Toàn văn đánh giá hàm lượng các chất b agonist (clenbuterol và salbutamol) trong thức ăn gia súc và dư lượng trong thịt gia súc bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ

Xuất phát từ tình hình thực tế, trên cơ sở khoa học của các công trình nghiên cứu về salbutamol sal và clenbuterol clen được công bố trong và ngoài nước, đồng thời nhờ sự hỗ trợ về thiết

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN THỊ THU THỦY

TÊN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN

ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG CÁC CHẤT β-AGONIST (CLENBUTEROL VÀ SALBUTAMOL) TRONG THỨC ĂN GIA SÚC VÀ DƯ LƯỢNG TRONG THỊT GIA SÚC BẰNG

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

1 GS.TS Chu Phạm Ngọc Sơn

2 TS Trần Kim Tính

Tp Hồ Chí Minh - 2011

• Mục lục i

• Danh mục chữ viết tắt và ký hiệu iv

• Danh mục các bảng, hình và đồ thị vii

• Danh mục các phụ lục xv

MỞ ĐẦU 1

- Lý do chọn đề tài 1

- Mục đích nghiên cứu 2

- Đối tượng nghiên cứu 2

- Phạm vi nghiên cứu và ý nghĩa khoa học, ý nghĩa thực tiễn 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4

1.1 Tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài ở nước ngoài và trong nước 4

1.1.1 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài 4

1.1.2 Tình hình nghiên cứu ở trong nước 7

1.2 Lý thuyết về chất kích thích tăng trưởng họ β–agonists 10

1.2.1.Giới thiệu chung về nhóm chất kích thích tăng trưởng thuộc họ β–agonists……… 10

1.2.2 Clenbuterol 14

1.2.3 Salbutamol 15

1.2.4.Tình hình sử dụng chất kích thích tăng trưởng trên thế giới và ở Việt Nam 17

1.2.5 Những dấu hiệu giúp người tiêu dùng nhận biết thịt gia súc, gia cầm có chứa chất kích thích tăng trưởng

19 1.3 Phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ và một số quy định của Châu Âu về phương pháp phân tích mẫu bằng sắc ký lỏng ghép khối phổ 20

1.3.1 Giới thiệu phương pháp phân tích sắc ký lỏng ghép khối phổ 21

1.3.2 Quy trình định tính và định lượng β-agonists (sal và clen) 30

1.3.3 Kỹ thuật chiết pha rắn (Solid Phase Extraction - SPE) 30

1.3.4 Một số quy định của Châu Âu về phương pháp phân tích mẫu bằng LC-MS/MS (theo quyết định 20002/657/EC) 32

1.3.5 Độ không đảm bảo đo của phương pháp 33

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 36

2.1.Thiết bị và hóa chất 36

2.2.Xây dựng phương pháp xác định clenbuterol và salbutamol bằng sắc ký lỏng ghép khối phổ, tối ưu hóa các thông số kỹ thuật của hệ thống LC-MS/MS 38

2.2.1 Khảo sát quá trình quét phổ các ion chất chuẩn và nội chuẩn (sử dụng chế độ Full scan) 38

SRM: Selected Reaction Monitoring)

2.2.3 Khảo sát nhiệt độ ống mao quản 40

2.2.4 Khảo sát chương trình dung môi 40

2.2.5 Khảo sát khoảng tuyến tính của clen và sal trong xây dựng đường chuẩn 42

2.3 Khảo sát quy trình chuẩn bị mẫu 43

2.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của đệm pH trên khả năng giữ lại clen, sal và nội chuẩn đồng vị trên cột SCX 43

2.3.2 Khảo sát độ lặp lại của tín hiệu đo của chuẩn clen và sal 43

2.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu trong quá trình phân tích 44

2.3.4 Xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu 45

2.3.5 Xác định hiệu suất thu hồi 45

2.4 Khảo sát giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp

(Limit of Detection - LOD and Limit of Quantification -LOQ) 46 2.5 Xác định độ không đảm bảo đo 47

2.6 Thực nghiệm nuôi gà lấy mẫu – Kiểm tra dư lượng của clenbuterol và salbutamol trong mẫu thử nghiệm

53 2.6.1 Phương tiện thí nghiệm 53

2.6.2 Phương pháp thí nghiệm 55

2.7 Thực nghiệm nuôi heo lấy mẫu – Kiểm tra dư lượng của clenbuterol và salbutamol trong mẫu thử nghiệm 55

2.7.1 Phương tiện thí nghiệm 55

2.7.2 Phương pháp thí nghiệm 56

2.8 Điều tra tình hình sử dụng clenbutrol và salbutamol trong thức ăn chăn nuôi và trong thịt heo, thịt gà ở Thành phố Cần Thơ, tỉnh Hậu Giang, Tỉnh Vĩnh Long 57

2.8.1 Thu mẫu thức ăn chăn nuôi 57

2.8.2 Thu mẫu thịt heo và thịt gà 57

2.8.3 Phân tích mẫu 57

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 58

3.1 Kết quả tối ưu hóa các thông số kỹ thuật của hệ thống LC-MS/MS 58

3.1.1 Kết quả khảo sát quá trình quét phổ các ion chuẩn và nội chuẩn (sử dụng chế độ Full scan) 58

3.1.2 Kết quả khảo sát năng lượng phân mảnh của các tiền ion (chọn chế độ SRM: Selected Reaction Monitoring) 60

3.1.3 Kết quả khảo sát nhiệt độ ống mao quản 63

3.1.4 Kết quả khảo sát chương trình dung môi 64

3.1.5 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của clen và sal trong xây dựng đường chuẩn 66

3.2.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của đệm pH trên khả năng giữ lại

clen, sal và nội chuẩn đồng vị trên cột SCX 70

3.2.2 Kết quả khảo sát quy trình chuẩn bị mẫu 71

3.2.3 Kết quả khảo sát độ lặp lại của tín hiệu đo của chuẩn clen và sal 72

3.2.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu trong quá trình phân tích - xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu 74

3.2.5 Kết quả xác định hiệu suất thu hồi của clen, sal 79

3.3 Kết quả khảo sát giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp (Limit of Detection - LOD and Limit of Quantification -LOQ ) 86

3.4 Độ dao động của tỷ lệ cường độ các mảnh ion 87

3.5 Tóm tắt qui trình phân tích clen, sal bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ ba tứ cực (LC-MS/MS) 90

3.6 Kết quả tính độ không đảm bảo đo của phương pháp 94

3.7 Giới thiệu phương pháp xác định clen và sal bằng sắc ký lỏng ghép khối phổ một tứ cực (LC/MS) 95

3.8 Kết quả thử nghiệm trên gà 101

3.8.1 Kết quả theo dõi khả năng tiêu tốn thức ăn cho gà trong suốt kỳ thí nghiệm 101

3.8.2 Kết quả theo dõi khả năng tăng trọng của gà trong suốt kỳ thí nghiệm

102 3.8.3 Kết quả phân tích dư lượng của thịt gà sau khi nuôi thử nghiệm 104 3.9 Kết quả thử nghiệm trên heo 107

3.9.1 Kết quả theo dõi tiêu tốn thức ăn, sự tăng trọng của heo, hệ số chuyển hóa thức ăn 107

3.9.2 Kết quả phân tích dư lượng của thịt heo sau khi nuôi thử nghiệm 108 3.10 Kết quả điều tra tình hình sử dụng clenbuterol và salbutamol trong thức ăn chăn nuôi, thịt heo, thịt gà ở thành phố Cần Thơ, tỉnh Vĩnh Long và tỉnh Hậu giang 111

3.10.1.Kết quả điều tra thức ăn chăn nuôi năm từ năm 2007- 2009 111

3.10.2.Kết quả điều tra thịt heo và thịt gà từ năm 2007- 2009 113

3.10.3 Kết quả điều tra thịt heo, thịt gà và TACN năm 2010- 2011 116

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 117

- Kết luận 117

- Đề nghị 119

Danh mục các công trình nghiên cứu của tác giả 120

TÀI LIỆU THAM KHẢO 121 PHỤ LỤC

TRONG LUẬN ÁN

Các chữ viết tắt

APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionization ((Ion hóa

hóa học ở áp suất khí quyển)

ANOVA Analysis of Variance

Clen-d9 clenbuterol -d 9

ESI Electrospray Ionization (ion hóa tia điện)

(sắc ký lỏng hiệu năng cao)

HSCHTA Hệ số chuyển hóa thức ăn

LC/MS Liquid Chromatography Mass Spectrometry

(sắc ký lỏng ghép khối phổ)

LC/MS/MS Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

(Sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ)

LOD Limit of Detection (giới hạn phát hiện)

LOQ Limit of Quantification (giới hạn định lượng)

MRPL Minimum Required Performance Limit (Giới hạn tối

thiểu bắt buộc)

RSD% Độ lệch chuẩn mẫu tương đối theo phần trăm

SPE Solid Phase Extraction (Chiết pha rắn)

SPE-SCX Solid Phase Extraction Strong Cation Exchange

(Chiết pha rắn bằng cột trao đổi cation)

RF Radio frequency (tần số radio hay sóng cao tầng)

Sal-d 3 salbutamol-d 3

TACN Thức ăn chăn nuôi

TTTA Tiêu tốn thức ăn

Các ký hiệu

Nghiệm thức A Nghiệm thức đối chứng

Nghiệm thức B Thức ăn có hàm lượng clen 200ppb + sal 200ppb

Nghiệm thức C Thức ăn có hàm lượng clen 300ppb + sal 300ppb

Nghiệm thức D Thức ăn có hàm lượng clen 500ppb + sal 500ppb

1TA, 2TA, 3TA Gà trống nghiệm thức A (gà ăn thức ăn không chứa

1TBL , 2TBL, 3TBL Mẫu gan gà trống nghiệm thức B

3MCL Mẫu gan gà mái nghiệm thức C

3TCL Mẫu gan gà trống nghiệm thức C

3MDL Mẫu gan gà mái nghiệm thức D

3TDL Mẫu gan gà trống nghiệm thức D

PM1, PL1, PK1 Lần lượt là mẫu thịt, gan và thận heo đối chứng

PM2, PL2, PK 2 Lần lượt là mẫu thịt, gan và thận của heo (2) ăn thức

ăn chứa chứa 500ppb clen

PM3, PL3, PK3 Lần lượt là mẫu thịt, gan và thận của heo (3) ăn thức

ăn chứa chứa 500ppb clen

PM4, PL4, PK4 Lần lượt là mẫu thịt, gan và thận của heo (4) ăn thức

ăn chứa chứa 500ppb sal

PM5, PL5, PK5 Lần lượt là mẫu thịt, gan và thận của heo (5) ăn thức

ăn chứa chứa 500ppb sal

6 Bảng 2.2 Hiệu suất thu hồi và độ lặp lại của phương pháp

(salbutamol) dùng tính độ không đảm bảo đo 47

7 Bảng 2.3 Hiệu suất thu hồi và độ lặp lại của phương pháp

(clenbuterol) dùng tính độ không đảm bảo đo 50

8 Bảng 2.4 Công thức phối hợp khẩu phần cơ sở và thành phần

10 Bảng 3.2 Kết quả khảo sát năng lượng phân mảnh của tiền ion

14 Bảng 3.6 Tóm tắt kết quả tối ưu hóa năng lượng (E) phân mảnh

tiền ion clen, clen-d 9 , sal, sal-d 3 63

16 Bảng 3.8 Bảng kết quả thời gian lưu của sal, clen theo một số

17 Bảng 3.9 Kết quả thống kê thời gian lưu của sal, clen khi khối

phổ thực hiện theo chương trình gradient dung môi 66

clen và diện tích pic sắc ký

21 Bảng 3.13 Kết quả phân tích hồi qui về tương quan giữa nồng độ

22 Bảng 3.14 Ảnh hưởng pH của đệm trên khả năng giữ clen, sal

23 Bảng 3.15 Độ lặp lại của tín hiệu đo với chuẩn clen 0,495ng/mL

24 Bảng 3.16 Độ lặp lại của tín hiệu đo với chuẩn clen 0,495ng/mL

25 Bảng 3.17 Độ lặp lại của tín hiệu đo với chuẩn sal 0,776ng/mL

26 Bảng 3.18 Độ lặp lại của tín hiệu đo với chuẩn sal 0,776ng/mL

27 Bảng 3.19 Khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu trong quá trình phân

28 Bảng 3.20 Khoảng tuyến tính của clen trên nền thịt 77

29 Bảng 3.21 Khoảng tuyến tính của clen trên nền TACN 77

30 Bảng 3.22 Khoảng tuyến tính của sal trên nền thịt 78

31 Bảng 3.23 Khoảng tuyến tính của sal trên nền TACN 78

32 Bảng 3.24 Hiệu suất thu hồi của clen trên nền thịt 80

33 Bảng 3.25 Hiệu suất thu hồi của sal trên nền thịt 81

34 Bảng 3.26 Hiệu suất thu hồi của clen trên nền TACN 82

35 Bảng 3.27 Hiệu suất thu hồi của sal trên nền TACN 83

36 Bảng 3.28 Hiệu suất thu hồi của clen trên nền gan 84

37 Bảng 3.29 Hiệu suất thu hồi của sal trên nền gan 85

(b2) Trị số LODtb và LOQtb của sal trên nền TACN 87

42 Bảng 3.31 Tỉ lệ ion chính và phụ của clen và sal trên dung dịch

43 Bảng 3.32 Tỉ lệ ion chính và phụ của clen và sal trên nền thịt 88

45 Bảng 3.34 Tỉ lệ ion chính và phụ của clen và sal trên nền gan 89

46 Bảng 3.35 Tỉ lệ ion chính và phụ của clen và sal trên nền thận 90

47 Bảng 3.36 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của clen và

50 Bảng 3.39 Khoảng tuyến tính của sal ( LC/MS) 98

51 Bảng 3.40 Khoảng tuyến tính của clen ( LC/MS) 98

52 Bảng 3.41 Hiệu suất thu hồi và giá trị RSD% của sal trên mẫu

53 Bảng 3.42 Hiệu suất thu hồi và giá trị RSD% của clen trên mẫu

54 Bảng 3.43 Kết quả xác định LODClen của nền thịt heo và TACN 100

55 Bảng 3.44 Kết quả xác định LODsal của nền thịt heo và TACN 100

56 Bảng 3.45 So sánh LOD và hiệu suất thu hồi khi phân tích clen

104

60 Bảng 3.49 Kết quả phân tích hàm lượng clen + sal (nghiệm thức

A, B) sau thời gian nuôi gà, lấy mẫu 105

61 Bảng 3.50 Kết quả phân tích hàm lượng clen +sal (nghiệm thức

C, D) sau thời gian nuôi gà, lấy mẫu 106

62 Bảng 3.51 Bảng tổng kết dư lượng clen, sal trong thịt gà, gan gà

63 Bảng 3.52

Ảnh hưởng các mức độ bổ sung clen + sal lên tăng trọng trung bình và Hệ số chuyển hóa thức ăn của heo thí nghiệm

107

64 Bảng 3.53 Hàm lượng clenbuterol sau 18 tuần nuôi heo, lấy mẫu,

STT Danh sách

2 Hình 1.2 Cấu trúc hóa học nhóm chất β2-agonist có tác dụng

6 Hình 1.6 Sơ đồ hệ thống ion hóa theo kỹ thuật APCI 24

7 Hình 1.7 Sơ đồ hệ thống ion hóa theo kỹ thuật ESI 25

28

13 Hình 3.1.b Cơ chế phân mảnh của clenbuterol-d9 59

15 Hình 3.2.b Cơ chế phân mảnh của salbutamol-d 3 59

16 Hình 3.3 Đường chuẩn clenbuterol theo các nồng độ ở bảng

20 Hình 3.7 Biểu đồ thể hiện đường chuẩn clen trên nền thịt 77

21 Hình 3.8 Biểu đồ thể hiện đường chuẩn clen trên nền TACN 78

22 Hình 3.9 Biểu đồ thể hiện đường chuẩn sal trên nền thịt 78

24 Hình 3.11 Sơ đồ tóm tắt quy trình phân tích clen và sal 91

27 Hình 3.14

Ảnh hưởng các mức độ bổ sung chất kích thích lên tăng trọng, tiêu tốn thức ăn (TTTA) và hệ số chuyển hóa thức ăn (HSCHTA) của gà thí nghiệm

104

28 Hình 3.15 Biểu đồ biểu diễn dư lượng clen trên thịt gà thử

29 Hình 3.16 Biểu đồ biểu diễn dư lượng sal trên thịt gà thử nghiệm 107

30 Hình 3.17 Biểu đồ thể hiện tỉ lệ nhiễm clen và sal trong các mẫu

31 Hình 3.18 Biểu đồ so sánh mức độ nhiễm clen, sal trong các

2 Đồ thị 3.2 Tối ưu hóa năng lượng (E) phân mảnh tiền ion

clen-d9 thành ion con (m/z =204,01) 61

3 Đồ thị 3.3 Tối ưu hóa năng lượng (E) phân mảnh tiền ion sal

thành ion con (m/z=148,10 và m/z=166,01) 62

4 Đồ thị 3.4 Tối ưu hóa năng lượng (E) phân mảnh sal-d 3 thành

5 Đồ thị 3.5 Tối ưu hóa nhiệt độ ống mao quản của hệ thống khối

6 Đồ thị 3.6 Biểu đồ biến đổi cường độ ion theo pH của dịch

STT PHỤ LỤC Danh mục các phụ lục Trang

1 Phụ lục 1.a Dấu hiệu cảm quan giúp người tiêu dùng

nhận biết thịt gia súc, gia cầm có chứa clen 1

2 Phụ lục 1.b

Quyết định số 54/QĐ –BNN ngày 20/06/2002

về việc cấm sản xuất, nhập khẩu lưu thông và

sử dụng một số loại kháng sinh hóa chất trong sản xuất và kinh doanh thức ăn chăn nuôi.

2

3 Phụ lục 2.1 Máy móc thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 3

4 Phụ lục 2.2 Một số hình ảnh trong thí nghiệm nuôi gà 4

5 Phụ lục 2.3 Một số hình ảnh trong thí nghiệm nuôi heo 4

6

Phụ lục 3.1 Quá trình quét phổ các ion chất chuẩn và nội

8 Phụ lục 3.3 Khảo sát chương trình dung môi 10-16

10

Phụ lục 3.5 Ảnh hưởng của đệm pH trên khả năng giữ

11 Phụ lục 3.6 Độ lặp lại tín hiệu đo của clen và sal 23-28

12 Phụ lục 3.7 Sắc ký đồ của hiệu suất thu hồi của clen và sal 29-36

MỞ ĐẦU

Lý do chọn đề tài

Trong lĩnh vực dược phẩm, β-agonist là nhóm chất được sử dụng nhiều trong điều trị bệnh hen suyễn, điều trị bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính, hai chất điển hình là salbutamol và clenbuterol [14] Những chất này được xếp chung với nhóm thuốc điều trị bệnh hen suyễn phổ biến hiện nay Salbutamol được dùng cho người với tên biệt dược là Albuterol, Salbutamol…Clenbuterol được dùng với tên biệt dược là Broncodil, Clenburol, Ventolax, Protovent (Theo tài liệu trên trang web http://en.wikipedia.org/wiki/Salbutamol)

Trong chăn nuôi, các hoạt chất này đã có lúc được đưa vào trong thức ăn gia súc nhằm làm giảm lớp mỡ dưới da, làm tăng cơ, tăng trọng đối với thú vật nuôi Theo nhiều nghiên cứu, các loại biệt dược này gây hại cho gia súc và cả cho người nếu ăn phải thịt thú vật nuôi bằng loại thức ăn có trộn các loại biệt dược trên, vì các hóa chất thuộc nhóm β-agonist thường là những chất kích thích mạnh, làm suy nhược chức năng gan [14]

Tại Châu Âu và Châu Mỹ, những loại hóa chất trên bị cấm sử dụng Ở Việt Nam, các loại biệt dược thuộc nhóm β-agonist trong đó có clenbuterol và salbutamol được xếp vào danh mục 18 hóa chất bị cấm của Bộ Nông Nghiệp và

Phát Triển Nông Thôn (Quyết định số 54 ngày 20 tháng 06 năm 2002 của Bộ NN & PTNT)[11] Tuy nhiên, các chất này vẫn còn bị một bộ phận người dân lén sử dụng trong chăn nuôi và việc kiểm tra sự hiện diện của chúng trong thức ăn gia súc, gia cầm vào những năm 2005-2008 phần lớn chỉ dừng lại ở mức độ định tính và định lượng bằng phương pháp ELISA với độ chính xác chưa cao Việc định lượng chính xác dư lượng của các β-agonist trong thức ăn chăn nuôi là vấn đề cần được quan tâm trong công tác kiểm tra chất lượng sản phẩm Đồng thời, việc xác định tồn dư β-agonist trong thịt một số gia súc là rất cần thiết về mặt quản lý để đánh giá tình hình mức độ sử dụng các chất này trong thức ăn chăn nuôi và đưa ra những cảnh báo về vệ sinh an toàn thực phẩm nếu có

Việc sử dụng chất kích thích tăng trưởng trong chăn nuôi thực sự ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe người tiêu dùng Qua dây chuyền thực phẩm, chúng có thể tích lũy dần trong cơ thể con người, đến một liều lượng nhất định sẽ gây ngộ độc cho người tiêu dùng Xuất phát từ tình hình thực tế, trên cơ sở khoa học của các công trình nghiên cứu về salbutamol (sal) và clenbuterol (clen) được công bố trong

và ngoài nước, đồng thời nhờ sự hỗ trợ về thiết bị của Trung tâm Đào tạo và Phát triển Sắc ký TP Hồ Chí Minh, Phòng Thí nghiệm Chuyên sâu của trường Đại Học

Cần Thơ, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Đánh giá hàm lượng các chất β- agonists (clenbuterol và salbutamol) trong thức ăn gia súc và dư lượng trong thịt gia súc bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ”

Nghiên cứu này sẽ góp phần vào việc bảo đảm vệ sinh an toàn thực phẩm và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng

Mục đích nghiên cứu

Đề tài này được thực hiện với mong muốn :

• Xây dựng được phương pháp phân tích dư lượng clen và sal trong thức ăn chăn nuôi, thịt gia súc, gia cầm bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ đạt độ nhạy cao, đáp ứng được nhu cầu phân tích của các đơn vị kiểm nghiệm trong nước

• Theo dõi mức độ tồn lưu của clenbuterol và salbutamol trong thịt gà, thịt heo khi nuôi gà, heo với thức ăn có chứa clen và sal

• Điều tra sơ bộ tình hình sử dụng hợp chất β-agonist, cụ thể là sal và clen, trong thức ăn gia súc và thịt gia súc ở một số tỉnh đồng bằng sông Cửu Long (Cần Thơ, Vĩnh Long, Hậu Giang) với mong muốn góp phần với các cơ quan chức năng đảm

bảo vệ sinh an toàn thực phẩm cho người tiêu dùng trong nước

Đối tượng nghiên cứu

a Các mẫu thức ăn gia súc: lấy mẫu từ các cơ sở bán thức ăn gia súc, gia cầm gồm một số loại như sau: Newhope (NH), Master (MT), Higro (HG), Cataco (CTC), Con cò (CC), Cargill (CG), S80 (TAS80), Sowtech (Biên Hòa) (ST), ADB Complex (Hậu Giang) (ADBC), ODBAS (Biên Hòa) (ODBAS), Tăng tốc

11C30 (TTC30) , Thức ăn Thiên niên biến (TATNB), Trư đại đại 671 (TĐĐ), Cám thường (CT)(mẫu được lấy từ tháng 7 năm 2007 đến tháng 12 năm 2009)

b Mẫu thịt gia súc (heo), gia cầm (gà) dùng thử nghiệm bằng cách nuôi trực

tiếp sau đó lấy mẫu để kiểm tra khả năng tồn lưu của sal và clen

c Mẫu thịt, thận, gan dùng cho điều tra: được lấy từ các tỉnh Vĩnh Long, Hậu

Giang, Thành phố Cần Thơ

Phạm vi nghiên cứu và ý nghĩa khoa học, ý nghĩa thực tiễn

• Xây dựng phương pháp chuẩn bị mẫu để đạt tỉ lệ thu hồi cao và tránh được hiệu ứng khử ion ở đầu dò khối phổ vận hành theo chế độ ESI, đảm bảo tính chính xác của phương pháp phân tích định lượng

• Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ ba tứ cực để nhận danh

và định lượng dư lượng của β-agonist trong thức ăn gia súc và thịt gia súc, gia cầm

• Qua phân tích nhiều mẫu thức ăn gia súc và thịt gia súc, gia cầm, sơ bộ

đánh giá tình hình sử dụng các β- agonist hiện nay Các kết quả này có thể góp phần làm cơ sở đánh giá mức độ sử dụng bất hợp pháp β-agonist trong nước

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài ở nước ngoài và trong nước 1.1.1 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài

Năm 1999, nghiên cứu của tác giả Peter R.Cheeke cho thấy:

• Để đạt được danh hiệu vô địch trong các cuộc thi hội chợ, người ta đã cho các con vật sử dụng “doping” với clenbuterol để tăng khối cơ

• Người tiêu thụ gan động vật sử dụng thức ăn chứa clenbuterol có biểu hiện run rẩy, tim đập nhanh, đau đầu, chóng mặt và buồn nôn

• Dư lượng của clenbuterol tồn tại trong võng mạc mắt và trong tóc lâu tới vài tháng

Năm 2001, tác giả Woodward K.N[77] thuộc viện nghiên cứu về thuốc thú y ở

Anh đã nghiên cứu quá trình chuyển hóa và độc tính của clenbuterol trên một số loài động vật (chuột, khỉ, trâu, bò, ngựa)

Các tác giả Warriss P D và cộng sự (1990 và 1991) [73],[74], Fawcett J P và

cộng sự (2004)[40] đã nghiên cứu ảnh hưởng của salbutamol lên thịt heo, một số chuyển hóa về mặt sinh học của gia súc khi sử dụng hợp chất này

Do tính độc hại của các hợp chất thuộc nhóm β-agonist, từ nhiều năm, các nhà nghiên cứu trên thế giới đã không ngừng phát triển các các phương pháp, quy trình

để xác định clenbuterol, salbutamol nói riêng và các hợp chất thuộc nhóm β-agonist nói chung Nhiều phương pháp khác nhau được nghiên cứu: phương pháp ELISA, sắc ký khí (GC), sắc ký lỏng (LC), sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS), sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS) Các trị số thường được dùng cho việc đánh giá độ chính

xác của các phương pháp phân tích chủ yếu là giới hạn phát hiện (LOD) hoặc giới

hạn định lượng (LOQ), hiệu suất thu hồi, các trị số này trên nguyên tắc cần đáp ứng các quy định và tiêu chuẩn đã có của Châu Âu và của Codex

Theo các tài liệu đã công bố, từ năm 1990 đến 1999, nhiều tác giả đã nghiên cứu phương pháp phân tích clenbuterol, salbutamol bằng LC-MS, LC-MS/MS với các giá trị LOD cho clenbuterol trong nhiều nền mẫu khác nhau (thịt, gan, thận, thức ăn gia súc, mẫu máu ) thường đạt từ 0,02 đến 0,5 ppb [33]; [34],[41],[50],[54],[72],[75];

với phương pháp phân tích β-agonist trên các nền mẫu sinh học bằng sắc ký khí (GC-MS), các nghiên cứu được công bố cho giá trị LOD < 0,5 ppb hoặc không công bố giá trị LOD [55] Riêng trong năm 1999, Guy và cộng sự[43] thuộc trung tâm

nghiên cứu Nestlé - Switzerland đã thông báo phương pháp phân tích clenbuterol trong thịt gia súc bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ ba tứ cực (với qui trình chiết mẫu bằng HClO4) với LOD đạt 0,01 ppb, hiệu suất thu hồi đạt 63-70%

Từ năm 2001 đến năm 2004, nhiều tác giả đã sử dụng sắc ký khí hoặc sắc ký lỏng ghép khối phổ một tứ cực để phân tích clenbuterol, salbutamol trong các nền mẫu sinh học, giới hạn phát hiện cho các nghiên cứu này từ 0,8-2,5 ppb (cho clenbuterol), 3,5ppb (cho salbutamol), hiệu suất thu hồi lớn hơn 90% [66],[69]

- Năm 2005 Kootstra P.R và cộng sự[51] thuộc Viện Nghiên cứu sức khỏe và môi trường ở Hà Lan đã sử dụng kỹ thuật tách chiết bằng cột SPE với cột nhồi là loại polymer in dấu phân tử (MIPs: Molecularly Imprinted Polymers) và kết hợp với phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ (bẩy ion) để phân tích các chất thuộc nhóm β-agonist trong thịt bò Giới hạn phát hiện đạt được 0,1 ppb

- Năm 2006 Liu Pengyan và cộng sự[64] thuộc khoa Hóa, Trường Đại Học

Hebei (Bắc Kinh – Trung Quốc) công bố kết quả nghiên cứu xác định hàm lượng clenbuterol trong thịt heo bằng GC-MS (chiết mẫu bằng HClO4) với hiệu suất thu hồi 73,4% , giới hạn phát hiện LOD = 0,4ppb

- Năm 2007 Limin He và cộng sự[44] thuộc trường Đại học Nông Nghiệp phía

Nam Trung Quốc đã nghiên cứu xác định ractopamine và clenbuterol trong thức ăn chăn nuôi bằng sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS), hiệu suất thu hồi đo ở nồng độ

10, 100, 5000ppb là 64,4%, giá trị của LOD Ractopamine đạt 4ppb và LODClenbuterol đạt

2ppb Cũng trong năm 2007, Lee H B và cộng sự cũng công bố kết quả nghiên

cứu khi phân tích các β-agonists trong nước thải bằng sắc ký lỏng ghép khối phổ

với giá trị hiệu suất thu hồi khoảng 85% ở các nồng độ từ 0, 05 đến 0,5ppb.[56]

- Năm 2008 Michel A.M và cộng sự[61], khoa nông nghiệp trường Đại học Autonomus – Mexico đã thông báo kết quả phân tích dư lượng của clenbuterol trong thức ăn chăn nuôi và trong thịt bò bằng phương pháp ELISA và GC/ MS (giới

hạn phát hiện là 0,2ppb) Ngoài ra, cũng trong năm 2008, nhiều nghiên cứu về phương pháp phân tích clenbuterol, salbutamol và các β-agonits khác trên thịt heo hoặc các nền mẫu sinh học khác như nước tiểu, máu, bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ hay kỹ thuật sắc ký khí ghép khối phổ cho các giá trị LOD từ 0,1 đến

9 ppb[18],[38]

- Năm 2009 Jensuino B và cộng sự [47] đã thông báo nghiên cứu về tính bền của clenbuterol trong mẫu nước tiểu trong 12 tuần và mẫu gan trong 20 tuần nếu được bảo quản ở nhiệt độ 4 , -20 và -60oC, phân tích mẫu bằng GC-MS

Cũng trong năm 2009, Zhai C và cộng sự[81] thông báo kết quả phân tích dư lượng của β-agonist trong thịt heo, bằng kỹ thuật LC-MS/MS ba tứ cực với LODclen= 0,02 ppb, LODsal = 0,05 ppb, hiệu suất thu hồi từ 78- 101% Xu J và cộng

sự[78] cũng thông báo kết quả nghiên cứu phương pháp phân tích dư lượng β-agonist trong thực phẩm có nguồn gốc từ động vật bằng LC-MS/MS với LOQ cho clenbuterol, salbutamol là 0,1 ppb

- Năm 2010, Pleadin J., và cộng sự [65] công bố phương pháp xác định dư lượng của clenbuterol trong thịt heo bằng ELISA và kỹ thuật LC/MS/MS với LOD dưới 0,1 ppb sau khi cho heo uống clenbuterol với nồng độ 20 μg/kg trọng lượng heo, trong 1 ngày

Cũng trong năm 2010, Xu Z ,và cộng sự[79] thuộc Khoa Hóa và kỹ thuật hóa, trường đại học Sun Yat-sen (Trung quốc) đã công bố phương pháp phân tích ractopamine, isoxpurine, clenbuterol trong thịt, gan, thận heo bằng cách kết hợp kỹ thuật chiết mẫu bằng SPE với cột nhồi là loại polymer in dấu phân tử MIP (Molecularly imprinted polymers) và kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp (HPLC), với LOD

từ 0,1-0,21 ppb, hiệu suất thu hồi từ 83,7- 92,3 %

Đầu năm 2011, Liu B., và cộng sự [58] thuộc khoa Hóa trường đại học Baodinh, Trung quốc đã thông báo phương pháp xác định clenbuterol trong thịt heo bằng quy trình chiết pha rắn (có sự hỗ trợ trong quá trình chiết bằng sóng siêu âm) và kỹ thuật HPLC-UV, giới hạn phát hiện LODclen = 0,07ppb, hiệu suất thu hồi từ 87,9-103,6%

Nhìn chung, β-agonists không được phép sử dụng làm chất tăng trọng trong

thức ăn chăn nuôi ở nhiều nước trên thế giới, hàm lượng tối đa cho phép (MRLs)

hiện nay chỉ có quy định cho clenbuterol với MRL là 0,1 ppb trong thịt, 0,5ppb

trong gan theo Châu Âu [30] hoặc 0,2ppb trong thịt và 0,6 ppb trong gan theo Codex

Alimentarius [25] Riêng đối với Việt nam β-agonist tuyệt đối bị cấm sử dụng trong

TACN và do đó không được có trong thịt gia súc, gia cầm Trên cơ sở các dữ liệu

đã có này, các trị số LODClen trong các phương pháp phân tích clenbuterol trong thịt

đã nêu là còn khá lớn, trừ trị số trong báo cáo của Guy năm 1999

(LODclen= 0,01ppb) và của Zhai năm 2009 ( LODclen = 0,02 ppb) đạt yêu cầu theo

qui định của Châu Âu và Codex đã nêu trên [25],[43],[81]

1.1.2 Tình hình nghiên cứu ở trong nước

- Năm 2005, một số thông tin trong nước cho biết hiện tượng bất thường được

ghi nhận như gà đẻ hai trứng trong một ngày hoặc gà bị chết bất thường do sự hiện

diện của clenbuterol trong thức ăn chăn nuôi (TACN) (TACN được phân tích bằng

phương pháp Elisa ở Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích Thí Nghiệm TP Hồ Chí Minh)

- Năm 2006, trong hội thảo về hormon tăng trưởng do Viện Khoa Học Kỹ

Thuật Nông nghiệp miền Nam và Hiệp hội thức ăn chăn nuôi tổ chức, Cục Chăn

nuôi (Bộ NN&PTNT) đã công bố kết quả kiểm tra (từ 20/6 - 3/11/2006) theo đó cơ

quan chức năng đã phát hiện 47/428 mẫu dương tính với clenbuterol (theo

http://www.namyangi.com.vn/vi-vn/zone/34/item/1939/page/26/item.cco)

- Việc phân tích clenbuterol, salbutamol tại nhiều phòng thí nghiệm ở Việt

Nam vào năm 2006 chủ yếu được thực hiện với phương pháp ELISA (dựa vào phản

ứng kháng nguyên - kháng thể)[6] Tuy nhiên, phương pháp này chủ yếu có tính sàng

lọc và có thể cho kết quả dương tính giả Theo quyết định 2002/657/ EC của châu

Âu, một phương pháp sàng lọc, dù đã được chứng minh có thể áp dụng được cho

đối tượng kiểm nghiệm, vẫn phải được xác minh lại bằng một phương pháp có tính

khẳng định hơn nếu có nghi ngờ về kết quả Nhìn chung phương pháp sàng lọc

ELISA có độ tin cậy không thật cao

- Năm 2007, Phạm Xuân Viết và cộng sự[16], Trường Đại Học Dược Hà Nội đã nghiên cứu phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò khối phổ một tứ cựcđể định lượng salbutamol trong huyết tương, hiệu suất chiết salbutamol ở các nồng độ 10, 75, 200ppb khoảng 80%

- Năm 2008, Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích Thí nghiệm TPHCM đã nghiên cứu và xây dựng qui trình phân tích clenbuterol bằng sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) đạt hiệu suất thu hồi từ 65- 88%; giá trị LOD đối với TACN là 0,16 ppb (clen), 0,11 ppb (sal); giá trị LOD đối với thịt là 0,05 ppb (clen), 0,07 ppb (sal) [báo cáo nghiệm thu đề tài cấp thành phố năm 2008- chủ nhiệm đề tài là thạc sỹ Chu Vân Hải] Theo Codex Alimentarius với các chất giới hạn cho phép nhỏ hơn 0,1 ppm (MRL ≤ 0,1 ppm) thì giá trị LOD của phương pháp phân tích phải nhỏ hơn hoặc bằng một phần năm của MRL ( LOD ≤1/5 MRL)[48] Vì vậy, nếu áp dụng tiêu chuẩn Châu Âu (MRL clen cho thịt 0,1ppb) hay theo tiêu chuẩn Codex Alimentarius (MRLclen cho thịt 0,2ppb), thì trị số LOD đã đạt được trong nghiên cứu nêu trên còn hơi lớn

- Năm 2009, Bùi Quốc Anh (công ty Inotech – Thành phố Hồ chí Minh) nghiên cứu đề tài bộ kit phát hiện nhanh chất clenbuterol trong thịt gia súc gia cầm trong thời gian 2 giờ Tuy nhiên, đây chỉ là phương pháp định tính dựa trên sự biến đổi màu của thuốc thử Để biết hàm lượng của clenbuterol cần phải dùng các kỹ thuật

phân tích khác (Bài viết “Bộ kit phát hiện thịt nhiễm Clenbuterol” của tác giả Thái

Ngọc trên báo Đất Việt)

- Năm 2010, Nguyễn Thị Chân và cộng sự [2] thuộc Trung tâm Phân tích Thí

nghiệm TPHCM, đã nghiên cứu đề tài “ Xác định clenbuterol trong thịt heo bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ triplequad (LC-MS/MS) ” giới hạn phát

hiện LOD = 0,03ppb Nhóm nghiên cứu không sử dụng nội chuẩn đồng vị và do đó không tận dụng được ưu thế của loại nội chuẩn nầy Giá trị LODClen trong nghiên cứu này phù họp với MRL 0,2 ppb theo tiêu chuẩn Codex [25], nhưng không phù hợp với MRL 0, 1 ppb theo Châu Âu

- Về các nghiên cứu của chúng tôi:

+ Năm 2007, trong lúc nhiều phòng thí nghiệm vẫn còn dùng phương pháp ELISA để kiểm tra clenbuterol thì nhóm tác giả Nguyễn thị Thu Thủy, Lâm văn

Xự, Phạm thị Ánh, Trần Kim Tính, Chu Phạm Ngọc Sơn, đã nghiên cứu thành công

phương pháp phân tích clenbuterol trong thức ăn chăn nuôi và sản phẩm thịt bằng

sắc ký lỏng ghép khối phổ một tứ cực (LC/MS) ( báo cáo tại hội nghị Hóa học Châu Á lần thứ 12, tháng 8 năm 2007 tại Kuala Lumpur, Malaysia - International

```Symposium on Food Analysis, Chemistry and Technology, 12th Asian Chemical Congress, August 23-25, 2007, Kuala Lumpur, Malaysia và trong Tạp chí Khoa học

và Công nghệ, năm 2008) Tuy kỹ thuật LC/MS một tứ cực không đạt độ nhạy và

độ chọn lọc bằng sắc ký lỏng ghép khối phổ ba tứ cực LC-MS/MS, nhưng giá trị LOD cũng khá thấp (LODClen (thịt): 0,038 ppb và LODClen (TACN): 0,497 ppb) Giá trị LODClen này (≤1/5 MRL) phù hợp đối với trị số MRL 0,2 ppb theo tiêu chuẩn của Codex, không phù hợp đối với MRL 0,1 ppb theo tiêu chuẩn Châu Âu

+ Cuối năm 2007, nhóm tác giả Nguyễn thị Thu Thủy, Lâm văn Xự, Phạm thị Ánh, Trần Kim Tính, Chu Phạm Ngọc Sơn, Kefei Wang, tiếp tục nghiên cứu phương pháp phân tích clenbuterol trong thức ăn chăn nuôi và sản phẩm thịt bằng sắc ký lỏng ghép khối phổ ba tứ cực (LC-MS/MS) với LOD = 0,01 ppb cho thịt

heo, điểm mới là có sử dụng thêm nội chuẩn đồng vị Clenbuterol-d9 để loại trừ ảnh hưởng nền mẫu khi tách chiết và sự khử ion nếu có khi định lượng với đầu dò khối

phổ theo chế độ ESI (+) (Báo cáo tại hội nghị về khối phổ 56 th ASMS Conference

on Mass Spectrometry and Allied Topics, 1-5 tháng 6 năm 2008 ở Denver, Colorado, Mỹ) Trị số LODClen công bố 0,01 ppb phù họp với cả tiêu chuẩn về MRL của Châu Âu và Codex Chính phương pháp nầy được áp dụng trong điều tra mức độ tồn dư clenbuterol và salbutamol trong thịt heo, thịt gà trên thị trường hoặc

do chúng tôi tự nuôi với thức ăn có chứa clenbuterol và salbutamol

+ Năm 2009, nhóm tác giả Nguyễn thị Thu Thủy, Nguyễn Nhựt Xuân Dung, Phạm thị Ánh, Chu Phạm Ngọc Sơn nghiên cứu ảnh hưởng của clenbuterol, salbutamol trên sự tăng trọng gà, heo và đánh giá độ tồn lưu của chúng trên gà heo

bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ ba tứ cực (LC/MS/MS) (bài báo được

đăng vào số 1, 2 / Tập XVI của Tạp chí phân tích Hóa Lý và Sinh học Việt Nam

năm 2011)

+ Vào tháng 4 năm 2011, nhóm tác giả Nguyễn thị Thu Thủy, Lâm văn Xự,

Phạm thị Ánh, Chu Phạm Ngọc Sơn, Trần kim Tính đã báo cáo về phân tích

salbutamol trong thịt và thức ăn chăn nuôi bằng LC-MS/MS ở Hội Nghị Quốc Tế

Analytica 2011 tổ chức tại Thành phố Hồ Chí Minh

1.2 Lý thuyết về chất kích thích tăng trưởng họ β-agonists

1.2.1 Giới thiệu chung về nhóm chất kích thích tăng trưởng thuộc họ

β–agonists[3], [24]

β-agonists là loại hợp chất cường giao cảm, kích thích tăng trưởng gồm những

hợp chất tổng hợp có dẫn xuất từ thiên nhiên như là Adrenaline và Noradrenaline do

tủy của tuyến thượng thận tiết ra Chúng là một nhóm thuốc gồm nhiều hóa chất

khác nhau

Nhóm chất thuộc họ β–agonists được chia thành nhiều loại tùy theo tác dụng của

các hợp chất

- Nhóm β 1 –agonists

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của nhóm chất β 1 -agonist

- Nhóm β2 –agonists thường dùng trong điều trị hen suyễn dưới dạng hít, tác

dụng sau 2 - 3 phút, kéo dài 3- 5 giờ gồm các chất trình bày trong bảng 1

Ventolin) Salmeterol (Serevent Diskus) Indacaterol

Terbutaline Formoterol (Foradil)

Pirbuterol (Maxair) Bambuterol

Procaterol Clenbuterol

Orciprenaline Metaproterenol

(Alupent)

Fenoterol Bitolterol mesylate

Ritodrine

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học nhóm chất β2-agonist có tác dụng kéo dài

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học nhóm chất beta β2-agonist có tác dụng ngắn

Ngoài ra còn có nhóm thuộc β-agonist nhưng chưa được phân loạichính xác như :

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học nhóm chất β-agonist chưa được phân loại

Trong số các chất kích thích tăng trưởng thuộc họ β2–agonists, có 2 hợp chất thường được sử dụng để trộn vào thức ăn chăn nuôi ở Việt Nam là clenbuterol và salbutamol

– Tính tan: tan nhiều trong H2O,

CH3OH, C2H5OH, tan ít trong CHCl3, không tan trong C6H6

Công thức cấu tạo

Cl

Cl

H 2 N

NH OH

Tên gọi 2–(tert–butylamino)–1–(4–amino–3,5–dichlorophenyl)ethanol

1.2.2.2 Clenbuterol trong y học[42],[63]

- Một số tên gọi khác của clenbuterol trong y học: Spiropent, Ventipulmin

- Trong y học, clen có tác dụng làm dãn phế quản, dãn cơ trơn ở cuống phổi, clen còn là dược phẩm được chỉ định để điều trị các chứng bệnh có liên quan đến phổi như hen suyễn, tuy nhiên có thể gây tổn hại đến hệ thần kinh và tuần hoàn của con người

1.2.2.4 Đối với người[14]

Nhiều người chăn nuôi đã sử dụng một cách trái phép clen để cho vào thức ăn gia súc, gia cầm Đối với cơ thể vật nuôi, clenbuterol có tác dụng thúc đẩy việc phát triển cơ bắp và phân giải lipid, tăng tỷ lệ nạc so với mỡ Nó còn có tác dụng phân phối năng lượng, nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn Đặc biệt, clen là hợp chất rất

dễ tồn dư trong thịt và thường tạo thành hiện tượng trúng độc cấp và mãn tính khi

con người sử dụng thực phẩm thịt có tồn dư clen Một số tác hại cho con người do

ăn phải thịt gia súc, gia cầm có chứa clen như: đau tim, run cơ, tim đập nhanh, tăng huyết áp, choáng váng, phù nề, liệt cơ, co thắt phế quản, khó thở, đau đầu[ 5],[35] Ngoài ra nếu con người sử dụng thường xuyên thịt gia súc, gia cầm có chứa clen thì clen sẽ được tích lũy trong cơ, gan có thể dẫn đến những căn bệnh nguy hiểm có liên quan tới tính mạng như: ung thư, tai biến tim,… Nguy hiểm hơn, clen

là chất bền vững với nhiệt độ, hầu như không biến đổi, không mất đi trong quá trình nấu ở nhiệt độ lên đến 100oC (nếu qua chiên dầu ở nhiệt độ 260oC trong khoảng 5 phút thì có thể mất) Đây là mối nguy hại đến sức khỏe con người và cần được cảnh

báo.(Hồng Khánh– “ Phát hiện chất gây rối loạn nhịp tim trong thức ăn chăn nuôi”, báo điện tử VnExpress.net)

Tóm lại, những tác hại nêu trên đã cảnh báo rằng việc sử dụng clen nói riêng

và việc sử dụng các chất β-agonist làm chất kích thích tăng trưởng nói chung là nguy hiểm cho sức khỏe con người nên từ lâu các chất này đã bị cấm sử dụng trong

nước (phụ lục 1.b), cũng như ở nhiều nước trên thế giới, nhưng chúng vẫn tiếp tục

được sử dụng một cách bất hợp pháp vì mang lại lợi nhuận cao cho người chăn nuôi

CH3OH, C2H5OH, tan ít trong CHCl3,ether, không tan trong C6H6

CTCT

Tên gọi 2–(tert–Butylamino)–1-(3–hydroxymethyl– 4-hydroxyphenyl)ethanol

Các tên gọi tương tự: albuterol

1.2.3.2 Salbutamol trong y học[73],[74]

H O

O H

Salbutamol được ứng dụng trong y học để điều trị bệnh hen suyễn rất hiệu nghiệm Thuốc điều trị bệnh hen suyễn có chứa sal có nhiều trên thị trường trong nước cũng như trên thế giới, chúng được chia thành nhiều dạng khác nhau:

• Thuốc hít phân liều (Metered dose Inhalers) là loại phổ biến nhất để có thể bơm một lượng nhỏ thuốc sal trực tiếp bào phổi

• Bình khí dung sử dụng trong điều trị hen là hình thức phổ biến khác của loại thuốc dạng bơm, cũng là cách bơm trực tiếp thuốc vào phổi nhưng thời gian lâu hơn Salbutamol dưới dạng khí dung tác động nhanh hơn, ít ảnh hưởng tiêu cực hơn so với dạng dung dịch và dạng viên

• Dung dịch (dung dịch tiêm và sirô): sal có thể được tiêm qua tĩnh mạch, dưới

da hoặc trong cơ để điều trị bệnh hen suyễn

• Dạng viên: mỗi viên ventolin chứa 2 mg hoặc 4 mg salbutamol tương đương 2,4 hoặc 4,8 mg sal sulphate riêng biệt Mỗi viên nhọng Provetab chứa tổng cộng 4 mg sal (2 mg ở lớp vỏ ngoài tan ngay lập tức và 2 mg trong phần lõi tan sau đó vài giờ) tương đương 4,8 mg sal sulphate Thành phần phụ thêm bao gồm: butylparaben, calcium phosphate, calcium sulphate, lactose, magnesium stearate, oleic acid, titanium dioxide

1.2.3.3 Tác dụng phụ của salbutamol[22],[23], [26]

Ảnh hưởng của salbutamol do sử dụng thuốc chủ yếu tác động lên cơ như bệnh chuột rút, bệnh run tay chân gây ra các bệnh giãn mạch máu và kết quả là làm ảnh hưởng đến huyết áp và tim

• Những ảnh hưởng phổ biến nhất bao gồm: ảnh hưởng đến tâm lý, dễ xúc động, ho, tiêu chảy, chóng mặt, dễ bị kích động, cơ thể cảm thấy khó chịu, đau đầu, chứng ợ nóng, tăng áp suất máu, khó tiêu, dễ nổi cáu, hơi thở không đều, kém suy nghĩ, rút cơ, buồn nôn, nóng nảy, hoạt động quá sức, tim đập nhanh, phát ban, run tay chân, khó ngủ, đau bao tử, nghẹt mũi, dễ đau họng, làm đổi màu răng

• Những ảnh hưởng ít gặp hơn bao gồm: ngực đau và khó chịu, đi tiểu khó khăn, uể oải trong người, khô miệng và họng, tăng huyết áp, co thắt cơ, cảm thấy bồn chồn, đổ mồ hôi, mất vị giác, bị hoa mắt, ốm yếu

• Những ảnh hưởng hiếm thấy theo sau việc sử dụng thuốc khí dung salbutamol là: khản giọng, phát ban trên da, sai nhịp tim, viêm họng, tăng huyết áp, bệnh tim nghiêm trọng, đái tháo đường

1.2.3.4 Tác dụng của clen và sal lên động vật nuôi và người[35],[39], [82]

Clenbuterol và salbutamol là những hormone tăng trưởng tổng hợp hóa học

có tác dụng kích thích gia súc, gia cầm tăng trọng nhanh do có tác dụng điều khiển các chất dinh dưỡng hướng tới mô cơ, tăng quá trình tổng hợp protein để tích lũy nạc và giảm tích lũy mỡ trong cơ thể [59],[60] Chính vì sự tăng trọng nhanh mà thời gian chăn nuôi được rút ngắn, giảm được chi phí thức ăn, thuốc men

Clenbuterol và salbutamol tích lũy trong thực phẩm thịt sẽ làm ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng thông qua dây chuyền thực phẩm, gây ra các triệu chứng rối loạn nhịp tim, tim đập nhanh, tăng huyết áp, co thắt phế quản, phù nề, run cơ, liệt cơ, choáng váng,…

1.2.4 Tình hình sử dụng chất kích thích tăng trưởng trên thế giới và ở

có chứa clen và các bệnh nhân này phải được đưa vào bệnh viện để cấp cứu…

Ở Tây Ban Nha

Tình hình sử dụng chất kích thích tăng trưởng cũng khá phổ biến ở Tây Ban Nha Người dân nơi đây xem việc sử dụng chất kích thích tăng trưởng cho vào thức

ăn chăn nuôi đem lại cho họ nhiều lợi nhuận nhưng họ không thể lường trước được những tai hại mà nó gây ra Hậu quả là sau khi ăn gan heo, 43 gia đình đã bị nhiễm clen Các triệu chứng biểu hiện như chân tay run, nhịp tim đập nhanh, bồn chồn, đau đầu, chóng mặt, buồn nôn, sốt, lạnh Kết quả kiểm tra nước tiểu của các bệnh

nhân cho thấy hàm lượng clen là 160 – 291 ppb

1.2.4.2 Ở Việt Nam

- Việc sử dụng chất kích thích tăng trưởng ở nước ta không phải là chuyện mới đây, điều mọi người không an tâm hiện nay là người chăn nuôi hay các công ty bán thức ăn chăn nuôi đã dùng những chất kích thích tăng trưởng đã bị cấm để thu nhiều lợi nhuận, bất chấp sức khỏe của người tiêu dùng Bình thường người chăn nuôi heo sử dụng clen hoặc sal cho vào thức ăn chăn nuôi chỉ sau 3 đến 4 tháng có thể bán được từ 90-100kg (với trọng lượng heo ban đầu từ 18 - 20kg) Vì thế clen

và sal được xem như hormone “siêu tăng trọng” và được nhiều người chăn nuôi ở Việt Nam sử dụng để thu được lợi nhuận cao Công tác kiểm tra dư lượng của clen

và sal trong thức ăn chăn nuôi và thịt heo trong những năm 2005-2008 chủ yếu bằng phương pháp ELISA Sau đây là một số dẫn chứng cụ thể về tình hình sử dụng chất kích thích tăng trưởng ở nước ta trong những năm gần đây dựa trên các kết quả kiểm nghiệm bằng phương pháp ELISA

- Giữa năm 2005, qua xét nghiệm gần 500 mẫu thịt heo tại TPHCM, chi cục thú y TPHCM đã tìm thấy gần 30% mẫu dương tính với clen

- Cuối 2005, qua các đợt kiểm tra, clen được phát hiện trong nhiều mẫu thịt heo và trong thức ăn gia súc đã làm cho dư luận xôn xao và báo chí cũng khá rầm rộ trong việc đề nghị các cơ quan quản lý phối hợp chặt chẽ để ngăn chặn hiểm họa này Sau đó tại một hội thảo về hormon tăng trưởng do Viện Khoa học Kỹ thuật miền Nam và Hiệp hội Thức ăn Chăn nuôi tổ chức, cục chăn nuôi đã công bố kết quả kiểm tra việc sử dụng hormone tăng trưởng trong chăn nuôi Theo kết quả kiểm tra từ 20-06 đến 03-11-2006, cơ quan có trách nhiệm đã phát hiện thấy 47 mẫu dương tính với clen trong tổng số 428 mẫu được kiểm tra (gần 11%)

- Ngày 04-07-2006, Cục Chăn nuôi đã có văn bản báo cáo với Bộ trưởng Bộ

Nông Nghiệp Và Phát Triển Nông Thôn về việc lạm dụng hormone tăng trưởng trong vài năm gần đây Theo phân tích của Viện Khoa học Kỹ thuật miền Nam năm

2005, trong 83 mẫu thức ăn hỗn hợp và đậm đặc của 12 công ty, 9 mẫu dương tính với clen (11%) Viện cũng đã thu thập mẫu thức ăn đậm đặc để khảo sát, kết quả 1/12 mẫu thức ăn của công ty Anco cũng cho kết quả dương tính với clen Có 3 mẫu nguyên liệu bổ sung nguồn gốc từ Campuchia và Trung Quốc được chào bán cho công ty Mỹ Nông cũng dương tính

- Ngoài ra, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam đã tiếp tục lấy mẫu ngẫu nhiên tại chợ ở TPHCM gồm có 2 mẫu thận và 3 mẫu thịt heo để xét nghiệm Kết quả cho thấy 1 mẫu thận có tồn dư clen cao gấp 60 lần tiêu chuẩn quốc

tế đối với thận bò, ngựa; 1 mẫu thịt có hàm lượng sal cao hơn 3 lần tiêu chuẩn quốc

tế cho thịt bò, ngựa (nếu chấp nhận sal thuộc nhóm β-agonist có cùng quy định với clen)

- Việc sử dụng chất kích thích tăng trưởng trong thức ăn chăn nuôi không chỉ diễn ra ở các thành phố lớn, ở các đồng bằng mà còn khá phổ biến ở các tỉnh miền núi và biên giới

- Tại buổi tọa đàm “Thịt lợn tăng trọng và những nguy cơ” do báo Khoa học

và Đời sống tổ chức vào 06-07-2006, các nhà quản lý đều khẳng định các loại thuốc kích thích tăng trưởng gia súc trên thị trường hiện nhiều như nấm sau mưa Người nông dân có thể dễ mua các loại thuốc kích thích tăng trọng tràn ngập trên thị trường để về tự pha trộn vào thức ăn chăn nuôi theo công thức riêng Ở biên giới tỉnh Lạng Sơn, hàng loạt loại thuốc có tên khá “hấp dẫn” được bán tràn ngập trên thị trường như: Bạch Nhật Đại, Khai Vị, Tăng Gia Phức Đại,…Các loại thức ăn này đều có ghi tác dụng là thúc đẩy tăng trưởng, cải thiện và nâng cao chất lượng thịt, tăng cường khả năng sinh sản, giảm thời gian chăn nuôi, tăng số lượng trứng

- Từ năm 2009 đến năm 2010 theo quy định của Bộ Nông Nghiệp và Phát triển Nông thôn cho phép định tính β-agonist bằng phương pháp ELISA, định lượng bằng sắc ký, và đây chỉ là hướng dự thảo, chưa có quyết định cụ thể về quy trình

phân tích Hiện nay một số phòng thí nghiệm đã sử dụng quy trình phân tích clen và sal bằng sắc ký khí, sắc ký lỏng

1.2.5 Những dấu hiệu giúp người tiêu dùng nhận biết thịt gia súc, gia cầm có

chứa chất kích thích tăng trưởng loại β-agonists

Xin giới thiệu với người tiêu dùng một số dấu hiệu dùng để nhận biết chất kích thích tăng trưởng có mặt trong thịt:

- Về mặt cảm quan, khó có thể nhận biết được sự có mặt của clen và sal có trong thịt Tuy nhiên dựa vào đặc tính là chúng có tác dụng làm tiêu hao lượng mỡ,

và tăng lượng thịt nên thịt chứa hai loại chất này thường rất ít mỡ, thịt săn chắc,

nhiều nạc (Phụ lục 1.a)

- Mặt khác, thịt chứa hormone tăng trưởng có thể nhận biết qua các dấu hiệu như: khi nấu thịt ra nhiều nước, ăn bở, không đậm đà, sắc thịt hơi có màu nhạt kém hồng Nếu dùng thuốc tăng trọng quá nhiều trong thời gian gần giết mổ thì có thể ngửi thấy được mùi khai khi nấu chín (Bài viết “ Thần dược trong chăn nuôi”, Việt Báo – 2005) Ngoài ra, khi sử dụng thịt có hormone tăng trưởng lâu ngày thì người tiêu dùng có thể có những triệu chứng như: run cơ, đau tim, tim đập nhanh, huyết áp tăng, choáng váng, mắt trợn [25]

1.3 Phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ và một số quy định của Châu âu

về phương pháp phân tích mẫu bằng sắc ký lỏng ghép khối phổ [6],[32],[57] (LC-MS/MS)

Trong thực tế có nhiều phương pháp phân tích nhóm chất β-agonist nhưng phổ biến nhất là phương pháp sàng lọc ELISA và phương pháp sắc ký (sắc ký khí và sắc

ký lỏng)

Phương pháp ELISA được sử dụng để định tính nhanh các hợp chất β-agonist Phương pháp này có tính sàng lọc, xử lý mẫu đơn giản, cho kết quả nhanh, ứng dụng được trên nhiều nền mẫu khác nhau Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp

là chỉ áp dụng được cho từng chất riêng lẻ, thường dùng để xác định clen và sal Ngày nay, để đạt được kết quả phân tích chính xác hơn, người ta không ngừng cải thiện các hệ thống máy phân tích như sắc ký khí (GC), sắc ký khí ghép khối phổ

1 tứ cực, (GC-MS), sắc ký khí ghép khối phổ 3 tứ cực, (GC-MS/MS), sắc ký lỏng

(LC), sắc ký lỏng ghép khối phổ 1 tứ cực (LC/MS), sắc ký lỏng ghép khối phổ 3 tứ

cực (LC-MS/MS) với độ nhạy và độ chính xác cao

Phương pháp phân tích bằng sắc ký khí có ưu điểm là cho độ nhạy, độ chính

xác và độ ổn định cao Tuy nhiên, nhược điểm là thời gian phân tích lâu, do cả hai

chất sal và clen đều khó bay hơi nên phải tạo dẫn xuất để chuyển thành những chất

dễ bay hơi và bền nhiệt

1.3.1.Giới thiệu phương pháp phân tích sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS/MS) [8],[9],[10],[13],[15],[17]

1.3.1.1 Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Trong sắc ký lỏng hiệu năng cao, pha động là chất lỏng còn pha tĩnh chứa

trong cột là chất rắn ở dạng hạt có kích thước xác định hoặc một chất lỏng đã phủ

lên một chất mang rắn hay là một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hóa học

với các nhóm chức hữu cơ Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố,

trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ (rây phân tử)

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) được

sử dụng phổ biến để phân tích các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ bị phân hủy nhiệt,

được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu khoa học, công nghiệp,

nông nghiệp và phân tích thủy sản…

Những hợp chất có thể được phân tích bằng sắc ký lỏng tương đối nhiều như:

amino acid, protein, nucleic acid, hydrocarbon, carbohydrate, kháng sinh, các hợp

chất terpenoid , thuốc trừ sâu, chất hoạt động bề mặt, steroid,…

Dựa vào khả năng tách của cột sắc ký, trong HPLC, người ta chia ra nhiều loại:

sắc ký hấp phụ, sắc ký phân bố, sắc ký ion, sắc ký rây phân tử, trong đó sắc ký phân

bố được ứng dụng rộng rãi và phổ biến Tùy theo độ phân cực của pha tĩnh và dung

môi trong pha động, có hai loại sắc ký lỏng:

Sắc ký lỏng pha thường: Pha tĩnh có độ phân cực cao hơn độ phân cực của

dung môi pha động Cơ chế là chất phân cực nhiều sẽ tương tác mạnh với pha tĩnh

và được giữ lại lâu hơn, kỹ thuật này thường dùng để phân tích các chất có độ phân

cực cao

Sắc ký lỏng pha đảo: ngược với sắc ký lỏng pha thường, pha tĩnh có độ phân

cực thấp, pha động có độ phân cực cao hơn Cơ chế là chất phân cực nhiều sẽ được giữ lại yếu hơn trên pha tĩnh, chất càng ít phân cực thì càng bị giữ mạnh hơn trên pha tĩnh Phương pháp này dùng để phân tích các hợp chất từ không phân cực đến phân cực vừa Dung môi sử dụng là các dung môi phân cực như methanol, acetonitrile, tetrahydrofuran, nước và hỗn hợp của chúng Sắc ký lỏng pha đảo thường được sử dụng nhiều hơn

1.3.1.2 Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao

Thiết bị gồm các bộ phận chính: bơm chịu áp suất (pump), van tiêm mẫu (injector), cột sắc ký lỏng (column), đầu dò (detector) và phần điều khiển và xử lý

số liệu (data processor) Khi hỗn hợp chất phân tích được tiêm vào cột, pha tĩnh

tương tác với mỗi cấu tử và có tác dụng giữ cấu tử lại, pha động cũng tương tác và

có tác dụng lôi cấu tử ra khỏi cột. Dựa vào khả năng tương tác khác nhau giữa các chất với pha tĩnh và pha động, các hợp chất cần phân tích được tách ra khỏi nhau và sau khi ra khỏi cột sẽ được ghi nhận bởi đầu dò cụ thể

Sắc ký lỏng có thể ghép với nhiều loại đầu dò: đầu dò tử ngoại – khả kiến (UV-Vis), đầu dò huỳnh quang (FLD), đầu dò chỉ số khúc xạ (RID), đầu dò ELSD dựa trên cường độ phân tán của bức xạ laser sau khi chạm vào chất phân tích, đầu

dò điện hóa (ECD), đầu dò khối phổ (MS) Hiện nay đầu dò khối phổ được ứng dụng rộng rãi trong phân tích các hợp chất cần nhận danh chính xác và đặc biệt trong phân tích vết

Hình 1.5 Mô tả tổng quát các bộ phận của máy sắc ký lỏng hiệu năng cao

Sự tạo ion trong sắc ký lỏng ghép khối phổ được thực hiện ở áp suất thường

Có hai cách tạo ion chính: ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI, Atmospheric pressure chemical ionization) và ion hóa bằng cách phun điện tử ESI (Electrospray ionization) Hai kỹ thuật ion hóa này được xem là loại ion hóa “mềm” (soft ionization), ít phân mảnh hơn so với ion hóa điện tử (electron ionization) trong GC/MS

a) Kiểu ion hóa APCI

Nguyên tắc hoạt động: Phân tử chất phân tích và dung môi đi qua bộ phận gia nhiệt

khoảng 350oC sẽ bị hóa hơi và được khí nitơ đẩy vào vùng phóng điện Ở đây, các phân tử khí bị ion hóa bởi kim phóng điện theo hai cơ chế tạo ion dương hoặc tạo

M + H3O+ → MH+ + H2O [ phản ứng giữa ion và phân tử]

• Tạo ion âm

Với những phân tử có H linh động trong vùng phóng điện, có sự ion hóa của phân tử bằng cách mất đi H+, phần còn lại là một anion

Chú thích:

• Ống phun khí (1) : phun khí đẩy chất phân tích dưới dạng hơi vào vùng phóng điện

• Kim phóng điện (2): được áp thế có thể đến 3-4kV, có chức năng ion hóa chất phân tích

• Hút khí (3): là đường dẫn mà ở đầu của đường dẫn này có đặt một bơm tạo chân không,

dùng để tạo chân không cho hệ thống MS, khi chân không đạt 10 -5 torr máy MS mới hoạt động được

• Skimmer (4): bộ phận gạn lọc nhằm loại bỏ một phần các chất gây nhiễu, không cho vào bộ

phận phân tích khối

• Bộ phận gia nhiệt (5): bộ phận dùng để hóa hơi dung môi, bao bọc chất phân tích

Hình 1.6 Sơ đồ hệ thống ion hóa theo kỹ thuật APCI

b) Kiểu ion hóa ESI

Nguyên tắc hoạt động: Các phân tử hóa chất và dung môi ra khỏi cột sắc ký được

đưa vào một ống mao quản bằng kim loại có điện thế từ 3- 5 kV, sau đó được phun sương bằng khí N2 tạo thành những hạt sương nhuyễn, có mang điện tích, thoát ra

từ đầu ống mao quản Các phân tử dung môi từ từ bốc hơi Các hạt mang điện tích

có thể tích nhỏ dần và do sự đẩy nhau giữa các điện tích cùng dấu sẽ bể dần ra thành những hạt nhỏ mang điện tích và cuối cùng cho ra ion Các ion dương hoặc âm tạo thành được đưa vào bộ phận phân tích ion qua một hệ thống dẫn ion Dung môi và khí N2 bị bơm hút ra ngoài

So với kỹ thuật APCI thì kỹ thuật ESI ít tạo ra sự phân mảnh hơn ESI được

sử dụng nhiều hơn cho phân tử phân cực và có phân tử khối lớn

Hình 1.7 Sơ đồ hệ thống ion hóa theo ESI c) So sánh hai kỹ thuật APCI và ESI

Cả hai kỹ thuật đều thuộc loại ion hóa “mềm” nghĩa là ít tạo sự phân mảnh ion thành những ion nhỏ hơn và do đó, trong nhiều trường hợp, còn thấy được ion tạo thành từ phân tử ban đầu: ion dương [M+H]+ hay ion âm [M-H]- Hơn nữa, nếu có

sự phân mảnh ion thì cách phân mảnh cũng có thể đơn giản hơn so với ion hóa

“cứng” (hard ionization), giúp sự đoán nhận cấu trúc hóa học ban đầu dễ dàng hơn

Cả hai kỹ thuật đều có thể tạo ion âm hay dương tùy cấu trúc hóa học, tuy nhiên APCI có thể tạo sự phân mảnh nhiều hơn

Về nguyên tắc, APCI được sử dụng nhiều cho những phân tử phân cực vừa, có phân tử khối nhỏ, dưới 1000 amu ESI được sử dụng cho phân tử phân cực nhiều hơn và có khối lượng phân tử lớn

Với kỹ thuật ESI, có thể tạo ion đa điện tích trong trường hợp các phân tử có phân tử khối lớn và có thể nhận nhiều proton (ion dương) hay mất nhiều proton (ion âm) Ngược lại kỹ thuật APCI chỉ có thể cho hoặc nhận một proton H+

Với ESI, tốc độ pha động 5µl-1ml/phút tùy kích cỡ cột sắc ký

Với APCI, tốc độ pha động thường khoảng 0,1-2ml/phút tùy theo kích cỡ cột

sắc ký