốc octadecyl Ciprofloxacin Detector chuỗi diod Ofloxacin Chuẩn nội Sắc ký lỏng hiệu nâng cao Sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần Methanol Khối phổ Khối lượng phân tử Một phần triệu Một phần tỷ Giới hạn phát hiện Giới hạn định lượng Chiết pha rắn Hiệu suất thu hồi Độ lệch chuẩn Độ lệch chuẩn tương đối DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1.Đặc tính của các quinolon nghiên cứu…………………………………. Error! Bookmark not defined. Bảng 2.1. Danh mục hóa chất- thuốc thử - chất chuẩn 13 Bảng 3.1. Điều kiện phân mảnh của ciprofloxacin, ofloxacin và IS 20 Bảng 3.2. Kết quả sắc ký đồ khảo sát chương trình pha động 22 Bảng 3.3.Điều kiện LC-MS 28 Bảng3.4. Kết quả đánh giá độ thích hợp của hệ thống về thời gian và tỷ số diện tích của kháng sinh so với chuẩn nội 30 Bảng 3.5. Kết quả xác định khoảng nồng độ tuyến tính 34 Bảng 3.6. Giá trị LOD và LOQ của phương pháp 37 Bảng 3.7.Kết quả khảo sát độđúng và độ lặp lại của phương pháp 39 DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Công thức chung quinolon……………………………………………… Error! Bookmark not defined. Hình 1.2. Mô hình đơn giản hệ thống LC-MS 5 Hình 1.3. Mô hình cấu trúc của máy khối phổ MS 7 Hình 1.4. Sơ đồ cấu tạo thiết bị phổ kế tứ cực kiểu chập ba 10 Hình 3.1.Sơ đồ phổ khối của các chất phân tích 20 Hình 3.2. Kết quả sắc ký đồ khảo sát thể tích tiêm mẫu 24 Hình 3.3. Kết quả sắc ký đồ khảo sát tốc độ dòng 26 Hình 3.4.Các sắc ký đồ xác định tính đặc hiệu 33 Hình 3.5.Đồ thị biễu diễn sự phụ thuộc tỉ số diện tích pic (CIPRO/IS) và nồng độ CIPRO (ng/ml) 35 Hình 3.6:.Đồ thị biễu diễn sự phụ thuộc tỉ số diện tích pic (OFLO/SI) và nồng độ OFLO (ng/ml) 36 Hình 3.7.Sắc ký đồ xác định LOQ 38 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Việc sử dụng kháng sinh gia tăng tình trạng kháng kháng sinh đang là hậu quả nghiêm trọng. Bên cạnh một cách ồ ạt, thiếu kiểm soát đang trở thành vấn đề thời sự của ngành y tế, trong đó việc nguyên nhân do việc sử dụng thuốc không hợp lý thì một lý do khác đang được quan tâm là sự tồn tại dư lượng kháng sinh và những chất chuyển hoá của chúng trong môi trườngvì chỉ cần một dư lượng nhỏ kháng sinh thải ra môi trường nhưng sẽ được tích lũy dần dần vào các vi khuẩn gây bệnh, giúp chúng phát triển những gen kháng thuốc. Hướng nghiên cứu về dư lượng thuốc kháng sinh và những chất chuyển hoá cũng như tác động của chúng trong môi trường được bắt đầu từ những năm cuối thập kỉ 90 của thế kỷ 20 và rất được quan tâm tại các nước phát triển. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy rằng sự tồn tại của các kháng sinh và sự đề kháng kháng sinh trong môi trường nước đã trở nên phổ biến. Song song với việc nâng cao chấtlượng chăm sóc và khám chữa bệnh cho nhân dân, lĩnh vực sản xuất thuốc được đặc biệt chú trọng. Hiện cả nước có khoảng gần 200 doanh nghiệp có sản xuất dược phẩm với nhiều sản phẩm thuốc với đủ chủng loại:kháng sinh, thuốc chống viêm, thuốc tim mạch, thuốc bổ và vitamin…Kháng sinh nhóm quinolon có phổ kháng khuẩn rộng trên trực khuẩn Gram (-) và Gram (+), đang được chỉ định rộng rãi trong việc điều trị các bệnh nhiễm khuẩn tại nước ta. Hiện có nhiều nhà máy, xí nghiệp dược đang sản xuất nhóm kháng sinh này với các dạng bào chế khác nhau như: viên nén, viên nang, bột pha hỗn dịch uống…Tuy nhiên việc kiểm soát sự tồn dư kháng sinh nhóm quinolon trong nước thải ở các cơ sở sản xuất này vẫn chưa được quan tâm đúng mức. Tới thời điểm hiện nay, ở Việt Namnghiên cứu xác định dư lượng các kháng sinh trong nước thải đang còn hạn chế chưa có nghiên cứu xác định dư lượng kháng sinh quinolon trong nước thải của cơ sở sản xuất dược. 2 Vì vậy để góp phần kiểm soát nồng độ dư lượng một số kháng sinh nhóm quinolon, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng phương pháp xác định Ciprofloxacin và Ofloxacin trong nước thải bằng sắc ký lỏng khối phổ” với các mục tiêu: 1. Khảo sát lựa chọn điều kiện phân tích (điều kiện sắc ký, điều kiện MS) để xác định Ciprofloxacin và Ofloxacin trong nước thải bằng LC-MS/MS 2. Thẩm định phương pháp định lượng Ciprofloxacin và Ofloxacin trong nước thải [...]... kiện để xây dựng quy trình định lượng Ciprofloxacin, Ofloxacin trong nước bằng phương pháp sắc kí lỏng khối phổ (LCMS/MS)  Thẩm định phương pháp :  Độ thích hợp hệ thống  Độ đặc hiệu của phương pháp  Khoảng tuyến tính  Độ đúng  Giới hạn định lượng, giới hạn phát hiện 15 2.3.2 .Phương pháp nghiên cứu 2.3.2.1 .Phương pháp thu thập và xử lý mẫu Lấy nước thải từ nhà máy sản xuất kháng sinh trong giai... (4:1) Dược Hấp thu nhanh và dễ dàng qua đường tiêu hóa, sinh khả dụng khoảng động 70-95%, phân bố rộng khắp các mô và dịch cơ thể .Thải trừ chủ yếu hoc qua thận, thời gian bán thải từ 3h đến 10h và kéo dài hơn nếu bệnh nhân suy thận 1.2.KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG KẾT NỐI VỚI PHÔI KHÔ Về cơ bản, sắc ký lỏng khối phổ là phương pháp sắc ký lỏng sử dụng bộ phận phát hiện là detector khối phổ. Mô hình đơn giản của... đến pH thích hợp Bảo quản mẫu saukhi lấy ở 2 – 80C và tiến hành phân tích trong 24h về độ dặc hiệu và độ đúng chứng minh nước thải không có kháng sinh Ciprofloxacin và Ofloxacin 2.3.2.2 .Xây dựng các điều kiện sắc ký Tiến hành chạy thử trên từng kháng sinh CIPRO, OFLO, IS và hỗn hợp kháng sinh với IS trong dung môi pha động  Khảo sát điều kiện khối phổ Khảo sát lựa chọn điều kiện nguồn Ion hóa, điều... này phụ thuộc vào đường kính cột và khối lượng chất hấp phụ, người ta thường rửa với tốc độ khoảng 1ml/phút 13 CHƯƠNG2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU - Mẫu trắng: Nước thải ở các cơ sở sản xuất dược có sản xuất kháng sinh nhóm Ciprofloxacin, Ofloxacin không sản xuất các kháng sinh này ít nhất 7 ngày, kiểm tra bằng LC-MS/MS không phát hiện có Ciprofloxacin, Ofloxacin - Các... Chân không Sắc ký lỏng Ion hóa Bộ phận tích khối Detector / Lưu giữ số liệu Hình 1.2 : Mô hình đơn giản hệ thống LC-MS 1.2.1 .Sắc ký lỏng [1] Sắc ký là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động làm chất lỏng. Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch.Khi tiến hành chạy sắc ký ,các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh .Trong hỗn hợp... [1] Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry- MS) là phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong một điện trường hoặc từ trường nhất định Tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) có ảnh hưởng rất lớn đối với chuyển động này của ion Nếu biết được điện tích của ion thì ta dễ dàng xác định. .. × 100 Trong đó: xi là kết quả ở lần xác định thứ i n là số lần xác định Nồng độ dư lượng kháng sinh được tính dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính bậc nhất biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ chất phân tích với hệ số tương quan không nhỏ hơn 0,995 19 CHƯƠNG 3.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1.XÂY DỰNG ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH CÁC CHẤT BẰNG LC-MS/MS 3.1.1 Khảo sát các điều kiện đo phổ khối Qua... các quinolon nghiên cứu Ciprofloxacin. HCl C17H18FN3O3.HCl MW Ofloxacin C18H20FN3O4 367,8 336.1 CTCT HCl Tính Dạng base là bột kết tinh màu vàng Tinh thể hình kim, không màu, chất Nhạt, tan một phần trong H2O (1 chảy ở khoảng 255oC, kém g/25 ml), tan rất ít trong MeOH, rất phân hủy, ít tan trong nước và 5 khó tan trong ethanol Dạng dùng phương ehanol pháp này là muối khan pha trong hỗn hợp dung môi MeOH... nhau và chạy chế độ gradient - Tốc độ dòng: Thay đổi lưu lượng pha động từ 0,1- 0,3 ml/phút để xác định được tốc độ phù hợp cho thời gian tối ưu - Thể tích tiêm mẫu: Thay đổi lưu lượng mẫu từ 1- 5 µl để xác định được thể tích tiêm phù hợp cho sắc ký đồ đẹp, diện tích pic và độ đáp ứng cao 16 2.3.2.3.Đánh giá phương pháp [11], [14]  Tính thích hợp của hệ thống Tiến hành sắc ký 6 lần liên tiếp trong. .. dễ dàng xác định được khối lượng của ion đó được Tránh ion phân tích va chạm với ion trong không khí Chân không cao Nguồn ion Phân tích khối Phổ khối Detector Xử lý và lưu giữ liệu Hình 1.3: Mô hình cấu trúc của máy khối phổ MS 1.2.2.1.Nguyên tắc Sau khi được tách trong hệ thống sắc ký lỏng, mẫu cần phân tích sẽ đi qua một ống dẫn đến đầu dò MS Tại đây diễn ra quá trình ion hóa trong buồng API với kiểu . đề tài: Xây dựng phương pháp xác định Ciprofloxacin và Ofloxacin trong nước thải bằng sắc ký lỏng khối phổ với các mục tiêu: 1. Khảo sát lựa chọn điều kiện phân tích (điều kiện sắc ký, điều. sắc ký, điều kiện MS) để xác định Ciprofloxacin và Ofloxacin trong nước thải bằng LC-MS/MS 2. Thẩm định phương pháp định lượng Ciprofloxacin và Ofloxacin trong nước thải 3 CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN. TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ LOAN XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CIPROFLOXACIN VÀ OFLOXACIN TRONG NƯỚC THẢI BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ