phương pháp xác định clenbuterol và salbutamol trong thức ăn chăn nuôi và dư lượng trong thịt

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI TIỂU LUẬN MÔN HỌC Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm Đề tài: PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CLENBUTEROL VÀ SALBUTAMOL TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI VÀ DƯ LƯỢNG TRONG THỊT Hà Nội, tháng năm 2017 Mục lục LỜI MỞ ĐẦU Trong năm gần đây, tình hình an toàn thực phẩm vấn đề nóng, quan tâm hàng đầu không nước mà giới Có nhiều vụ gian lận thực phẩm xảy giới như: Thịt cừu giả thịt bò Anh, Thịt ngựa dán mác thịt bò, hay Thịt chuột đội lốt thịt cừu Trung Quốc… Nước ta không ngoại lệ với vụ đình đám thịt lợn giả thịt bò hay dùng chất kích thích tăng trưởng, chất tạo nạc, Tất vấn đề làm niềm tin người tiêu dùng mua sản phẩm thực phẩm hết ảnh hưởng đến sức khỏe tính mạng Clenbuterol salbutamol chất thuộc nhóm Beta-Agonits có tác dụng làm giãn phế quản Đây dược phẩm sử dụng để điều trị hen suyễn người, trường hợp viêm phổi dị ứng ngựa viêm đường hô hấp bò Khi uống liều cao chất Beta-Agonits làm tăng khối lượng thể làm giảm mỡ Do vậy, thuốc bổ sung vào thức ăn gia súc, gia cầm nhằm tăng thịt nạc tăng trọng nhanh Tuy nhiên, tồn dư Clenbuterol Salbutamol thịt phủ tạng, đặc biệt gan vật nuôi thức ăn có chứa chất có ảnh hưởng xấu đến sức khoẻ người tiêu dùng Hiện Mỹ, Canađa, nước liên minh Châu Âu cấm sử dụng chất thuộc nhóm BetaAgonits làm thức ăn chăn nuôi Việt Nam, Bộ Nông nghiệp PTNT định số 54/2002/QĐ-BNN ngày 20 tháng 06 năm 2002: Cấm sử dụng chất thuộc nhóm Beta- Agonist thức ăn chăn nuôi Tuy nhiên, việc sử dụng bất hợp pháp chất cấm Clenbuterol Salbutamol có thị trường thức ăn chăn nuôi nước ta Do xúc đó, nhóm em chọn tìm hiểu trình bày đề tài “Phương pháp xác định Clenbuterol Salbutamol thức ăn chăn nuôi dư lượng thịt” để từ ngăn chặn gian lận thực phẩm, bảo vệ người tiêu dùng Chương 1.1 Chất kích thích tăng trưởng họ β-agonists Clenbuterol − Công thức phân tử : C12H18Cl2ON2 − Khối lượng phân tử: 276,0796 đvC − Công thức cấu tạo − Tên gọi: 2–(tert–butylamino)–1–(4–amino–3,5–dichlorophenyl)ethanol Trong y học, clenbuterol có tác dụng làm dãn phế quản, dãn trơn cuống phổi, clenbuterol dược phẩm gây tổn định để điều trị chứng bệnh có liên quan đến phổi như: hen, suyễn, nhiên hại đến hệ thần kinh tuần hoàn người Trong thú y, clenbuterol sử dụng để điều trị bệnh dị ứng đường hô hấp ngựa (tên thương mại ventipulmin), điều trị bệnh đường hô hấp trâu, bò, Thuốc thải dần qua đường tiểu qua phân với thời gian dài 1.2 Salbutamol − Công thức phân tử: C13H21O3N − Khối lượng phân tử: 239,152 đvC − Công thức cấu tạo: Tên gọi: 2–(tert–Butylamino)–1-(3–hydroxyethyl–2–hydroxyphenyl)ethanol Salbutamol ứng dụng y học để điều trị bệnh hen suyễn hiệu nghiệm Thuốc điều trị bệnh hen suyễn có chứa salbutamol có nhiều thị trường nước giới 1.3 Tác động tới động vật nuôi người Clenbuterol salbutamol tích lũy thực phẩm thịt làm ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng thông qua dây chuyền thực phẩm, gây triệu chứng rối loạn nhịp tim, tim đập nhanh, tăng huyết áp, co thắt phế quản, phù nề, run cơ, liệt cơ, choáng váng,… Salbutamol Clenbutarol hấp thu dễ dàng qua đường tiêu hóa Vì vậy, chất tồn dư thịt người sử dụng hấp thụ nhiêu Ăn thịt tồn dư chất tạo nạc Salbutamol lâu ngày gây ảnh hưởng khôn lường cho sức khỏe 1.4 Tình hình nghiên cứu nước Việc phân tích clenbuterol, salbutamol nhiều phòng thí nghiệm Việt Nam vào năm 2006 chủ yếu thực với phương pháp ELISA (dựa vào phản ứng kháng nguyên - kháng thể) Tuy nhiên, phương pháp chủ yếu có tính sàng lọc cho kết dương tính giả Theo định 2002/657/ EC châu Âu, phương pháp sàng lọc, dù chứng minh áp dụng cho đối tượng kiểm nghiệm, phải xác minh lại phương pháp có tính khẳng định nghi ngờ kết Năm 2007, Phạm Xuân Viết cộng sự, Trường Đại Học Dược Hà Nội nghiên cứu phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao, tứ cực, để định lượng salbutamol huyết tương, hiệu suất chiết salbutamol nồng độ 10, 75, 200ppb khoảng 80% Năm 2008, Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích Thí nghiệm TPHCM nghiên cứu xây dựng qui trình phân tích clenbuterol sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) đạt hiệu suất thu hồi từ 65- 88%; giá trị LOD TACN 0,16 ppb (clen), 0,11 ppb (sal); giá trị LOD thịt 0,05 ppb (clen), 0,07 ppb (sal) báo cáo đề tài cấp thành phố năm 2008 Năm 2009, Bùi Quốc Anh (công ty Inotech – Thành phố Hồ chí Minh) nghiên cứu đề tài kit phát nhanh chất clenbuterol thịt gia súc gia cầm thời gian Tuy nhiên, phương pháp định tính dựa biến đổi màu thuốc thử Năm 2010, Nguyễn Thị Chân cộng thuộc trung tâm phân tích thí nghiệm TPHCM, nghiên cứu đề tài “Xác định clenbuterol thịt heo phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ triplequad (LC-MS/MS) ” giới hạn phát LOD = 0,03ppb Nhóm nghiên cứu không sử dụng nội chuẩn đồng vị không tận dụng ưu loại nội chuẩn Chương 2.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC Tổng quan phương pháp sắc ký 2.1.1 Nguyên tắc chung Sắc ký kỹ thuật tách cấu tử cần tách hỗn hợp mẫu vận chuyển pha động qua pha tĩnh Mẫu vào tướng động mang theo dọc hệ thống sắc kí có chưa pha tĩnh phân bố khắp Sự tương tác xảy cấu tử với pha tĩnh, nhờ cấu tử phân bố pha động pha tĩnh Sự khác lực cấu tử pha tĩnh làm chúng di chuyển với tốc độ khác pha động hệ thống sắc ký, kết chúng tách thành dải pha động vào lúc cuối trình, cấu tử theo trật tự tương tác với pha tĩnh Nếu đặt detecter có khả phát chất tan cuối cột tách tín hiệu ghi lại theo thời gian (sắc ký đồ) vị trí pic theo thời gian dùng để nhận biết định tính diện tích peak dùng cho phép phân tích định lượng Ngoài ra, định lượng xác phương pháp xây dựng đường chuẩn 2.1.2 Sắc ký lỏng hiệu cao HPLC HPLC dùng để tách, định tính định lượng thành phần hỗn hợp dựa lực khác chất với hai pha tiếp xúc không trộn lẫn pha tĩnh (được bao bên chất mang nhồi cột) pha động (dung môi rửa giải) Khi dung dịch chất phân tách đưa vào cột, chúng hấp thụ liên kết với pha tĩnh tùy thuộc vào chất cột chất cần phân tách Khi chạy sắc ký, trình hấp phụ giải hấp phụ liên tục xảy từ lúc nạp mẫu vào đến chất khỏi cột chất sau khỏi cột nhận biết tùy theo chất detecter thích hợp Mô hình hệ thống sắc ký lỏng HPLC 2.1.3 Định tính định lượng − Phương pháp định tính o So sánh thời gian lưu chất phân tích với chất đối chiếu mẫu phân tích o So sánh sắc ký đồ mẫu phân tích với sắc ký đồ mẫu phân tích them chuẩn đối chiếu − Phân tích định lượng o Phương pháp tính theo diện tích peak o Phương pháp ngoại chuẩn o Phương pháp thêm chuẩn o Phương pháp nội chuẩn 2.2 Quy trình kiểm định 2.2.1 Thiết bị hóa chất a) Thiết bị: Hệ thống máy LC-MS/MS Thermo Finnigan gồm: − Hệ thống máy sắc ký lỏng: Bơm hệ thống tiêm mẫu tự động − Đầu dò khối phổ ba tứ cực TSQ Quantum Access với hai loại nguồn ion hóa ESI APCI − Cột sắc ký lỏng pha đảo Purospher Star C18, 150 mm x 4,6 mm, kích cỡ hạt µm, cột bảo vệ pha đão C18 (hãng Merck) − Phần mềm Xcalibur, điều khiển thiết bị xử lý liệu sắc ký b) Hóa chất dung dịch thử − Nước cất lần khử ion, CH3OH loại HPLC; H3PO4, p.a (pure analysis); HCOOH loại HPLC K2HPO4, p.a (pure analysis); Dung dịch thử K2HPO4 0,1M − Dung dịch pha động: MeOH (0,1% HCOOH) H2O (0,1% HCOOH) c) − − − (v/v) Chất chuẩn nội chuẩn Clenbuterol hydrochloride, Dr Ehrenstorfer, 95% (C12H18Cl2ON2,HCl) Clenbuterol–d9 (100 mg/L), Dr Ehrenstorfer (C12H 9D9 Cl2ON2) Salbutamol sulfate, Dr Ehrenstorfer, 99 % (C13H22O3N, ½ H2SO4) − Salbutamol–d3 (100 mg/L), Dr Ehrenstorfer (C13H19D3O3N) 2.2.2 Các thông số tối ưu − Nhiệt độ tối ưu ống mao quản là 350oC − Chương trình dung môi: Khối phổ thực theo chương trình gradient dung môi  mũi sắc ký clen sal đối xứng tách tốt, thời gian lưu tương đối không lớn lắm, (5- phút), độ phân giải 5,97, hệ số đối xứng pic sắc ký (của sal clen) nằm khoảng cho phép, tạo thuận lợi cho phân tích chuỗi mẫu − Khoảng tuyến tính clen sal xây dựng đường chuẩn Với nồng độ clen từ 0,0495– 99,057μg/L, sal từ 0,0776– 155,525μg/L, mức độ phù hợp phương trình hồi quy với thực nghiệm cao, bình phương hệ số tương quan R2 = Do đó, sử dụng đường chuẩn thiết lập để phân tích clen, sal − Đệm pH = 6,0 tối ưu cho việc chiết tách đồng thời hai chất clen sal 10 2.2.3 Quy trình chuẩn bị mẫu 2.3 Kết - tính toán − Kết khảo sát độ lặp lại tín hiệu đo chuẩn clen sal 11 Kết bảng 3.17 cho thấy với lần phân tích mẫu, độ lêch chuẩn tương đối thời gian lưu không sai lệch nhiều (không vượt 1%), lặp lại cường độ tín hiệu ion có m/z 151,15; m/z 204,01(ion định lượng nội chuẩn sal-d3 clen-d9) biến thiên khoảng nhỏ 2%, chấp nhận Vì thế, dùng thời gian lưu làm yếu tố định danh yếu tố tín hiệu để định lượng clen sal − Kết khảo sát ảnh hưởng mẫu trình phân tích cho thấy diện tích pic ion dung dịch chuẩn dung dịch chuẩn thêm vào mẫu sau xử lý tương tự nhau, điều chứng tỏ hiệu ứng giai đoạn tạo ion đầu dò khối phổ − Kết xây dựng đường chuẩn clen sal thịt TACN 12 − Hiệu suất thu hồi phương pháp (HPP) đạt khoảng 100% dự đoán hiệu suất thu hồi thực (HT) mẫu khảo sát đạt kết sau: o Đối với clenbuterol : Mẫu có nồng độ 0,05-50μg/Kg, hiệu suất thu hồi đạt 68,5- 86,78% o Đối với salbutamol : Mẫu có nồng độ 0,8-75μg/Kg, hiệu suất thu hồi đạt 70,91- 85,59%  Các kết đáp ứng yêu cầu Châu Âu theo định 2002/657/EC − Kết khảo sát giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng phương pháp (LOD, LOQ) Kết cho thấy giá trị LOD clen nhỏ đáp ứng tiêu chuẩn Châu Âu, Codex phù hợp với quy định Việt Nam 13 Chương 3.1 Kỹ thuật miễn dịch enzym ELISA Tổng quan phương pháp ELISA 3.1.1 Nguyên tắc chung Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) hay gọi Kỹ thuật miễn dịch Enzym (Enzym Immuno Asay-EIA) dựa liên kết đặc hiệu kháng nguyên (chất cần phân tích, Ag) (các) kháng thể (Ab), có kháng thể gắn enzyme (E) Thông qua sản phẩm tạo thành tác dụng phản ứng enzym với chất thích hợp, ta xác định có mặt nồng độ chất cần phân tích Ở giai đoạn cuối sử dụng “phương pháp enzyme” để xác định Có nhiều phương pháp áp dụng Ví dụ: Khi cho thêm chất thích hợp vào phản ứng, enzyme thủy phân chất thành chất có màu Sự xuất màu chứng tỏ xảy phản ứng đặc hiệu kháng thể với kháng nguyên thông qua cường độ màu mà biết nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát Từ xác định có mặt nồng độ chất cần phân tích Một số dạng kỹ thuật ELISA thường dùng phân tích kiểm định nguồn gốc thực phẩm là: 14 1.1.1 ELISA trực tiếp (Direct Assay) Direct ELISA: Đây dạng đơn giản phương pháp ELISA Trong đó, kháng nguyên cần phát gắn trực tiếp lên bề mặt giá thể phát kháng thể (kháng thể gắn enzyme) 1.1.2 ELISA gián tiếp ( Indirect ELISA) Indirect ELISA: Phương pháp khác Direct ELISA chỗ kháng thể bắt kháng nguyên không gắn enzyme mà mục tiêu gắn đặc hiệu kháng thể khác (kháng thể kháng thể gắn với enzyme) Ưu điểm: Kháng thể gắn enzyme sử dụng để đánh dấu cho nhiều loại kháng nguyên nên tiện lợi kinh tế hơn, dễ dàng thương mại hóa Nhược điểm: Độ đặc hiệu kháng huyết khác Điều dẫn đến kết khác thí nghiệm cần phải thử nghiệm với nhiều kháng huyết khác để kết tin tưởng 3.1.2 ELISA bánh kẹp (Sandwich ELISA) Đây dạng ELISA sử dụng phổ biến thực tiễn cho phản ứng mạnh nhạy Được gọi “sandwich” kết thí nghiệm đánh giá thông qua kết hợp hai loại kháng thể kháng thể bắt (capture antibodies) kháng thể phát (detection antibodies) Trong ELISA bánh kẹp, kháng nguyên bám vào hai kháng thể khác Đầu tiên kháng nguyên cho phản ứng với lượng dư kháng thể gắn pha rắn, sau ủ rửa Kháng nguyên bám dính xử lý với dư lượng kháng thể thứ hai Kháng thể thứ hai gắn với enzyme có khả gắn vào kháng thể thứ ba dạng cộng gộp với enzyme (kỹ thuật ELISA “kẹp kép”- double sandwich ELISA) 15 3.2 Quy trình kiểm định 3.2.1 Các bước xử lý mẫu 16 3.2.2 Các bước tiến hành phân tích 3.3 Kết tính toán 3.3.1 Kết xây dựng đường chuẩn Clenbuterol Salbutamol Để định lượng Clebuterol Salbutamol cần có đường chất Với nồng độ khác chất Kit chuẩn hãng BIOO SCIENTIFICMỹ dựng hai đường chuẩn Clenbuterol Salbutamol 17 Đường chuẩn Clenbuterol Salbutamol Kit chuẩn hãng BIOO SCIENTIFIC Xây dựng đường chuẩn Clenbuterol Salbutamol dựa % hấp thụ tối đa chất chuẩn Clenbuterol Salbutamol nồng độ tương ứng chúng đường không tuyến tính Do vậy, kết dương tính đọc từ đường chuẩn có giá trị tương đối xác giới hạn đường chuẩn Chiều hướng hai đồ thị có % độ hấp thụ giảm dần theo mức tăng nồng độ chất chuẩn Điều phù hợp với nguyên lý phương pháp ELISA nêu Hai đồ thị dùng để xác định hàm lượng Clenbuterol Salbutamol thức ăn chăn nuôi 3.3.2 Đánh giá hiệu phương pháp Hiệu suất thu hồi Clenbuterol Salbutamol bổ sung vào mẫu trắng 90,05-97,3% với độ lệch chuẩn 2,25 - 3,89 %  độ tin cậy tính xác phương pháp cao 18 KẾT LUẬN 1) Việc pha trộn chất tạo nạc (Sal Clen) vào thức ăn chăn nuôi làm cho vật nuôi tăng trọng nhanh, dư lượng chất gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người tiêu dùng 2) Với Kit chuẩn hãng BIOO SCIENTIFIC- Mỹ dựng hai đường chuẩn cho hai chất Clenbuterol Salbutamol đáp ứng thông số kỹ thuật hãng Phân tích kỹ thuật ELISA cho thấy hiệu suất thu hồi Clenbuterol Salbutamol bổ sung vào mẫu trắng 90,0597,3% với độ lệch chuẩn 2,25 - 3,89 % 3) Kiểm định hàm lượng chất thức ăn chăn nuôi dư lượng thịt vật nuôi phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC với hệ thống sắc ký lỏng ghép khối phổ có sử dụng nội chuẩn đồng vị (salbutamol-d3 clenbuterol-d9) cho kết xác, độ tin cậy cao, qui trình đạt tiêu chuẩn phân tích theo yêu cầu Châu Âu 19 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 1) Đoàn Thị Khang, Phan Thanh Đạm, Dương Thị Thu Anh Đào Đức Hảo; Phòng Phân tích Thức ăn sản phẩm chăn nuôi - Viện Chăn nuôi Thụy Phương - Từ Liêm - Hà Nội, Ứng dụng kỹ thuật ELISA để xác định Clenbuterol Salbutamol thức ăn chăn nuôi 2) Nguyễn Thị Thu Thủy, Đại học Quốc Gia TP.HCM, trường đại học Khoa học tự nhiên; Luận án: Đánh giá hàm lượng chất β-agonists (Clenbuterol Salbutamol) thức ăn gia súc dư lượng thịt gia súc kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ 3) Nguyễn Thị Minh Tú, Hoàng Quốc Tuấn, Nguyễn Thị Thảo, Nguyễn Hoàng Dũng, Vũ Hồng Sơn, Đỗ Biên Cương, Trương Quốc Phong; Giáo trình Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm, NXB Bách Khoa Hà Nội 20 ... có thị trường thức ăn chăn nuôi nước ta Do xúc đó, nhóm em chọn tìm hiểu trình bày đề tài Phương pháp xác định Clenbuterol Salbutamol thức ăn chăn nuôi dư lượng thịt để từ ngăn chặn gian lận... Hảo; Phòng Phân tích Thức ăn sản phẩm chăn nuôi - Viện Chăn nuôi Thụy Phương - Từ Liêm - Hà Nội, Ứng dụng kỹ thuật ELISA để xác định Clenbuterol Salbutamol thức ăn chăn nuôi 2) Nguyễn Thị Thu Thủy,... lý phương pháp ELISA nêu Hai đồ thị dùng để xác định hàm lượng Clenbuterol Salbutamol thức ăn chăn nuôi 3.3.2 Đánh giá hiệu phương pháp Hiệu suất thu hồi Clenbuterol Salbutamol bổ sung vào mẫu