Xây dựng phương pháp xác định cefadroxil và cefotaxim trong nước bằng sắc ký lỏng khối phổ

Phương pháp này đã được sử dụng để đánh giá sự có mặt của các kháng sinh này trong các mẫu nước từ một số nhà máy xử lý nước sông và nước biển tại Hồng Kông [25]..  Một số nghiên cứu đị

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia

HÀ NỘI - 2015

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện đề tài, em đã nhận được sự giúp đỡ, tạo điều kiện của các thầy cô giáo, các anh chị trong Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia, Bộ môn Vật lý – Hóa Lý, Bộ môn Hóa phân tích và Độc chất – Trường Đại học Dược

Hà Nội, cùng bạn bè và gia đình Sự giúp đỡ quý giá đó là động lực giúp em có thể hoàn thành tốt khóa luận của mình

Trước tiên, em xin chân thành cảm ơn DS Lê Xuân Kỳ, người đã tận tình

hướng dẫn, đóng góp ý kiến quý báu và tạo điều kiện cho em hoàn thành đề tài này

Em xin chân thành cảm ơn DS Dương Thị Vân, DS Nguyễn Thị Hạnh đã

nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ và hỗ trợ em hoàn thành khóa luận

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh,

người đã tận tình chỉ bảo, đóng góp ý kiến quý báu cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài và viết khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Hóa phân tích và Độc chất, Bộ môn Vật lý – Hóa lý – Trường Đại học Dược Hà Nội, Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện cho em thực hiện đề tài Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn chia sẻ, động viên em hoàn thành khóa luận

Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2015

Sinh viên

Ngọ Thị Thu Phương

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Công thức cấu tạo chung của các kháng sinh β- lactam 2

1.1.1 Kháng sinh Penicillin 2

1.1.2 Kháng sinh Cephalosporin 2

1.2 Tổng quan về các đối tượng nghiên cứu 3

1.2.1 Cefotaxim natri 3

1.2.2 Cefadroxil monohydrat 4

1.3 Tổng quan về phương pháp nghiên cứu 6

1.3.1 Chiết pha rắn (SPE - solid phase extraction) 6

1.3.2 Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng khối phổ: 7

1.4 Một số nghiên cứu về dư lượng thuốc kháng sinh có trong nước ở Việt Nam và trên thế giới 14

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Đối tượng và phương tiện nghiên cứu 16

2.1.1 Hoá chất - chất chuẩn 16

2.1.2 Máy móc - trang thiết bị 16

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu 17

2.2 Phương pháp nghiên cứu 17

2.2.1 Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng kháng sinh trong nước thải bằng LC - MS/MS 17

2.2.2 Thẩm định quy trình phân tích đã xây dựng 18

2.3 Phương pháp xử lý số liệu 20

Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21

3.1 Xây dựng điều kiện phân tích các chất bằng LC-MS/MS 21

3.1.1 Khảo sát các điều kiện khối phổ 21

3.1.2 Khảo sát các điều kiện sắc ký lỏng hiệu nâng cao 24

3.2 Thẩm định phương pháp 32

3.2.1 Độ thích hợp hệ thống 32

3.2.2 Độ đặc hiệu của phương pháp 33

3.2.3 Độ tuyến tính, đường chuẩn 35

3.2.4 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) 36

3.2.5 Độ đúng, độ chính xác của phương pháp 38

3.3 Bàn luận 40

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

High perform liquid chromatography – Tandem Mass Spectrometry

Limit of Detection Limit of Quantitation Methanol

Mass Spectrometry Recovery

Relative Standard Deviation Standard Deviation

Dispersive Solid Phase Extraction Area under the peak

Retention time

Tiếng Việt

Acetontril Gốc octadecyl Ion hóa bằng phun sương điện Sắc ký lỏng hiệu nâng cao Chuẩn nội

Sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần

Giới hạn phát hiện Giới hạn định lượng Methanol

Khối phổ Hiệu suất thu hồi

Độ lệch chuẩn tương đối

Độ lệch chuẩn Chiết pha rắn Diện tích pic Thời gian lưu

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Các nguyên liệu nghiên cứu 16

Bảng 3.1 Điều kiện phân mảnh của các kháng sinh 21

Bảng 3.2 Kết quả lựa chọn ion mẹ 23

Bảng 3.3 Các hệ pha động đã khảo sát 26

Bảng 3.4 Điều kiện chạy sắc ký lỏng khối phổ 31

Bảng 3.5 Bảng khảo sát độ thích hợp hệ thống 32

Bảng 3.6 Nồng độ dung dịch chuẩn gốc 35

Bảng 3.7 Khảo sát độ tuyến tính của dung dịch chất phân tích 35

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp 39

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Công thức chung của Penicillin [10] 2

Hình 1.2 Công thức chung của Cephalosporin [10] 2

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử của Cefotaxim natri [5] 3

Hình 1.4 Cấu trúc phân tử Cefadroxil monohydrate [5] 5

Hình 1.5 Cấu tạo thiết bị khối phổ 9

Hình 3.1 Phổ khối của Cefotaxim ở điều kiện định lượng (Fragmentor:130V, CE:17V) 22

Hình 3.2 Phổ khối của Cefadroxil ở điều kiện định lượng (Fragmentor:130V, CE:13V) 22

Hình 3.3 Phổ khối của Trimethoprim 13C3 ở điều kiện đã chọn (Fragmentor:154V, CE:21V) 22

Hình 3.4 Sắc ký đồ pha động 1 25

Hình 3.5 Sắc ký đồ pha động 2 25

Hình 3.6 Sắc ký đồ pha động 3 26

Hình 3.7 Sắc ký đồ tại tốc độ dòng 0,2 ml/phút 27

Hình 3.8 Sắc ký đồ tại tốc độ dòng 0,3 ml/phút 28

Hình 3.9 Sắc ký đồ tại tốc độ dòng 0,5 ml/phút 28

Hình 3.10 Thể tích tiêm 1 µl 29

Hình 3.11 Thể tích tiêm 3 µl 30

Hình 3.12 Thể tích tiêm 5 µl 30

Hình 3.13 Sắc ký đồ mẫu trắng 33

Hình 3.14 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn 34

Hình 3.15 Sắc ký đồ dung dịch thêm chuẩn 34

Hình 3.16 Đường chuẩn dung dịch Cefotaxim và Cefadroxil 36

Hình 3.17 Sắc ký đồ tại giới hạn phát hiện của Cefotaxim 37

Hình 3.18 Sắc ký đồ tại giới hạn định lượng của Cefadroxil 37

ĐẶT VẤN ĐỀ

Kháng kháng sinh luôn là vấn đề được nhiều người quan tâm và cũng là thực trạng mà xã hội hiện nay đang phải đối mặt Trong khi các kháng sinh mới ra đời ngày càng ít, thì việc kháng các kháng sinh phổ rộng, tác dụng mạnh như quinolon, các cephalosporin thế hệ mới ngày càng phổ biến và đe dọa sức khỏe con người Một trong những nguyên nhân gây ra tình trạng kháng kháng sinh là sự tồn dư của kháng sinh và các chất chuyển hóa của chúng trong môi trường Vì chỉ một lượng rất nhỏ kháng sinh có mặt trong môi trường sống cũng giúp vi khuẩn sinh ra những gen kháng thuốc Nhiều nghiên cứu đã cho thấy rằng sự tồn tại của các kháng sinh

và sự kháng kháng sinh trong môi trường nước đã trở nên phổ biến [7], [20], [30] Cùng với việc kiểm soát sử dụng kháng sinh hợp lý, vấn đề kiểm soát nồng

độ kháng sinh thải ra môi trường tại các cơ sở sản xuất dược phẩm cũng cần được quan tâm Kháng sinh nhóm β-lactam là nhóm kháng sinh rất đa dạng và có phổ kháng khuẩn rộng Hiện nay, nhiều nhà máy, xí nghiệp dược đang sản xuất nhóm kháng sinh này với các dạng bào chế khác nhau Tuy nhiên, việc kiểm soát sự tồn

dư kháng sinh nhóm β-lactam trong nước thải ở các cơ sở sản xuất này vẫn chưa được quan tâm đúng mức Tới thời điểm hiện nay, ở Việt Nam mới có một số nghiên cứu xác định dư lượng một số kháng sinh trong nước thải bệnh viện và nước thải từ cơ sở sản xuất dược [4], [11], [14]

Phương pháp xác định dư lượng kháng sinh hay sử dụng là HPLC với detector khác nhau như UV-VIS, FLD, nhưng dùng nhiều nhất là LC-MS/MS Để

có thể ứng dụng phân tích mẫu thực, phương pháp phân tích cần được xây dựng và

thẩm định Do đó chúng tôi tiến hành bước đầu đề tài: “Xây dựng phương pháp

xác định Cefadroxil và Cefotaxim trong nước bằng sắc ký lỏng khối phổ” với

các mục tiêu:

1 Khảo sát và lựa chọn điều kiện phân tích (điều kiện sắc ký, điều kiện MS)

để xác định Cefotaxim và Cefadroxil trong nước bằng LC-MS/MS

2 Thẩm định phương pháp định lượng Cefotaxim và Cefadroxil trong nước

Chương 1 TỔNG QUAN

Kháng sinh β-lactam gồm 2 nhóm lớn là Penicillin và Cephalosporin

1.1.1 Kháng sinh Penicillin

Hình 1.1 Công thức chung của Penicillin [10]

Penicillin là dẫn chất acyl hóa của acid 6-amino penicillanic (A6AP), cacbon bất đối C(2) có cấu hình S, trong khi C(5), C(6) đều có cấu hình R Cấu hình này đóng vai trò quan trọng cho hoạt tính của các Penicillin

H

H H

Hình 1.2 Công thức chung của Cephalosporin [10]

Cephalosporin là dẫn chất acyl hóa của acid 7-aminocephalosporanic (A7AC), dạng cấu trúc 3-cephem, 3 mới đủ liên hợp điện tử với vòng β –lactam

để hợp chất có tác dụng sinh học

Trong A7AC, các carbon bất đối C(6) và C(7) đều có cấu hình R, và hầu như

là nguyên nhân làm cho các Cephalosporin có tính hữu tuyền khá mạnh

1.2 Tổng quan về các đối tượng nghiên cứu

 Cấu trúc phân tử:

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử của Cefotaxim natri [5]

 Danh pháp quốc tế:

(6R,7R)-3-[(acetyloxy)methyl]-7-[[(Z)-2-(2-aminothiazol-4-carboxylat natri [5]

yl)-2-(methoxyimino)acetyl]amino]-8-oxo-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-en-2- Công thức phân tử: C16H16N5 NaO7S2

 Khối lượng phân tử: 477,4g/mol

 Dạng bào chế:

- Lọ 0,5 g; 1 g; 2 g bột thuốc, kèm ống dung môi để pha

- Lọ thuốc nước để tiêm tương ứng với 250 mg, 500 mg và 1 g cefotaxim

 Một số nghiên cứu định lượng Cefotaxim:

- Trong Dược điển Việt Nam IV, phương pháp HPLC được dùng để định lượng chế phẩm chứa cefotaxim với các điều kiện như sau [5]:

+ Pha động: Hòa tan 3,5 g kali dihydrophosphat (TT) và 11,6 g dinatri hydrophosphat (TT) trong 1000 ml nước pH 7,0 và thêm 180 ml methanol (TT) + Điều kiện sắc ký:

Cột (0,25 mm x 4,6 mm) được nhồi octadecylsilyl silica gel dành cho sắc

ký (5 mm)

Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 235 nm

Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút

Thể tích tiêm: 10 ml

- Nghiên cứu của Từ Bình Minh và cộng sự (2009) đã xây dựng phương pháp

và đánh giá dư lượng của 4 nhóm kháng sinh, trong đó gồm 3 kháng sinh β-lactam: Amoxicilin, Cephalexin và Cefotaxim Nghiên cứu đã xử lý mẫu bằng kỹ thuật chiết pha rắn và xác định dư lượng kháng sinh bằng LC - MS/MS Nhóm tác giả đã xây dựng được phương pháp với LOD của các kháng sinh β-lactam từ 0,7 - 20 ng/L Phương pháp này đã được sử dụng để đánh giá sự có mặt của các kháng sinh này trong các mẫu nước từ một số nhà máy xử lý nước sông và nước biển tại Hồng Kông [25]

- Nghiên cứu của tổ chức bảo vệ môi trường (EPA) Method 1694 (2007) về xác định dược phẩm và các sản phẩm chăm sóc cá nhân (PPCPs) trong môi trường mẫu bằng LC-MS/MS trong đó có kháng sinh Cefotaxim Phương pháp này được phát triển để phân tích trong dung dịch nước, môi trường rắn và dịch sinh học [28]

1.2.2 Cefadroxil monohydrat [5], [6], [21]

 Cấu trúc phân tử:

Hình 1.4 Cấu trúc phân tử Cefadroxil monohydrate [5]

 Danh pháp quốc tế: acid hydroxyphenyl)acetyl]amino]-3-methyl-8-oxo-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-en-2-carboxylic monohydrat

(6R,7R)-7-[[(2R)-2-amino-2-(4- Công thức phân tử: C16H17N3O5S H2O

 Khối lượng phân tử: 381,4g/mol

- Nhiễm khuẩn đường tiết niệu: Viêm thận - bể thận cấp và mạn tính, viêm bàng quang, viêm niệu đạo, nhiễm khuẩn phụ khoa

- Nhiễm khuẩn đường hô hấp: Viêm amidan, viêm họng, viêm phế quản - phổi

và viêm phổi thùy, viêm phế quản cấp và mạn tính, áp xe phổi, viêm mủ màng phổi, viêm màng phổi, viêm xoang, viêm thanh quản, viêm tai giữa

- Nhiễm khuẩn da và mô mềm: Viêm hạch bạch huyết, áp xe, viêm tế bào, loét

do nằm lâu, viêm vú, bệnh nhọt, viêm quầng

- Các nhiễm khuẩn khác: Viêm xương tủy, viêm khớp nhiễm khuẩn

Với những trường hợp nhiễm khuẩn do vi khuẩn Gram dương, Penicilin vẫn

là thuốc ưu tiên được chọn, các kháng sinh Cephalosporin thế hệ 1 chỉ là thuốc được chọn thứ hai để sử dụng

 Dạng bào chế:

Nang 500 mg; viên nén 1 g; dịch treo 125, 250 và 500 mg/5 ml

 Một số nghiên cứu định lượng Cefadroxil:

- Trong Dược điển Việt Nam IV, sử dụng phương pháp HPLC để định lượng chế phẩm chứa Cefadroxil với những điều kiện phân tích như sau [5]:

+ Pha động: Acetonitril - dung dịch kali dihydrophosphat 0,272% (4 : 96) + Điều kiện sắc ký:

Cột thép không gỉ (25 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh là octadecylsilyl silica gel (5 mm)

Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 254 nm

Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút

Thể tích tiêm: 20 ml

- Đề tài nghiên cứu sinh của Trần Quang Hải: "Nghiên cứu xác định hàm lượng một số chất hữu cơ trong dược phẩm và nước tiểu bằng phương pháp von-ampe" đã nghiên cứu thành công phương pháp chiết pha rắn (SPE) sử dụng cột chiết HLB xử lý nước tiểu xác định Ofloxacin và Cefadroxil bằng phương pháp von-ampe xung vi phân và phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ [8]

1.3.1 Chiết pha rắn (SPE - solid phase extraction) [2], [9], [13] , [14], [24]

Là quá trình tách dựa vào sự phân bố các chất phân tích giữa hai pha lỏng và rắn, trong đó chất phân tích được chiết từ pha lỏng vào pha rắn, sau đó rửa giải bằng dung môi thích hợp Nguyên liệu tạo pha rắn trong SPE tương tự như trong sắc ký lỏng, có thể là dẫn chất polysiloxan, polymer tạo pha liên kết, ngoài ra còn có cả

pha không liên kết Tùy theo đặc tính của pha rắn mà có thể chia thành các loại cột

có bản chất khác nhau, bao gồm: pha thuận, pha đảo hay trao đổi ion

Để xây dựng quy trình chiết pha rắn, cần tiến hành các bước như sau:

 Chọn pha rắn: tuỳ theo bản chất của chất phân tích mà lựa chọn pha rắn có bản chất thích hợp Mặt khác, tuỳ thuộc vào bản chất của chất phân tích mà lựa chọn cột

có lượng pha rắn và thể tích rửa giải khác nhau Lượng pha rắn dao động từ 50mg đến 10g, ứng với thể tích nền từ 125 µL đến 20 mL

- Qui trình chiết: gồm 4 giai đoạn

(1) Hoạt hóa cột chiết pha rắn: cho dung môi hoặc dung dịch đệm thích hợp đi

qua cột để loại bỏ khí trong cột và chuyển pha rắn sang trạng thái có thể lưu giữ chất phân tích trong mẫu

(2) Nạp mẫu: Mẫu được xử lý sơ bộ trong dung môi thích hợp và cho qua cột

Chất phân tích và một số chất khác được giữ lại trên cột Các tạp chất đi ra khỏi cột càng nhiều càng tốt để tránh ảnh hưởng đến tương tác của chất phân tích và pha rắn

(3) Loại tạp chất: Sau khi đưa mẫu qua cột, dùng dung môi hoặc dung dịch đệm

cho qua cột để loại một số tạp chất đã được giữ trên pha rắn Dung môi sử dụng phải đảm bảo loại được tạp chất mà không kéo theo chất phân tích

(4) Rửa giải: Dùng dung môi thích hợp kéo chất phân tích ra khỏi pha rắn Cần

tối ưu hóa loại dung môi, lượng dung môi, pH dung môi rửa giải và tốc độ rửa giải

để đảm bảo rửa được tối đa lượng chất phân tích và tối thiểu tạp chất có trên cột Chiết pha rắn là kỹ thuật mới khắc phục được các nhược điểm của chiết lỏng- lỏng: lượng dung môi sử dụng ít, dịch chiết dễ xử lý khi kết nối GC, HPLC, khả năng làm giàu mẫu tốt, đặc biệt có ưu điểm là cơ chế chiết đa dạng phù hợp với chất phân tích, tính chọn lọc tốt hơn Tuy nhiên có nhược điểm là khó lưu giữ chất phân cực mạnh, khó xây dựng được quy trình chiết tối ưu, lượng dung môi đã giảm nhiều nhưng hãy còn lớn, giá thành của phương pháp còn cao

1.3.2 Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng khối phổ: [12], [16]

Sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) là kỹ thuật phân tích chất dựa trên sự kết nối giữa sắc ký lỏng hiệu nâng cao (HPLC) và phân tích khối phổ (MS) Về cơ bản, có

thể coi sắc ký lỏng khối phổ là phương pháp sắc ký lỏng sử dụng detector khối phổ Trong phân tích khối phổ của bất kỳ chất nào, trước tiên nó phải được chuyển sang trạng thái bay hơi, sau đó được ion hoá bằng các phương pháp thích hợp Các ion tạo thành được đưa vào đo trong bộ phân tích khối của máy khối phổ Tùy theo loại điện tích của ion nghiên cứu để chọn kiểu quét ion dương hoặc âm Kiểu quét ion dương thường cho nhiều thông tin hơn về ion nên dùng phổ biến hơn 1.3.2.1 Sắc ký lỏng hiệu năng cao [1], [3], [18], [24]

 Khái niệm

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kĩ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp thụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ tùy thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng

 Nguyên tắc

Mẫu phân tích được hòa tan trong dung môi và cho qua cột bằng một dòng chất lỏng liên tục (pha động) Các chất tan là thành phần của mẫu di chuyển qua cột theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào hệ số phân bố giữa chất tan với pha tĩnh và pha động Nhờ tốc độ di chuyển qua cột khác nhau, các thành phần của mẫu sẽ tách riêng biệt thành dải, làm cơ sở cho phân tích định tính và định lượng 1.3.2.2 Cơ sở lý thuyết của phương pháp khối phổ [2], [12]

- Phương pháp phổ khối lượng là một kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu Tỷ số này được biểu thị bằng đơn vị khối lượng nguyên tử (Atomic mass unit) hoặc bằng Dalton 1 amu = 1 Da và bằng khối lượng của nguyên tử hydro

- Các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ phận phân tích khối trước khi đến bộ phận phát hiện (detector) Quá trình phân tích khối và phát hiện được thực hiện trong môi trường chân không (áp suất khoảng 10-5đến 10-8 Torr)

- Đối với các hợp chất hữu cơ: Cơ sở của phương pháp MS là sự ion hoá phân

tử trung hoà thành các ion phân tử mang điện tích hoặc sự bắn phá, phá vỡ cấu trúc phân mảnh phân tử trung hoà thành các mảnh ion, các gốc mang điện tích (có khối lượng nhỏ hơn) bằng các phần tử mang năng lượng cao

- Quá trình phân mảnh đặc trưng cho cấu trúc của phân tử và chỉ ra sự có mặt của những nhóm chức đặc thù, cung cấp cho người phân tích những thông tin hữu ích về cấu tạo hoặc nhận dạng của chất phân tích Quá trình phân mảnh là cơ sở giúp ta biện giải phổ, nhận dạng hoặc khẳng định cấu trúc của chất phân tích

1.3.2.3 Cấu tạo và nguyên lý vận hành của hệ thống sắc ký lỏng khối phổ [1],

[2], [12], [16], [18]

 Cấu tạo

Cấu tạo của thiết bị khối phổ bao gồm các phần chính : bộ phận nạp mẫu, bộ nguồn ion, bộ phân tích khối, detector và bộ phận xử lý dữ liệu Mẫu được đưa vào qua bộ phận nạp mẫu, các ion tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ phân tích khối để tách các ion theo trị số m/z trước khi đến detector Tất cả quá trình này diễn ra trong hệ thiết bị chân không với áp suất giao động từ

10-3 Pa đến 10-6 Pa

Hình 1.5 Cấu tạo thiết bị khối phổ

Trong đó:

(1) Bộ nạp mẫu (Inlet)

(2) Bộ nguồn ion hóa (Ion source)

(3) Bộ phận phân tích khối (mass analyzer)

3

2

1

(4) Bộ phận phát hiện (Detector)

(5) Bộ phận ghi và xử lý số liệu (data system)

 Bộ phận nạp mẫu (Inlet): Đưa các mẫu cần phân tích vào nguồn ion hóa của

thiết bị khối phổ Trong sắc ký lỏng khối phổ, bộ phận nạp mẫu chính là đầu ra của cột sắc ký Có hai phương pháp nạp mẫu chính, tuỳ thuộc vào trạng thái vật lý của chất cần phân tích

- Nạp mẫu trực tiếp : Với mẫu lỏng, mẫu được đưa vào buồng trung gian (áp

suất giảm) trước khi vào buông chân không của máy Có thể tách phần hơi của mẫu trắng bằng một màng bán thấm đưa thẳng vào buồng ion hóa Dôi khi người ta nhiệt phân mẫu, khí tạo thành được dẫn vào buồng ion hóa máy khối phổ hoặc dùng kết nối GC/MS

- Nạp mẫu gián tiếp : Ở đây bộ phận nạp mẫu là đầu ra của một thiết bị phân

tích khác được kết nối với khối phổ, đó là GC/MS, LC/MS, SFC/MS, CE/MS Khi chất phân tích khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt, cần có kết nối LC/MS Khi phân tích bằng LC/MS chất phân tích được chuyển từ pha lỏng sang pha hơi để ion hóa

 Bộ nguồn ion hóa (Ion source): Chất phân tích sau khi ra khỏi cột sắc ký sẽ

được dẫn tới nguồn ion hóa Bộ phận này có nhiệm vụ ion hoá phân tử trung hoà thành các ion phân tử mang điện tích hoặc sự bắn phá, phân mảnh phân tử trung hoà thành các mảnh ion, các gốc mang điện tích bằng các phần tử mang năng lượng cao Những tiểu phân không bị ion hóa sẽ bị hút ra khỏi buồng ion qua bơm chân không của thiết bị MS Các ion phân tử tạo thành sẽ được tăng tốc độ và thu gọn (hội tụ) Mỗi ion có khối lượng m và điện tích z nhất định Tỷ số m/z (hay còn gọi là số khối) có ảnh hưởng rất lớn đối với chuyển động này của ion Đây là một thông số rất quan trọng trong định tính cũng như định lượng

Một số kĩ thuật ion hóa được sử dụng trong sắc ký lỏng khối phổ như: ion hóa phun điện tử (electrospray ionization - ESI), ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (atmospheric pressure chemical ionization - APCI)

- Ion hóa phun điện tử (ESI) : được thực hiện ở áp suất khí quyển Các mẫu

thử trong dung dịch được đưa vào nguồn ion qua một ống mao quản mà ở đầu ống

này có một điện thế có thể lên đến 5000 V Đồng thời, các dung dịch mẫu này được phun sương dưới tác động của một dòng khí Kết quả là tạo ra các hạt mang điện tích và được gia tốc đến điện cực Kỹ thuật này phù hợp cho các chất phân cực, không bền với nhiệt và các phân tử sinh học có khối lượng tới 100 000 Da Có thể dùng trong ghép nối với sắc ký lỏng hay điện di mao quản

- Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI): được thực hiện ở áp suất khí

quyển nhờ tác động của một điện cực có điện thế cao đặt trên đường đi của pha động; pha động được phun sương bằng hiệu ứng nhiệt và một luồng khí nitơ Các ion hình thành có một điện tích và là ion kiểu (M+H)+ trong chế độ phân cực dương và kiểu (M-H)- trong phân cực âm Kỹ thuật này phù cho việc ghép nối khối phổ với sắc ký lỏng

- Bộ phận phân tích khối (mass analyzer): Các ion hình thành ở nguồn ion hoá

có khối lượng m và điện tích z (tỷ số m/z được gọi là số khối) sẽ đi vào bộ phận phân tích khối Bộ phận phân tích khối có nhiệm vụ phân tách các ion có trị số m/z khác nhau thành từng phần riêng biệt nhờ tác dụng của từ trường, điện trường trước

khi đến bộ phận phát hiện và xử lý số liệu Một số bộ phân tích khối thường dùng :

- Bộ phân tích tứ cực (Quadrupole Analyser)

- Bộ phân tích bẫy ion tứ cực (Quadrupole Ion-Trap Mass Analyser)

- Bộ phân tích thời gian bay (Time of Flight Analyser)

- Bộ phân tích từ (Magnetic analyser)

Trong nghiên cứu này sử dụng bộ phân tích tứ cực:

 Bộ phân tích tứ cực gồm có bốn thanh kim loại song song hình trụ được đặt đối xứng hai bên đường đi của các ion; các cặp đối diện với nhau qua trục đối xứng của các thanh điện cực được nối điện với nhau Điện thế của hai cặp thanh điện cực

là đối nhau Điện thế này là tổ hợp của một thành phần một chiều và một thành phần xoay chiều Các tứ cực đóng vai trò như một bộ lọc khối Các ion hình thành trong nguồn ion được truyền đi và tách bằng cách thay đổi thế đặt trên các điện cực Chỉ những ion có trị số m/z phù hợp mới có thể đi qua được bộ lọc này

 Hiện nay, có loại dùng bộ phân tích gồm ba tứ cực xếp nối tiếp nhau Q1, Q2,

Q3 (gọi là bộ tứ cực chập ba) để ghi phổ Tứ cực Q1, Q3 làm nhiệm vụ phân tích khối, tứ cực Q2 là ngăn để cho các ion va chạm, tạo ra các ion mảnh nhỏ hơn, khí dùng cho va chạm thường là khí argon Kỹ thuật phân tích khối phổ kiểu này được gọi là khối phổ hai lần MS/MS và thường được dùng để khẳng định cấu trúc các chất hữu cơ và phân tích hỗn hợp nhiều thành phần

 Bộ phận phát hiện ion (Detector): Detector bao gồm điện cực năng lượng

cao (HED) và ống nhân điện tử Sau khi đi ra khỏi bộ phân tích khối lượng, các ion được đưa tới bộ phận phát hiện ion, tác dụng lên cực HED và tạo ra các điện tử Chùm điện tử hướng vào ống nhân điện từ và tạo ra tín hiệu Dòng ion được nắn lệch trục sao cho các phần tử nhiễu không đi vào detector và làm giảm nhiễu đáng

kể Do chùm ion không trực tiếp bắn phá ống nhân điện tử nên độ bền của detector được tăng lên rõ rệt

Có hai loại bộ phận phát hiện phổ biến:

- Bộ phận phát hiện nhân electron: là một trong những detector phổ biến nhất,

có độ nhạy cao Các ion đập vào bề mặt của các chất bán dẫn làm bật ra các electron Các electron được gia tốc, va chạm tiếp với các chất bán dẫn khác để tạo

ra các electron khác, quá trình này tiếp diễn và kết quả là tạo thành dòng các electron Các electron được thu nhận và số lượng của chúng sẽ tỷ lệ với số lượng ion đến detector

- Bộ phận phát hiện nhân quang: cũng giống như thiết bị nhân electron, các

ion ban đầu đập vào một bề mặt chất bán dẫn tạo ra dòng các electron Các electron sau đó sẽ va đập vào một bề mặt phát quang và tạo ra các photon Các photon này được thu nhận và số lượng của chúng tỷ lệ với số lượng ion Ưu điểm của phương pháp này là các ống nhân quang được đặt trong chân không nên loại bỏ được các khả năng nhiễm bẩn

 Một số chế độ thu phổ:

 Thu tín hiệu toàn phổ (SCAN)

Với chế độ SCAN, bộ phận phát hiện sẽ thu nhận được tất cả các mảnh ion được tạo thành từ mẫu phân tích để cho khối phổ gồm tất cả các ion và tỷ lệ tương

đối giữa Chế độ này thường dùng để định danh hay phân tích cấu trúc khi chất phân tích có nồng độ đủ lớn Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ SCAN thường được lựa chọn để khảo sát ion mẹ

 Thu tín hiệu chọn lọc ion (Selected Ion Monitoring - SIM)

Trong chế độ SIM, bộ phận phát hiện chỉ ghi nhận tín hiệu một số mảnh ion đặc trưng cho chất cần xác định Khối phổ SIM chỉ cho tín hiệu của các ion đã được lựa chọn trước đó, do vậy không thể dùng để nhận danh hay so sánh với các thư viện phổ có sẵn Ứng dụng chế độ này để định lượng khi đã biết mảnh ion đặc trưng của chất phân tích

 Thu tín hiệu chọn lọc ion hai lần (Selected Reaction Monitoring - SRM và

Multiple Reaction Monitoring - MRM):

Đối với máy khối phổ hai lần, 2 kỹ thuật ghi phổ có độ nhạy cao thường được

sử dụng là SRM và MRM

- Chế độ SRM: cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion đó, trong các mảnh

ion sinh ra, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào bộ phận phát hiện

- Chế độ MRM: trên thực tế, do yêu cầu về mặt kỹ thuật đối với phân tích vi

lượng nên các ion con cần quan tâm thường từ 2 trở lên, do vậy kỹ thuật ghi phổ MRM thông dụng hơn SRM Đầu tiên, cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ cực thứ nhất, phân mảnh ion cô lập đó tại tứ cực thứ 2 để thu được các ion con, cô lập 2 (hoặc nhiều) ion con cần quan tâm ở tứ cực thứ 3 và đưa vào bộ phận phát hiện

 Ưu điểm khi lựa chọn MS kết nối với HPLC

- MS cho thông tin về cấu trúc của các cấu tử phân tích bao gồm phân tử lượng, phổ khối lượng,…

- Cho phép định lượng được nhiều cấu tử mà không cần tách sắc ký triệt để

- Có thể tìm ra các pic không tinh khiết (rửa giải đồng thời hoặc sát nhau)

- Với hầu hết các chất phân tích, độ nhạy cao hơn nhiều so với các detector khác khi phân tích bằng HPLC

- LC-MS bổ sung cho các loại detector khác: phân biệt các cấu tử có cùng phổ

UV hoặc cấu tử không có đáp ứng cho bất kỳ một loại detector HPLC nào khác

- Kỹ thuật MS nhiều lần cho phép nghiên cứu cấu trúc các hợp chất chưa biết

 Ưng dụng của sắc ký lỏng khối phổ

Sắc ký lỏng khối phổ thường được dùng trong dược phẩm để phân tích:

- Các hoạt chất tương đối phân cực hoặc phân cực nhiều, khó bay hơi (GC-MS thường không thực hiện hoặc rất khó thực hiện)

- Các phân tích kiểm nghiệm phức tạp mà HPLC không giải quyết được

- Xác định mức độ tinh khiết của chất chuẩn hoặc mẫu chuẩn cần phân tích

- Phân tích thuốc trong dịch sinh học, độc chất học, định lượng dư lượng thuốc trừ sâu, chất bảo quản, chất cấm trong các mẫu thực phẩm, mỹ phẩm, dược liệu, thủy hải sản và môi trường

- Phân tích các hợp chất tự nhiên trong cây thuốc

- Trường hợp không tìm được detector thích hợp

Nam và trên thế giới

- Nghiên cứu của Dương Hồng Anh và cộng sự (2006) đã xây dựng được phương pháp phân tích sự có mặt của các kháng sinh họ Floroquinolon trong nước thải bệnh viện Nhóm nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn dùng cột silicagel tự chế tạo và định lượng được các kháng sinh Ciprofloxacin, Norfloxacin, Levofloxacin, Ofloxacin và Lomefloxacin có mặt trong nước thải bệnh viện bằng HPLC với detector huỳnh quang Điều kiện sắc ký: cột C16, nhiệt độ cột 50ºC, tốc

độ dòng 0,7ml/phút, bước sóng kích thích 278nm và bước sóng phát xạ 445nm Hiệu suất thu hồi trong nền nước thải đạt từ 80 đến 106% và giới hạn phát hiện trong khoảng 0,5 đến 1,0 µg/L [4]

- Luận văn thạc sĩ Dược học của Trần Thị Thanh Huế (2013) đã xây dựng phương pháp xác định dư lượng Cefixim có trong nước thải từ cơ sở sản xuất Dược

Đề tài sử dụng kỹ thuật HPLC, chiết với cloroform và acid hóa bằng HCl đến pH 3 Điều kiện sắc ký: Cột Luna C18, detector DAD: λ = 285 nm, thể tích tiêm mẫu: 200

µl, nhiệt độ cột: 32ºC, pha động: methanol – dung dịch đệm phosphat pH = 3,2

(dung dịch NaH2PO4 40 mM, chỉnh pH bằng H3PO4) Giới hạn phát hiện là 6,68 ng/ml [11]

- Luận văn thạc sĩ Dược học của Nguyễn Văn Thuận (2014) đã xây dựng được phương pháp xác định dư lượng 03 kháng sinh: Cefixim, Cefuroxim và Cephalexin trong nước thải Đề tài sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ và phương pháp chiết pha rắn Giới hạn phát hiện của các kháng sinh từ 0,58 – 1,22 ng/ml Phương pháp

đã được sử dụng để phân tích các kháng sinh này trong mẫu nước thải nhà máy sản xuất dược [16]

- Nghiên cứu của Vishal Diwan và cộng sự (2010) đã xây dựng và đánh giá

dư lượng của 7 kháng sinh: Amoxicillin, Ceftriaxon, Amikacin, Ofloxacin, Ciprofloxacin, Norfloxacin và Levofloxacin trong nước thải tại một bệnh viện ở Ấn

Độ Nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn và phương pháp HPLC-MS/MS Kết quả đã xây dựng được phương pháp với LOD từ 0,01 đến 2,5 ng/ml tùy thuộc vào kháng sinh Phương pháp này đã được ứng dụng để phân tích sự có mặt các kháng sinh trên ở trong nước thải bệnh viện tại một số thời điểm khác nhau [23]

- Luận án tiến sĩ của Haomin Xu ở Trường Đại học California, Irvine (2010)

đã xây dựng phương pháp và đánh giá hàm lượng kháng sinh Amoxicilin, thuốc chẹn Beta, Trimetropim và Cimetidin có trong nguồn nước tự nhiên tại châu Âu và

Mỹ Trong đó, điều kiện phân tích Amoxicilin như sau: máy HPLC Agilent 1200 với 2 detector là UV-VIS và huỳnh quang, cột C18 Phenomenex, pha động dung dịch đệm phosphat 10mM pH 3,0: methanol (85:15), tốc độ dòng: 1,0ml/phút; bước sóng phát hiện 230nm Các phương pháp này đã được ứng dụng để nghiên cứu quá trình quang chuyển hoá của các hợp chất trên [29]

- Một nghiên cứu của Dennis McQuellan và cộng sự (2002) tại New Mexico

đã phát hiện ra một số chất như: chống trầm cảm, chống dị ứng, viêm, kháng sinh

và hoóc môn trong nước ở nồng độ nanogam/lít Các nhà nghiên cứu đã sử dụng phương pháp HPLC-MS để phát hiện sự tồn tại các kháng sinh Tetracyclin và nhóm

Macrolid có trong các nguồn nước tự nhiên [22]

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.1 Hoá chất - chất chuẩn

Bảng 2.1 Các nguyên liệu nghiên cứu

1 Cefadroxil monohydrat (Hàm lượng:

5 Acetonitril dùng cho HPLC Merck (Đức)

6 Acid formic dùng cho HPLC Merck (Đức)

2.1.2 Máy móc - trang thiết bị

- Máy sắc ký lỏng khối phổ Agilent Technologies 6460 Triple Quad LC/MS, Agilent (Mỹ)

- Cột Agilent SB C18 1,8 µm, 2,1 × 50 mm, (Mỹ)

- Bộ chiết pha rắn LiChrolut, Merck (Đức)

- Cột chiết pha rắn OASIS HLB Cartridge 200 mg, 6ml, Oasis (Mỹ)

- Thiết bị siêu âm Ultrasonic Cleaner Set, Wisd (Hàn Quốc)

- Máy đo pH Eutech Instruments pH 510, Cyberscan (Mỹ)

- Máy lọc hút chân không

- Màng lọc 0,45µm Cellulose acetate, Sartorius (Đức)

- Cân phân tích AB204 (chính xác đến 0,1mg), Mettler Toledo (Mỹ)

- Thiết bị đuổi dung môi bằng khí N2 Pierce Reacti – Therm / #18822 (Mỹ)

- Các dụng cụ thủy tinh trong phân tích

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu

- Mẫu trắng: Nước thải ở cơ sở sản xuất Dược có sản xuất kháng sinh cefadroxil và cefotaxim không sản xuất các kháng sinh này ít nhất 7 ngày, kiểm tra bằng LC-MS/MS không phát hiện có cefotaxim và cefadroxil (dưới LOD của các kháng sinh)

2.2.1 Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng kháng sinh trong nước

thải bằng LC - MS/MS

2.2.1.1 Phương pháp thu thập, xử lý mẫu thô trước khi tiến hành chiết tách

- Lấy nước thải từ nhà máy sản xuất kháng sinh trong giai đoạn nhà máy

không sản xuất kháng sinh

- Xử lý mẫu thô: lọc qua giấy lọc, màng lọc thủy tinh, màng lọc 0,45µm, acid hóa đến pH 2 bằng HCl 10%, loại tạp bằng Na2EDTA

- Bảo quản mẫu sau khi lấy ở 2 - 8 oC

2.2.1.2 Phương pháp chiết tách β-lactam từ nước thải

Do mẫu có tính chất phức tạp và lượng chất phân tích trong mẫu (nếu có) rất nhỏ, lựa chọn phương pháp chiết pha rắn để chiết tách và làm giàu mẫu với các kháng sinh β-lactam nghiên cứu

- Loại cột chiết sử dụng: Cột chiết pha rắn OASIS HLB Cartridge 200 mg, 6ml

- Quy trình hoạt hóa cột: Hoạt hóa cột bằng 10ml MeOH + 5ml H2O + 5ml H2O pH 2

- Thể tích mẫu: 100 ml nước thải đã được acid hóa đến pH 2

- Dung môi rửa giải: 1 ml hỗn hợp dung môi MeOH : H2O (1:1)

2.2.1.3 Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng cefadroxil và cefotaxim

trong nước bằng phương pháp LC - MS/MS

Xây dựng quy trình phân tích sao cho có thể sử dụng định lượng đồng thời Cefadroxil và Cefotaxim trong mẫu thử nghiên cứu Tiến hành khảo sát theo các nội dung sau:

 Khảo sát lựa chọn chuẩn nội: đảm bảo phân tách tốt và phù hợp với các chất phân tích (có tính chất tương tự với các chất phân tích), dự kiến sử dụng chuẩn nội

là đồng vị đánh dấu của kháng sinh nghiên cứu

 Khảo sát điều kiện khối phổ:

Tiến hành khảo sát các điều kiện khối phổ ở chế độ autotune:

+ Nguồn ion hóa

+ Tốc độ khí phun

+ Tốc độ khí làm khô

+ Điều kiện phân mảnh ion mẹ để tạo ion con

+ Lựa chọn ion con để định lượng, định tính

 Khảo sát điều kiện sắc ký: thành phần và tỷ lệ pha động, tốc độ dòng, thể tích tiêm để có thể tách và phát hiện đồng thời các kháng sinh Cefadroxil, Cefotaxim

ở nồng độ ppb, sắc đồ đẹp, thời gian phân tích không quá dài

- Pha động: Khảo sát trên ít nhất 2 hệ pha động có thành phần khác nhau, tiến hành phân tích với cả chương trình chạy đẳng dòng và chạy gradient

- Tốc độ dòng: Khảo sát với 3 mức tốc độ khác nhau, đánh giá sắc ký đồ thu được về thời gian lưu, khả năng tách các chất phân tích

- Thể tích tiêm: Tiến hành sắc ký với các thể tích tiêm khác nhau trong khoảng

từ 1 - 10µl Đánh giá sắc ký đồ thu được về hình dạng pic, độ lặp lại

2.2.2 Thẩm định quy trình phân tích đã xây dựng [15], [19], [28]

Tiến hành thẩm định phương pháp trên mẫu tự tạo chứa các kháng sinh nghiên cứu với các chỉ tiêu: