Xây dựng phương pháp xác định ciprofloxacin và ofloxacin trong nước thải bằng sắc ký lỏng khối phổ

Vì vậy để góp phần kiểm soát nồng độ dư lượng một số kháng sinh nhóm quinolon, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng phương pháp xác định Ciprofloxacin và Ofloxacin trong nước thải bằng

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ LOAN

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CIPROFLOXACIN VÀ OFLOXACIN

TRONG NƯỚC THẢI BẰNG SẮC KÝ LỎNG

KHỐI PHỔ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2015

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ LOAN

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CIPROFLOXACIN VÀ OFLOXACIN

TRONG NƯỚC THẢI BẰNG SẮC KÝ LỎNG

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên em xin chân thành cảm ơn DS Lê Xuân Kỳ, người đã tận tình

hướng dẫn và tạo điều kiện cho em hoàn thành đề tài này

Em xin chân thành cảm ơn DS Dương Thị Vân, DS Nguyễn Thị Hạnh đã

nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ và hỗ trợ em hoàn thành khóa luận

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh, người

đã tận tình chỉ bảo, đóng góp ý kiến quý báu cho em trong suốt quá trình thực hiện

đề tài và viết khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Hóa

phân tích và Độc chất, Bộ môn Vật lý – Hóa lý – Trường Đại học Dược Hà

Nội,Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện cho em thực hiện đề

tài

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn chia sẻ, động

viên em hoàn thành khóa luận

Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2015

Sinh viên

TRẦN THỊ LOAN

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN 3

1.1 NHÓM KHÁNG SINH QUINOLON 3

1.1.1 Vài nét về quinolon 3

1.1.2 Đặc tính của các quinolon nghiên cứu 4

1.2 KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG KẾT NỐI VỚI PHÔI KHÔ 5

1.2.1 Sắc ký lỏng 5

1.2.2 Khối phổ (Mass Spectrometry) 7

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 13

2.2 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 13

2.2.1 Hóa chất 13

2.2.2 Thiết bị, dụng cụ 14

2.3 NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.3.1 Nội dung nghiên cứu 14

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu 15

CHƯƠNG 3.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19

3.1 XÂY DỰNG ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH CÁC CHẤT BẰNG LC-MS/MS 19 3.1.1 Khảo sát các điều kiện đo phổ khối 19

3.1.2.Khảo sát điều kiện LC 21

3.1.3 Quy trình phân tích 26

3.2.XỬ LÝ MẪU 28

3.3 ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP 29

3.3.1 Độ thích hợp của hệ thống 29

3.3.2 Tính đặc hiệu của phương pháp 31

3.2.3 Độ tuyến tính 33

3.2.4.Giới hạn định lượng (LOQ), giới hạn phát hiện (LOD) 36

3.2.5 Độ đúng 38

3.2.6 Bàn luận 41

KẾT LUẬN 43

KIẾN NGHỊ 44

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Diode array detector

Internal standard High perform liquid chromatography High perform liquid chromatography – Tandem Mass Spectrometry

Methanol Mass Spectrometry Molecular Weight Parts per million Parts per billion Limit of Detection Limit of Quantitation Dispersive Solid Phase Extraction Recovery

Standard Deviation Relative Standard Deviation

Tiếng Việt

Acetontril Dược điển Anh 2010 Gốc octadecyl Ciprofloxacin Detector chuỗi diod Ofloxacin

Chuẩn nội

Sắc ký lỏng hiệu nâng cao Sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần

Methanol Khối phổ Khối lượng phân tử Một phần triệu Một phần tỷ Giới hạn phát hiện Giới hạn định lượng Chiết pha rắn Hiệu suất thu hồi

Độ lệch chuẩn

Độ lệch chuẩn tương đối

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1.Đặc tính của các quinolon nghiên cứu………

Error! Bookmark not defined Bảng 2.1 Danh mục hóa chất- thuốc thử - chất chuẩn 13

Bảng 3.1 Điều kiện phân mảnh của ciprofloxacin, ofloxacin và IS 20

Bảng 3.2 Kết quả sắc ký đồ khảo sát chương trình pha động 22

Bảng 3.3.Điều kiện LC-MS 28

Bảng3.4 Kết quả đánh giá độ thích hợp của hệ thống về thời gian và tỷ số diện tích của kháng sinh so với chuẩn nội 30

Bảng 3.5 Kết quả xác định khoảng nồng độ tuyến tính 34

Bảng 3.6 Giá trị LOD và LOQ của phương pháp 37

Bảng 3.7.Kết quả khảo sát độđúng và độ lặp lại của phương pháp 39

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Công thức chung quinolon………

Error! Bookmark not defined Hình 1.2 Mô hình đơn giản hệ thống LC-MS 5

Hình 1.3 Mô hình cấu trúc của máy khối phổ MS 7

Hình 1.4 Sơ đồ cấu tạo thiết bị phổ kế tứ cực kiểu chập ba 10

Hình 3.1.Sơ đồ phổ khối của các chất phân tích 20

Hình 3.2 Kết quả sắc ký đồ khảo sát thể tích tiêm mẫu 24

Hình 3.3 Kết quả sắc ký đồ khảo sát tốc độ dòng 26

Hình 3.4.Các sắc ký đồ xác định tính đặc hiệu 33

Hình 3.5.Đồ thị biễu diễn sự phụ thuộc tỉ số diện tích pic (CIPRO/IS) và nồng độ CIPRO (ng/ml) 35

Hình 3.6:.Đồ thị biễu diễn sự phụ thuộc tỉ số diện tích pic (OFLO/SI) và nồng độ OFLO (ng/ml) 36

Hình 3.7.Sắc ký đồ xác định LOQ 38

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việc sử dụng kháng sinh gia tăng tình trạng kháng kháng sinh đang là hậu quả nghiêm trọng Bên cạnh một cách ồ ạt, thiếu kiểm soát đang trở thành vấn đề thời sự của ngành y tế, trong đó việc nguyên nhân do việc sử dụng thuốc không hợp lý thì một lý do khác đang được quan tâm là sự tồn tại dư lượng kháng sinh và những chất chuyển hoá của chúng trong môi trườngvì chỉ cần một dư lượng nhỏ kháng sinh thải

ra môi trường nhưng sẽ được tích lũy dần dần vào các vi khuẩn gây bệnh, giúp chúng phát triển những gen kháng thuốc Hướng nghiên cứu về dư lượng thuốc kháng sinh và những chất chuyển hoá cũng như tác động của chúng trong môi trường được bắt đầu từ những năm cuối thập kỉ 90 của thế kỷ 20 và rất được quan tâm tại các nước phát triển Nhiều nghiên cứu đã cho thấy rằng sự tồn tại của các kháng sinh và sự đề kháng kháng sinh trong môi trường nước đã trở nên phổ biến Song song với việc nâng cao chấtlượng chăm sóc và khám chữa bệnh cho nhân dân, lĩnh vực sản xuất thuốc được đặc biệt chú trọng Hiện cả nước có khoảng gần 200 doanh nghiệp có sản xuất dược phẩm với nhiều sản phẩm thuốc với đủ chủng loại:kháng sinh, thuốc chống viêm, thuốc tim mạch, thuốc bổ và vitamin…Kháng sinh nhóm quinolon có phổ kháng khuẩn rộng trên trực khuẩn Gram (-) và Gram (+), đang được chỉ định rộng rãi trong việc điều trị các bệnh nhiễm khuẩn tại nước ta Hiện có nhiều nhà máy, xí nghiệp dược đang sản xuất nhóm kháng sinh này với các dạng bào chế khác nhau như: viên nén, viên nang, bột pha hỗn dịch uống…Tuy nhiên việc kiểm soát sự tồn dư kháng sinh nhóm quinolon trong nước thải ở các cơ sở sản xuất này vẫn chưa được quan tâm đúng mức Tới thời điểm hiện nay, ở Việt Namnghiên cứu xác định dư lượng các kháng sinh trong nước thải đang còn hạn chế chưa có nghiên cứu xác định dư lượng kháng sinh quinolon trong nước thải của cơ sở sản xuất dược

Vì vậy để góp phần kiểm soát nồng độ dư lượng một số kháng sinh nhóm quinolon, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng phương pháp xác định Ciprofloxacin và Ofloxacin trong nước thải bằng sắc ký lỏng khối phổ” với các mục tiêu:

1 Khảo sát lựa chọn điều kiện phân tích (điều kiện sắc ký, điều kiện MS) để xác định Ciprofloxacin và Ofloxacin trong nước thải bằng LC-MS/MS

2 Thẩm định phương pháp định lượng Ciprofloxacin và Ofloxacin trong nước thải

CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN

1.1 NHÓM KHÁNG SINH QUINOLON

1.1.1 Vài nét về quinolon [10]

 Công thức cấu tạo chung của các quinolon:

Hình 1.1 Công thức chung quinolon

 Phân loại và phổ tác dụng

Có nhiều cách phân loại quinolon: phân loại dựa trên phổ và chỉ định lâm sàng, phân loại dựa vào phân tử có hoặc không có fluor Ngày nay, các quinolon được phân loại chi tiết thành 4 thế hệ:

- Thế hệ I: Nhạy cảm với các vi khuẩn Gram (-), đặc biệt vi khuẩn gây bệnh

đường tiết niệu Enterobacter Không tác dụng trên Pseudonomas aeruginosa Chỉ

định trong nhiễm khuẩn tiết niệu chưa biến chứng

- Thế hệ II: Phổ rộng với Gram (-), kể cả P.aeruginosa.Tác dụng trên một số

Gram (+), bao gồm cả Staphylococcus pneumoniae, trừ Streptococcus pneumoniae.Tác dụng trên một số vi khuẩn không điển hình như Mycoplasma, Chlamydia Có nhiều chỉ định như nhiễm khuẩn tiết niệu có hoặc không có biến

chứng thận, sinh dục, tiền liệt tuyến, da và mô mềm)

- Thế hệ III: Phổ rộng với Gram (-), một số cả trên P.aeruginosa phổ mở rộng

trên Gram (+), cảS pneumonae và các vi khuẩn đã kháng penicillin Phổ mở rộng

trên vi khuẩn không điển hình.Viêm phổi mắc phải cộng đồng, viêm xoang cấp và

đợt cấp của viêm phế quản mạn Gatifloxacin được cấp phép dùng cho nhiễm trùng tiết niệu và lậu

- Thế hệ IV: Phổ rộng với Gram (-), cả P.aeruginosa Mạnh với Gram (+), đặc biệt S.pneumoniae Phổ mở rộng với các vi khuẩn kỵ khí và vi khuẩn không

điển hình Chủ yếu dùng với nhiễm khuẩn đường hô hấp, ngoài ra, còn dùng với nhiễm khuẩn ổ bụng, vùng chậu

 Cơ chế tác dụng

Các quinolon đều ức chế ADN gyrase, là enzym mở vòng xoắn ADN, giúp cho sự sao chép và phiên mã, vì vậy ngăn cản sự tổng hợp ADN của vi khuẩn Ngoài ra còn tác dụng cả trên mARN nên ức chế tổng hợp protein vi khuẩn Các quinolon đều là thuốc diệt khuẩn

1.1.2 Đặc tính của các quinolon nghiên cứu [4], [5], [7]

Chúng tôi lựa chọn nghiên cứu một số kháng sinh quinolon, các chất này có

Bảng 1.1 Đặc tính của các quinolon nghiên cứu

g/25 ml), tan rất ít trong MeOH, rất

Tinh thể hình kim, không màu, chảy ở khoảng 255oC, kém phân hủy, ít tan trong nước và

khó tan trong ethanol

1.2.KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG KẾT NỐI VỚI PHÔI KHÔ

Về cơ bản, sắc ký lỏng khối phổ là phương pháp sắc ký lỏng sử dụng bộ phận phát hiện là detector khối phổ.Mô hình đơn giản của hệ thống LC-MS như ở hình dưới đây:

a.Pha tĩnh

Sắc ký

Bộ phận tích khối Detector / Lưu giữ số liệu

Trong HPLC, pha tĩnh chính là chất nhồi cột làm nhiệm vụ tách hỗn hợp chất phân tích đó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ từ 3-7 m.Trong phần tổng quan này chúng tôi đi sâu trình bày về kỹ thuật sắc ký phân bố là loại kỹ thuật phổ biến nhất.Tùy theo bản chất của pha tĩnh, pha động sử dụng, sắc ký lỏng phân

bố được chia làm 2 loại: sắc ký pha thuận (NP-HPLC) và sắc ký pha đảo HPLC)

(RP-b.Pha động

Trong HPLC, pha động là các dung môi hoặc hỗn hợp dung môi hữu cơ hoặc dung dịch đệm được hòa tan vào nhau để có khả năng tách với độ phân giải phù hợp

Yêu cầu:

- Độ tinh khiết cao

- Không phản ứng với chất phân tích và pha tĩnh

- Không có bọt khí, không có bụi (đánh siêu âm,lọc)

 Pha động thành hai loại:

- Pha động có độ phân cực cao: Có thành phần chủ yếu là nước, tuy nhiên để phân tích các chất hữu cơ cần thêm các dung môi khác để làm giảm độ phân cực như MeOH, ACN…

- Pha động có độ phân cực thấp bao gồm các dung môi ít phân cực như cyclopentan,n-pentan, n-hexan, CCl4…

 Có 2 cách dùng pha động để rửa giải:

- Đẳng dòng: Các thành phần pha động không thay đổi trong suốt quá trình chạy sắc ký

- Gradient: Tỷ lệ hỗn hợp dung môi thay đổi trong quá trình chạy sắc ký Chế độ gradient này phù hợp với mẫu phân tích chứa nhiều thành phần với khả năng phân cực khác nhau, giúp rút ngắn thời gian phân tích, tăng độ phân giải

Pha động trong LC-MS/MS không chỉ đóng vai trò tách các chất mà còn góp phần vào khả năng ion hóa của chất

1.2.2.Khối phổ(Mass Spectrometry) [1]

Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry- MS) là phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên

sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong một điện trường hoặc

từ trường nhất định Tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) có ảnh hưởng rất lớn đối với chuyển động này của ion Nếu biết được điện tích của ion thì ta dễ dàng xác định được khối lượng của ion đó được

Chân không cao

để đưa vào bộ phân tích khối Tại bộ phân tích khối, tứ cực thứ nhất sẽ chọn ion mẹ

có m/z xác định, các phân mảnh của ion này được tạo ra tại buồng va chạm nhờ tương tác với khí trơ và được phân tích nhờ tứ cực thứ ba, tạo ra tín hiệu đặc trưng tại bộ phận phát hiện ion Từ đóxác định các chất

khối

Detector

lưu giữ liệu Tránh ion phân tích va chạm với ion trong không khí

1.2.2.2.Cấu tạo

a.Nguồn ion

Ion hoá phân tử trung hoà thành các ion phân tử mang điện tích hoặc sự bắn phá, phân mảnh phân tử trung hoà thành các mảnh ion, các gốc mang điện tích bằng các phần tử mang năng lượng cao.Những tiểu phân không bị ion hóa sẽ bị hút ra khỏi buồng ion qua bơm chân không của thiết bị MS Các ion phân tử tạo thành sẽ được tăng tốc độ và thu gọn (hội tụ)

Việc tăng tốc được thực hiện bởi một điện thế (2-10 kV), khi ra khỏi buồng ion hóa các ion phân tử có tốc độ đạt cao nhất Việc thu gọn thành chùm ion được thực hiện bởi một điện trường phụ để khi vào phần phân tích khối (mass analyzer)

là một dòng ion tập trung, đồng nhất Một số kĩ thuật ion hóa thường được sử dụng trong sắc ký lỏng khối phổ như: ion hóa đầu phun điện tử (Electrospray ionization-ESI), ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (Atmospheric pressure chemicalionization-APCI).Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng kỹ thuật ion hóa phun điện tử (ESI)

ESI là một kỹ thuật ion hóa được ứng dụng cho những hợp chất không bền nhiệt, phân cực, có khối lượng phân tử lớn ESI có khả năng tạo thành những ion

đa điện tích (dương hoặc âm, tùy thuộc vào áp cực điện thế), được xem là kỹ thuật ion hóa êm dịu hơn APCI, thích hợp cho phân tích các hợp chất sinh học như protein, peptide, nucleotide… hoặc các polyme công nghiệp như polythylenglycol

Trong ESI, tại đầu ống dẫn mao quản, dưới ảnh hưởng của điện thế cao và

sự hỗ trợ của khí mang, mẫu được phun thành những hạt sương nhỏ mang tích điện tại bề mặt Khí ở xung quanh các giọt này tạo nhiệt năng làm bay hơi dung môi ra khỏi giọt sương, khi đó, mật độ điện tích tại bề mặt hạt sương gia tăng Mật độ điện tích này tăng đến một điểm giới hạn (giới hạn ổn định Rayleigh) để

từ đó hạt sương phân chia thành những hạt nhỏ hơn vì lực đẩy lúc này lớn hơn sức căng bề mặt Quá trình này được lặp lại nhiều lần để hình thành những hạt rất

nhỏ Từ những hạt rất nhỏ mang điện tích cao này, các ion phân tích được chuyển thành thể khí bởi lực đẩy tĩnh điện sau rồi sau đó đi vào bộ phân tích khối Trong

kỹ thuật ESI, phân tử nhất thiết phải được biến thành chất điện ly, tan trong dung dịch dùng để phun sương Điều này phụ thuộc vào: dung môi sử dụng, pKa của chất điện ly và pH của dung dịch

Có 2 chế độ bắn phá: bắn phá với chế độ ion dương và ion âm

 Loại hình thành ion dương :

 Phù hợp nhất cho chất phân tích có tính base

 Thường hình thành nên ion [M+H]+

 Cũng có thể hình thành ion [M+nH]n+ [M+ Na]+

 Loại hình thành ion âm :

 Thích hợp nhất cho sự phân tích các loại thuốc có tính acid

 [M-H]-[M-nH]

n-b.Bộ phận phân tích khối(Mass analyzer):

Các ion hình thành ở nguồn ion hoá có khối lượng m và điện tích z (tỷ số m/z được gọi là số khối) sẽ đi vào bộ phận phân tích khối Bộ phận phân tích khối được coi là quả tim của máy khối phổ, có nhiệm vụ tách các ion có số khối m/z khác nhau thành từng phần riêng biệt nhờ tác dụng của từ trường, điện trường trước khi đến đến bộ phận phát hiện và xử lý số liệu

Các kỹ thuật phân tích khối được sử dụng phổ biến là bộ phận phân tích

tứ cực, bộ phận phân tích bẫy ion, bộ phận phân tích thời gian bay.Bộ phân tích khối ba tứ cực được sủ dụng phổ biến trong kỹ thuật LC-MS/MS và đây cũng là

kỹ thuật được chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu này

Tứ cực được cấu tạo bởi 4 thanh điện cực song song tạo thành một khoảng trống

để các ion bay qua.Một trường điện từ được tạo ra bằng sự kết hợp giữa dông một chiều (DC) và điện thế tần số (RF).Các tứ cực được đóng vai trò như bộ lọc khối.Khi một trường điện từ được áp vào, các ion chuyển động trong nó sẽ dao động phụ thuộc vào tỉ số m/z và trường RF.Chỉ có những ion có tỉ số m/z phù hợp mới có thể đi qua được bộ lọc này

Bộ phân tích khối ba tứ cực gồm ba tứ cực được ghép nối với nhau

Trong đó, tứ cực thứ nhất (Q1) có nhiệm vụ tách các ion, lựa chọn ion mẹ với m/z nhất định từ nguồn ion chuyển đến dể chuyển đến Q2.Ở tứ cực thứ 2 (Q2) với áp suất cao các ion phân tử bị phân li do va chạm với khí trơ có mặt như khí N2, Ar, He.Bộ Q2 tạo ra phân ly do các ion mẹ bị phân mảnh tiếp theo tạo ra các ion nhỏ hơn(ion con).Q2 không đóng vai trò là bộ lọc ion mà nó chấp nhận tất cả các ion

do Q1 chuyển đến.Sau đó tất cả các ion con được chuyển qua bộ tách Q3.Bộ tứ cực thứ ba (Q3) làm nhiệm vụ tách các ion được chuyển từ Q2 để tới bộ phận phát hiện

Hình 1.4: Sơ đồ cấu tạo thiết bị phổ kế tứ cực kiểu chập ba

c Bộ phận phát hiện (detector)

Sau khi đi ra khỏi bộ phận phân tích khối lượng, các ion được đưa tới phần cuối củathiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion Bộ phận phát hiện cho phép khối phổ tạo ra một tínhiệu của các ion tương ứng từ các electron thứ cấp đã được khuếch đại hoặc tạo ra một dông do điện tích di chuyển Có hai loại bộ phận phát

hiện phổ biến: bộ phận phát hiện nhân electron (electron multiplier) và bộ phận phát hiện nhân quang (photomultiplier) Bộ phận phát hiện nhân electron là một

trong những detector phổ biến nhất, có độ nhạy cao Các ion đập vào bề mặt dinot làm bật ra các electron Các electron thứ cấp sau đó được dẫn tới các dinot tiếp theo và sẽ tạo ra electron thứ cấp nhiều hơn nữa, tạo thành dòng các electron Bộ phận phát hiện nhân quang cũng giống như thiết bị nhân electron, các ion ban đầu

đập vào một dinot tạo ra dòng các electron Khác với detector nhân electron, các electron sau đó sẽ va đập vào một màn chắn phospho và giải phóng ra các photon Các photon này được phát hiện bởi một bộ nhân quang hoạt động như thiết bị nhân electron Ưu điểm của phương pháp này là các ống nhân quang được đặt trong chân không nên loại bỏ được các khả năng nhiễm bẩn

1.2.2.3.Một số kỹ thuật ghi phổ

 Quét toàn phổ (Full Scan)

Khi thao tác với chếđộ scan, MS sẽ nhận được tất cả các mảnh ion để cho phổđồ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt quá trình phân tích Thường dùng để nhận danh hay phân tích khi chất phân tích có nồng độ đủ lớn Đối với MS tứ cực chập

ba, chế độ Full scan MS thường được lựa chọn để khảo sát ion mẹ, chế độ Full scan MS/MS quét tất cả các ion con tạo thành thường được sử dụng để xác định ion con

cho tín hiệu ổn định và bền nhất

 Selected Ion Monitoring (SIM)

Trong chếđộ SIM, MS chỉ ghi nhận tín hiệu một số mảnh ion đặc trưng cho chất cần xác định Phổđồ SIM chỉ cho tín hiệu của các ion đãđược lựa chọn trước đó, do vậy không thể dùng để nhận danh hay so sánh với các thư viện có sẵn Đối với MS

tứ cực chập ba, chếđộ SIM thường được lựa chọn để khảo sát năng lượng phân mảnh khi đã biết ion mẹ

 SRM (Selected Reaction Monitoring) và MRM (Multiple Reaction

Monitoring)

Đối với MS tứ cực chập ba, là máy đo khối phổ hai lần liên tiếp (MS/MS), 2

kỹ thuật ghi phổ MS/MS có độ nhạy cao thường được sử dụng là SRM và MRM

 SRM: cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lậpđó, trong các mảnh ion sinh ra, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu dò để phát hiện

 MRM: trên thực tế, do yêu cầu về mặt kỹ thuật đối với phân tích vi lượng nên các ion con cần quan tâm thường từ 2 trở lên, do vậy kỹ thuật ghi phổ MRM thông dụng hơn SRM Đầu tiên, cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ cực thứ nhất, phân mảnh ion cô lập đó tại tứ cực thứ 2 (thực chất là buồng va chạm) thu được các

ion con, cô lập 2 (hoặc nhiều) ion con cần quan tâm ở tứ cực thứ 3 và đưa vào đầu

dò để phát hiện

1.2.2.4.Kỹ thuật chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc ký

Trong các mẫu sinh học, mẫu môi trường có lẫn nhiều thành phần phức tạp, hàm lượng chất cần phân tích rất thấp Để làm giàu mẫu trong nghiên cứu này chúng tôi

đã sư dụng phương pháp chiết pha rắn (SPE) để tách chiết mẫu

Có 6 bước chính trong quá trình chiết pha rắn:

- Bước 1 Chuẩn bị dịch mẫu: Mẫu phải ở dạng dung dịch và tương tác được với chất hấp phụ Dịch mẫu khi cần thiết phải được lọc hoặc ly tâm trước khi cho vào cột SPE để tránh làm tắc cột

- Bước 2 Hoạt hóa cột: làm ướt pha rắn, tạo môi trường thích hợp cho việc hấp thu chất phân tích Thể tích dung môi cần sử dụng khoảng 1mL/100mg chất hấp phụ Nếu thể tích dung môi sử dụng ít hơn thể tích quy định này sẽ làm tăng nguy

cơ pha rắn không được solvat hóa hoàn toàn, kết quả độ thu hồi của mẫu thấp

- Bước 3 Cân bằng cột: Trước khi cho mẫu vào, cột phải có điều kiện tương đương với điều kiện chạy của mẫu (ví dụ: pH) bằng cách cho thêm dung môi có điều kiện tương đương dung môi chứa mẫu

- Bước 4 Nạp mẫu: mẫu được cho qua cột SPE Tốc độ dòng chảy của mẫu qua cột khoảng 3ml/phút

- Bước 5 Rửa pha rắn: dùng dung môi thích hợp để loại các tạp chất ra khỏi cột nhưng vẫn giữ lại được chất cần phân tích

- Bước 6 Rửa giải: sử dụng dung môi thích hợp để tách chất cần phân tích ra khỏi cột, tốc độ dòng chảy khi rửa giải không được quá nhanh Tốc độ này phụ thuộc vào đường kính cột và khối lượng chất hấp phụ, người ta thường rửa với tốc

độ khoảng 1ml/phút

CHƯƠNG2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

- Mẫu trắng: Nước thải ở các cơ sở sản xuất dược có sản xuất kháng sinh nhóm Ciprofloxacin, Ofloxacin không sản xuất các kháng sinh này ít nhất 7 ngày, kiểm tra bằng LC-MS/MS không phát hiện có Ciprofloxacin, Ofloxacin

- Các chất phân tích: Ciprofloxacin, Ofloxacin

2.2.HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ

2.2.1.Hóa chất

Bảng 2.1 Danh mục hóa chất- thuốc thử - chất chuẩn

lượng Hóa chất,

thuốc thử

Acetonitril Merck (Đức) Dùng cho HPLC Methanol Merck (Đức) Dùng cho HPLC Acid hydroclorid

đặc

Na2EDTA Merck (Đức)

Acid formic Merck (Đức) Dùng cho HPLC

Chất chuẩn

Ciproloxacin 13C3 (IS)

Ciprofloxacin hydroclorid

Viện kiểm nghiệm TW

SKS: 0212029.02 93,47%

Ofloxacin Viện kiểm

nghiệm TW

SKS: 010087.02 99,99%

2.2.2.Thiết bị, dụng cụ

- Máy sắc ký lỏng khối phổ Agilent Technologies 6460 Triple Quad LC/MS (Mỹ)

- Cột Agilent SB C18 (1,8 µm; 2,1×50 mm) (Mỹ)

- Bộ chiết pha rắn OASIS HLB 6cc Vac Cartridge 200mg, 6ml, Oasis(Mỹ)

- Thiết bị siêu aamUltrasonic Cleaner Set, Wisd(Hàn Quốc)

- Máy đo pH Eutech Instruments pH 510, Cyberscan (Mỹ)

- Máy lọc hút chân không

- Màng lọc 0,45µm Cellulose acetat, Sartorius (Đức)

- Cân phân tích AB204 (chính xác đến 0,1 mg)

- Cân Mettler Toledo (chính xác đến 0,01 mg)

- Thiết bị đuổi dung môi bằng khí N2 Pierceb Reacti- Therm/ # 18822, Mỹ

- Máy lọc nước siêu tinh khiết

- Tủ lạnh

- Các dụng cụ thủy tinh trong phân tích: bình định mức chính xác 10 ml, pipet chính xác và các dụng cụ thủy tinh

2.3 NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Nội dung nghiên cứu

Nội dung nghiên cứu bao gồm :

 Khảo sát, tối ưu hóa các điều kiện để xây dựng quy trình định lượng

Ciprofloxacin, Ofloxacin trong nước bằng phương pháp sắc kí lỏng khối phổ MS/MS)

2.3.2.Phương pháp nghiên cứu

2.3.2.1.Phương pháp thu thập và xử lý mẫu

Lấy nước thải từ nhà máy sản xuất kháng sinh trong giai đoạn nhà máy không sản xuất,lọc, điều chỉnh đến pH thích hợp

Bảo quản mẫu saukhi lấy ở 2 – 80C và tiến hành phân tích trong 24h về độ dặc hiệu

và độ đúng chứng minh nước thải không có kháng sinh Ciprofloxacin và Ofloxacin

2.3.2.2.Xây dựng các điều kiện sắc ký

Tiến hành chạy thử trên từng kháng sinh CIPRO, OFLO, IS và hỗn hợp kháng

sinh với IS trong dung môi pha động

 Khảo sát điều kiện khối phổ

Khảo sát lựa chọn điều kiện nguồn Ion hóa, điều kiện bắn phá ion mẹ để tạo ion

con, lựa chọn ion con để định lượng

 Khảo sát điều kiện sắc ký :

- Chuẩn nội: Đảm bảo phân tách tốt và thời gian phân tích không quá dài,đáp ứng của chuẩn nội tốt Chúng tôi quyết định chọn chuẩn nội để khảo sát là

Ciprofloxacin 13C3

- Cột sắc ký Agilent SB C18 (1,8 µm; 2,1×50 mm)

- Chương trình pha động: Dựa vào các tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát trên pha động ACN (0,1% HCOOH) : H2O (0,1% HCOOH) với tỉ lệ tt/tt khác nhau và chạy chế độ gradient

- Tốc độ dòng: Thay đổi lưu lượng pha động từ 0,1- 0,3 ml/phút để xác định được tốc độ phù hợp cho thời gian tối ưu

- Thể tích tiêm mẫu: Thay đổi lưu lượng mẫu từ 1- 5 µl để xác định được thể tích tiêm phù hợp cho sắc ký đồ đẹp, diện tích pic và độ đáp ứng cao

2.3.2.3.Đánh giá phương pháp [11], [14]

 Tính thích hợp của hệ thống

Tiến hành sắc ký 6 lần liên tiếp trong cùng điều kiện một dung dịch chứa chất chuẩn kháng sinh và chất chuẩn nội Đánh giá độ phù hợp của hệ thống thông qua các chỉ số sau đây:

 Giá trị RSD của thời gian lưu và diện tích pic của chất chuẩn nội và kháng sinh (nhỏ hơn 2%)

 Giá trị RSD của tỉ số diện tích pic của kháng sinh/chuẩn nội (nhỏ hơn 2%)

 Tính đặc hiệu

Độ đặc hiệu của được đánh giá thông qua phân tích các dung dịch chuẩn, mẫu trắng và mẫu tự tạo (mẫu trắng có thêm kháng sinh nghiên cứu) Tiến hành như sau:

 Dung dịch chuẩn chứa các kháng sinh và chất chuẩn nội có nồng độđã biết

 Mẫu trắng (không chứa kháng sinh) xử lý theo qui trình đã xây dựng

 Mẫu tự tạo là mẫu trắng có thêm một lượng chính xác các kháng sinh có nồng độ đã biết và chất chuẩn nội

Tiến hành xử lý và sắc ký các dung dịch chuẩn, mẫu trắng và mẫu tự tạo theo các điều kiện đã chọn Trên sắc kí đồ của mẫu trắng tại các thời điểm trùng với thời gian lưu của kháng sinh phải không xuất hiện các píc có các mảnh khối phổ tương ứng với số khối của chất phân tích trong mẫu chuẩn và chuẩn nội Nếu có đáp ứng phải nhỏ hơn 1% so với nồng độ giữa của khoảng tuyến tính

 Độ tuyến tính

Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó có

sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích

Cách xác định khoảng tuyến tính:

 Từ dung dịch chuẩn gốc của các chất kháng sinh nghiên cứu tiến hành pha một dãy ít nhất 5 dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ đã xác định trong khoảng tuyến tính cần khảo sát Nồng độ chuẩn nội trong mỗi dung dịch chuẩn được giữ hằng định

 Tiến hành sắc kí theo các điều kiện đã chọn

 Xây dựng đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa tỉ lệ diện tích pic kháng sinh chuẩn nội (SKS/Si) (trục tung Oy) và nồng độ kháng sinh (trục hoành Oz)

 Thiết lập phương trình hồi qui tuyến tính dạng y = ax + b và hệ số tương

quan r từ đó kết luận về độ tuyến tính của phương pháp

 Giới hạn định lượng (LOQ)

LOQ là nồng độ tối thiểu của một chất phân tích có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng được với độ đúng và độ chính xác thích hợp

LOQ được chấp nhận nếu đáp ứng của chất phân tích phải ít nhất gấp 10 lần đáp ứng của mẫu trắng

Tiến hành xử lý mẫu chuẩn ciprofloxacin và ofloxacin có nồng độ thấp dần và tiến hành phân tích

 Giới hạn phát hiện (LOD)

Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu

có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được

LOD được coi là nồng độ chất phân tích gây nên sự tăng tín hiệu đáp ứng 3 lần so với đáp ứng của tín hiệu của mẫu trắng (S/N =3)

LOD được tính theo giá trị LOQ theo công thức:

= 3.3

So sánh giá trị trung bình giữa các lần định lượng của mỗi nồng độ với giá trị thực

có trong mẫu tính theo lượng chuẩn đã cân và thể tích đã pha

Nhưng trong thực tế chúng tôi tiến hành khảo sát ở một nồng độ thấp trên nền một mẫu nước thải được lấy từ một nhà máy trong giai đoạn không sản xuất kháng sinh Ciprofloxacin và Ofloxacin

2.3.2.4 Phân tích số liệu theo thực nghiệm

Số liệu được xử lý trên Microsoft Office Excel 2010

Một số công thức tính các giá trị thống kê:

- Giá trị trung bình ̅ = × ∑

- Độ lệch chuẩn (SD) SD = ∑ ( ̅)

- Độ lệch chuẩn tương đối RSD =

̅× 100 Trong đó: xi là kết quả ở lần xác định thứ i

CHƯƠNG 3.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1.XÂY DỰNG ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH CÁC CHẤT BẰNG LC-MS/MS 3.1.1 Khảo sát các điều kiện đo phổ khối

Qua tham khảo một số tài liệu, chúng tôi tiến hành khảo sát xác định Ciprofloxacin, Ofloxacin bằng kĩ thuật phun điện tử ESI

- Nguồn ion hóa: ESI (+)

- Nhiệt độ khí phun : 300oC

- Tốc độ khí phun : 11 l/min

- Áp suất đầu phun : 25 psi

- Thế nguồn ion hóa : 4000 V

Để xác định điều kiện khối phổ, chúng tôi tiến hành pha từng chất trong pha động cụ thể như sau:

- Pha dung dịch chuẩn riêng rẽ các chất chuẩn CIPRO, OFLO trong hỗnhợp dung môi MeOH : H2O (4 : 1) có nồng độ 1 mg/mL và IS trong MeOH có nồng độ khoảng 0,5 µg /mL

 Tiến hành khảo sát bắn phá tạọ các ion mẹ

Bơm lần lượt các dung dịch trên vào hệ thống khối phổ với tốc độ dòng là 0,3ml/phút Sau khoảng 2 phút xuất hiện mảnh ion mẹ của Ciprofloxacin,Ofloxacin

và IS có m/z lần lượt là 332,1;362; 336,1

 Khảo sát ion hóa lựa chọn ion con

Detector sử dụng trong nghiên cứu này là hê ̣khối phổ 2 lần, do đó để phát hiện đúng chất phân tích thì việc lựa chọn được ion con là rất quan trọng Ion con phải có tín hiệu gấp ít nhất 10 lần so với ion mẹ.Để thu được mảnh ion con có tín hiệu cao cần phải chọn được mức năng lượng bắn phá thích hợp Sử dụng chế độ bơm tự động để bơm từng chất phân tích vào detector khối phổ và lựa chọn ion con đặc trưng có cường độ tín hiệu cao nhất để định tính và định lượng Mảnh ion con m/z có cường độ lớn nhất dùng để định lượng, mảnh ion con thứ 2 có cường độ thấp