ứng dụng phơng pháp xác định Clenbuterol và Salbutamol trong thức ăn chăn nuôi bằng kỹ thuật Elisa (enzyme Link imunosorrbent assay) Th Khang, Phan Thanh m, Dng Th Thu Anh, o c Ho. Phũng Phõn tớch Thc n v sn phm chn nuụi 1. Đặt vấn đề Clenbuterol v salbutamol l nhng cht thuc nhúm Agonits cú tỏc dng lm gión ph qun. õy l mt dc phm s dng ủ ủiu tr hen suyn trờn ngi, cỏc trng hp viờm phi d ng trờn nga v viờm ủng hụ hp trờn bũ. Ngi ta khỏm phỏ rng khi dựng liu cao cỏc cht Agonits theo ủng ming, thuc cú th to ra mt s gia tng nhanh chúng v rừ rt s tng khi c ủng thi lm gim khi lng m. Cỏc nh chn nuụi ủó phỏt hin ra tỏc dng k diu ny ca Clenbuterol v Salbutamol nờn ủó b sung vo trong thc n gia sỳc, gia cm nhm to ra nhng con vt cú quy tht nc hn v tng trng nhanh hn nhm thu li nhun cao (Eshaq v cng s, 2003). Tuy nhiờn, ngi ta ủó phỏt hin ra s tn d ca Clenbuterol v Salbutamol trong tht v ph tng, ủc bit l gan ca nhng con vt ủc nuụi bng thc n cú cha cỏc cht ny v ủó gõy nh hng ủn sc kho ngi tiờu th (Yu v cng s., 2004). Hin nay M, Canaủa, v cỏc nc trong liờn minh chõu u ủó cm s dng cỏc cht thuc nhúm beta Agonits. Vit Nam, B Nụng nghip v PTNT cng ủó ra quyt ủnh s 54/2002/Q-BNN ngy 20 thỏng 06 nm 2002, cm s dng cỏc cht thuc nhúm Agonist trong thc n chn nuụi. Tuy nhiờn vic s dng bt hp phỏp cỏc cht cm nh Clenbuterol v Salbutamol vn cú trờn th trng thc n chn nuụi nc ta. Trờn th gii ủó cú nhiu phng phỏp phõn tớch hin ủi, chớnh xỏc ủ xỏc ủnh Clenbuterol v Salbutamol trong thc n chn nuụi bng sc ký khớ khi ph (Hasnoot v cng s , 1994 ; He v cng s ., 2005) nhng vi chi phớ rt cao. Ngoi ra, phng phỏp ELISA cng ủó ủc s dng rng rói ủ xỏc ủnh cỏc cht d lng thuc tr sõu, ủc t nm mc (Skerritt,1998). Vit Nam, vic kim tra cỏc cht cm trong thc n chn nuụi gp rt nhiu khú khn do cha ủc trang b thit b hin ủi ủ th xỏc ủnh chớnh xỏc cỏc cht ny trong thc n chn nuụi v cha cú mt bỏo cỏo no v phng phỏp phõn tớch Clenbuterol v Salbutamol trong thc n chn nuụi. Nội dung của đề tài là ứng dụng quy trình phân tích của nhà sản xuất bộ kít chuẩn Clenbuterol và Salbutamol của hãng BIOO SCIENTIFIC - M bằng phơng pháp ELISA để xác định sự có mặt của các chất Clenbuterol và Salbutamol trong thức ăn chăn nuôi. Phơng pháp của nhà sản xuất đa ra là định lợng các chất Clenbuterol và salbutamol trong thức ăn chăn nuôi. Tuy vậy độ chính xác của kết quả phân tích còn phu thuộc vào kỹ năng và thiết bị thí nghiệm và thành phần của mẫu thí nghiệm. Mc ủớch ca nghiờn cu ny l ủỏnh giỏ ủ n ủnh v ủ chớnh xỏc ca phng phỏp phõn tớch ELISA ủ xỏc ủnh cỏc cht Clenbuterol v Salbutamol trong thc n chn nuụi. 2. Vật liệu và phơng pháp thực hiện 2 . V t liu nghiờn cu i tng nghiờn cu: - Mu thc n chn nuụi, nhng sn phm ủ b sung vo trong thc n chn nuụi. - Hoỏ cht : + S dng 2 loi b kit chun Salbutamol v Clenbuterol ca hóng BIOO SCIENTIFIC - M . Trong mi b kit chun ny cú mt khay ủng 96 ging ủó ph cht ủc bit (khỏng nguyờn) v cht chun Salbutamol hoc Clenbuterol ủó ủc pha sn theo cỏc nng ủ khỏc nhau v cỏc hoỏ cht ủ thc hin xột nghim ELISA. + Cỏc hoỏ cht ủ x lý mu ban ủu trc khi tin hnh xột nghim trờn ELISA nh acetonitrile, ethyl acetate, n-hexan l nhng hoỏ cht tinh khit ca MERCK(c). Nc ct dựng ủ pha loóng l nc ct 2 ln. a ủim Phũng phõn tớch thc n v sn phm chn nuụi - Vin Chn Nuụi. Thi gian T thỏng 4 ủn thỏng 9 nm 2006. 2.2. Phng phỏp thc hin Cỏch b trớ thớ nghim - X©y dùng ®−êng chuÈn cña Clenbuterol vµ Salbutamol dùa trªn 6 loại nồng ñộ chất chuẩn (Salbutam dmol hoặc Clenbuterol) khác nhau: 0 ppb; 0.05ppb; 0.15ppb; 0.5ppb; 1.5ppb; 4.5ppb. Đường chuẩn của mỗi chất ñược xây xựng dựa trên 5 nồng ñộ chuẩn trên và % hấp thụ tối ña của mẫu tương ứng với 6 nồng ñộ trên - Chất chuẩn Clenbuterol và Salbutamol ñược thêm vào mẫu trắng ở các nồng ñộ khác nhau : 1ppb; 2ppb; 3ppb; 4ppb. Mỗi mức nồng ñộ thêm vào mẫu trắng ñược lặp lại 10 lần. - So sánh kết quả phân tích của 3 mẫu thức ăn chăn nuôi ñược phân tích bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ(GC-MS) tại phòng thí nghiệm - Bộ Nông nghiệp của Malaysia và phương pháp ELISA tại phòng phân tích Viện Chăn Nuôi. Nguyên lý c a ph ng pháp Dùa trªn nguyªn lý cña ph¶n øng kh¸ng thÓ – kh¸ng nguyªn. Kháng nguyên ñược cố ñịnh trên bề mặt của giếng phân tích. Kháng nguyên tự do (chất cần phân tích) và một lượng kháng thể cố ñịnh ñược cho vào. Kháng nguyên tự do(chất cần phân tích) và kháng nguyên cố ñịnh sẽ cạnh tranh ñể bám vào kháng thể. Lượng kháng nguyên tự do càng nhiều thì lượng kháng thể bị kháng nguyên cố ñịnh giữ lại càng ít. Sau khi rửa trôi các chất còn dư, dùng một kháng thể thứ 2 có ñánh dấu enzym ñể phát hiện lượng kháng thể ban ñầu bị giữ lại. Bằng phản ứng tạo màu và phép ño cường ñộ mầu tại bước sóng 450nm và cường ñộ màu này tỷ lệ nghịch với nồng ñộ chất cần phân tích. Từ ñó suy ra lượng kháng nguyên tự do (chất cần phân tích) là bao nhiêu. Quy trình th c hi n X lý mẫu Thêm 8 ml Acetonitrile và 1ml Ethyl acetate. Làm ñồng ñều hỗn hợp trong 3 phút. Ly tâm 5 phút với lực RCF 4.000g và lấy 6 ml dung dich lớp trên vào ống nghiệm mới Thêm 1 ml n- hexan và 1ml 1x PBS. Làm ñồng ñều hỗn hợp trong 1 phút Ly tâm 5 phút với lực RCF 4.000g và lấy 50 µl phần dung dịch lớp dưới ñem phân tích trên ELISA ở bước sóng 450 nm. Trộn ñều mẫu, nghiền qua mắt sàng 1mm Cân khoảng 1.g mẫu. 3 (ppb ) 2.4. Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu thu thập ñược xử lý theo phương pháp thống kê sinh vật học, phân tích phương sai (ANOVA) bằng phần mềm Minitab version 14.0 for Window 2000, sử dụng mô hình thống kê tuyến tính tổng quát (GLM) . KÕt qu¶ vµ th¶o luËn Mỗi bộ kit chuẩn của từng chất Clenbuterol hoặc Salbutamol có 96 giếng ñược phủ sẵn kháng nguyên và các hoá chất cần thiết ñể thực hiện xét nghiệm ELISA. Nếu một số lượng mẫu lớn (khoảng 40 mẫu) có thể thực hiện trong thời gian ngắn (4h) như vậy số lượng mẫu phân tích nhiều sẽ giảm chi phí phân tích và tiết kiệm thời gian. B¶ng 1. ết qu thu h i c a các ch t chuẩn ñược thêm vào mẫu tr ng n Kết quả thu ñược (ppb) % thu hồi của chuẩn R.S.D (%) Nồng ñộ Clenbuterl (ppb) m SE m SE 1 10 0.724 0.015 72.40 1.5 6.35 2 10 1.459 0.029 72.95 1.45 6.30 3 10 2.29 0.024 76.33 0.8 3.33 4 10 2.969 0.014 74.23 1.70 7.83 Qua kết quả bảng 1 trên ta thấy hiệu suất thu hồi của chất Clenbuterol ở các mức thêm vào mẫu trắng từ 1- 4 ppb ñã ñạt kết quả từ 72.40% ñến 76.33 % và ñộ lệch chuẩn (R.S.D) nhỏ hơn 10%. Như vậy, các kết quả hoàn toàn trong khoảng cho phép chấp nhận ñược. B¶ng 2 . ết quả thu h i của ch t chuẩn ñược thêm vào mẫu tr ng Nồng ñộ Salbutamol n Kết quả thu ñược (ppb) % thu hồi của chuẩn R.S.D (%) (ppb) (ppb) (ppb) m SE m SE 1 10 0.71 0.011 70.80 1.15 5.15 2 10 1.40 0.044 70.05 2.18 9.85 3 10 2.39 0.072 79.67 2.46 9.55 4 10 3.22 0.056 80.50 1.38 5.44 Qua kt qu bng 2 trờn, ta thy hiu sut thu hi ca cht Salbutamol cỏc mc thờm vo mu trng t 1- 4 ppb ủt t 70.05% ủn 80.50 % v ủ lch chun (R.S.D) nh hn 10%. Nh vy, cỏc kt qu ủ ủỏnh giỏ ủ n ủnh ca phng phỏp hon ton trong khong cho phộp ca phõn tớch. Bảng 3. sỏnh kt qu phõn tớch gi a phng phỏp v . Tờn mu n Kt qu phõn tớch ti Vin Chn Nuụi (ppb)(ELISA) Kt qu phõn tớch ti Malaysia (ppb)(GC-MS) Clenbuterol Salbutamol Clenbuterol Salbutamol m SEM m SEM m SEM m SEM Mu s 1 7 0.00 0.00 0.00 0.00 Mu s 2 7 3.074 0.042 5.978 0.059 Mu s 3 7 4.004 0.049 6.524 0.064 Qua kt qu bng 3.2 ta thy mu õm tớnh (khụng cú cht Clenbuterol v Salbutamol) thỡ kt qu gia 2 phng phỏp phõn tớch thng nht nh nhau. Nhng 2 mu dng tớnh (Cú cht Clenbuterol hoc Salbutamol) thỡ kt qu gia 2 phng phỏp hon ton khỏc nhau. Giỏ tr chờnh lch trung bỡnh gia kt qu ca phng phỏp GC-MS v ELISA ủi vi Clenbuterol l 2.904 ppb v ủi vi salbutamlol l 2.52ppb vi p <0.001.Mt khỏc phng phỏp phõn tớch GC- MS ủc phõn tớch trung tõm phõn tớch xột nghim - Malaysia trờn thit b phõn tớch hin ủi, chớnh xỏc cú ủ tin cy cao. Nh vy so sỏnh vi kt qu phõn tớch trờn GC-MS thỡ cỏc kt qu phõn tớch trờn ELISA ủi vi mu dng tớnh khụng cú giỏ tr ủnh lng chớnh xỏc cht cn phõn tớch . Kết luận và đề nghị 4.1. Kt lu n - Phương pháp ELISA ñã xác ñịnh ñược các chất Clenbuterol và Salbutamol trong thức ăn chăn nuôi và hoàn toàn phù hợp là phương pháp phân tích thường xuyên trong phòng thí nghiệm về phân tích thức ăn chăn nuôi có ñộ ổn ñịnh và ñộ chính xác chấp nhận ñược với hiệu suất thu hồi > 65% và ñộ lệch chuẩn RSD < 10% - Phân tích bằng phương pháp ELISA phù hợp ñể sàng lọc với số lượng mẫu lớn, tiết kiệm thời gian chi phí phân tích. - Các kết quả phân tích Clenbuterol và Salbutamol trong thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp ELISA ñược trả lời kết quả chính xác ở dạng ñịnh tính có nghĩa là có hay không Clenbuterol và Salbutamol. .2. Đề nghị Tiếp tục ñược nghiên cứu phân tích các chất cấm khác trong thức ăn chăn nuôi như nitrofuran, chloramphenicol, cimaterol….bằng phương pháp ELISA. Tµi liÖu tham kh¶o 1. Eshaq et al., 2003 Eshq,S.C. Chai,S. Jamokha, G.Aznar and M.K. Hoffman, Determinationof ractopamin in animal tissue by liquid chromatography- fluorescence and liquid chromatography/tandem mass spectrometry, Anal.Chim. Acta 483 (2003), pp. 137-145. 2. Hassnoot et al .,1994 W.Hassnoot, P.Stouten and A.M.Lommen, Determination of fenoterol and ractopamin in urine by enzyme immunoassay, Analyst 119 (1994), pp. 2675- 2680. 3. He et al., 2005 L.M.He, Y.J.Su and H.J.Zhang, Detection of clenbuterol in animal tissues and feeds by cappilary gas chromatography- mass spectrometry, J.Chin.Mass Spectrom.Sos.26 (2005), pp. 168-172. 4. Yu et al., 2004 H.X. Yu and S.M. Yang, Advance in detremination of ractopamin residues in animal tissues end excrements, Chin.J.Vet.Drug 38 (2004), pp. 44- 47. 5. Limin et al., Yijuan Su, Zhenling Zeng, Yahong Liu and Xianhui Huang, Determination of ractopamin and clenbuterol in feeds by gas chromatography – mass spectrometry, J. Animal Feed Science and Technology 3 (2007), pp.316-323. Skeritt., 1998. Approate 3nalytical Technologies for Monitoring Agrochemical Residues.In Seeking Agricultural Produce Fee of Pesticide Residues. Internatioanal Workshop held in Yogyakarta, Indonesia, 17- 19 February 1998. ACIAR Proceeding No.85. ISBN 1 86320 2277, Canberra Australia. . để xác định sự có mặt của các chất Clenbuterol và Salbutamol trong thức ăn chăn nuôi. Phơng pháp của nhà sản xuất đa ra là định lợng các chất Clenbuterol và salbutamol trong thức ăn chăn nuôi. . ứng dụng phơng pháp xác định Clenbuterol và Salbutamol trong thức ăn chăn nuôi bằng kỹ thuật Elisa (enzyme Link imunosorrbent assay) Th Khang, Phan. và Salbutamol trong thức ăn chăn nuôi và hoàn toàn phù hợp là phương pháp phân tích thường xuyên trong phòng thí nghiệm về phân tích thức ăn chăn nuôi có ñộ ổn ñịnh và ñộ chính xác chấp nhận