- Đối tượng nghiên cứ u
3.5.Tóm tắt qui trình phân tích clen, salb ằng phương pháp sắc ký lỏng ghép
Dựa trên các kết quả từ mục [3.1] - [3.4], qui trình phân tích clen, sal bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC/MS/MS) được tóm tắt như sau:
3.5.1. Nguyên tắc
Mẫu thức ăn hoặc mẫu thịt sau khi được chiết bằng đệm phosphate ở pH 6,0 sẽ được làm sạch bằng cột chiết pha rắn SPE Strata-SCX. Sau đó, clen và sal được định tính và định lượng trên LC-MS/MS.
3.5. 2. Phương pháp
3.5. 2. 1. Chuẩn bị mẫu: thịt hoặc thức ăn chăn nuôi
Chiết mẫu.
- Mẫu thịt (200g) được xay nhuyễn bằng cối nhỏ của máy xay sinh tố hoặc mẫu TACN (200g) để có được nguyên liệu đồng nhất.
- Cân lấy mẫu (thịt: 2g; TACN: 2g) đã được làm đồng nhất, chiết với đệm phosphate (0,1M K2HPO4, pH 6,0) sau khi đã cho vào một lượng không thay đổi nội chuẩn (2 μg/L) clen-d9 và (4 μg/L) sal-d3, để yên trong 1 giờ. Ly tâm và chiết lấy dung dịch lớp trên, lọc.
- Thực hiện quá trình chiết mẫu 3 lần với đệm K2HPO4, lấy dịch lọc.
Làm sạch mẫu: Dịch lọc sau khi chiết được làm sạch bằng cột chiết pha rắn SPE Strata-SCX của Phenomenex. Cột SPE đã được hoạt hóa lần lượt với MeOH, nước cất khử ion, đệm phosphate 0,1M K2HPO4, sau đó rửa cột với nước, nước:MeOH (10:90). Rửa giải với dung dịch MeOH: NH4OH 30% (95:5). Cô cạn bằng khí N2 và định mức 1ml bằng pha động ban đầu, sau đó lọc qua màng lọc 0,45 µm và cho vào lọ (Vial) để tiêm vào thiết bị LC-MS/MS. Quy trình chuẩn bị mẫu được trình bày trong hình 3.11
3.5. 2. 2. Sơ đồ tóm tắt quy trình định lượng clen và sal
Hình 3.11. Sơđồ tóm tắt quy trình phân tích clen và sal
Cân mẫu (2g) đã đồng nhất vào ống ly tâm 50 mL
Vortex 2 phút, ly tâm 15 phút, tốc độ 5000 vòng/ phút lấy lớp dịch chiết
(Chiết mẫu 3 lần , mỗi lần 5ml K2HPO4 (pH=6) Gom dịch chiết qua cột SCX (đã được hoạt hóa lần
lượt: 6ml MeOH, 6ml H2O , 6ml K2HPO4(pH= 6)
Rửa cột lần lượt : 3 mL H2O, 3ml MeOH: H2O (10:90), rút nhẹ chân không để làm khô cột
Rửa giải: 5ml MeOH: NH4OHđđ (95:5 v/v) Thổi khô dung dịch rửa giải bằng khí nitơ
- Hòa tan cặn với 1 mL dung dịch pha động - Lọc dung dịch mẫu qua màng lọc 0, 45 μm
Phân tích mẫu bằng LC/MS/MS
- Thêm 1 mL dung dịch nội chuẩn sal-d3 và clen- d9
3.5. 2. 3. Kỹ thuật LC-MS/MS
+ Điều kiện vận hành hệ thống sắc ký lỏng (LC)
Cột: Purospher Star C18, 125 mm x 4,6 mm x 5 µm với cột bảo vệ (Merck)
Pha động: A: MeOH (0,1% HCOOH); B: Nước khử ion (0,1% HCOOH). Tốc độ dòng 500 µL /phút) Thời gian (phút) A% B% 0,0 -1,0 15 85 2,0 60 40 2,5 -13 100 00 14 -25 15 85 Thể tích bơm: 25 µL. + Điều kiện vận hành hệ thống khối phổ
Nguồn tạo ion: ESI (+) 4000 V Khí phun/bổ trợ N2: 40/10 đơn vị Nhiệt độ ống mao quản: 350 oC
Khí phun: Argon (1,5 mTorr) Bề rộng mũi Q1 & Q3 : 0,7 Da
SRM & Năng lượng CE
Đối với clen: m/z 277,05 > 203,01 (ion định lượng) CE: 17 V
m/z 277,05 > 132,10 (ion xác nhận) CE: 29 V
m/z 286,10 > 204,01 (ion nội chuẩn) CE: 17 V Đối với sal : m/z 240,10 > 148,10 (ion định lượng) CE: 18 V (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
m/z 240,10>166,01 (ion xác nhận) CE: 13 V
m/z 243,05 >151,15 (ion nội chuẩn) CE: 17 V Thời gian quét: 0,1 giây/chuyển tiếp SRM
3.5. 2. 4. Yêu cầu độ tin cậy của phép phân tích
a. Xây dựng đường chuẩn
Đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa tỉ lệ diện tích pic ion định lượng clen (m/z 203,01) và clenbuterol-d9 (m/z 204,01), tỉ lệ diện tích ion định lượng sal (m/z
148,10) và sal-d3 ( m/z 151,15) thu được theo nồng độ chuẩn clen, sal tương ứng.
) ( , 1 0 V m C X × =
Yêu cầu đường chuẩn phải có độ tuyến tính tốt (từ 5 – 6 điểm chuẩn), hệ số tương quan hồi qui tuyến tính (R2) phải lớn hơn hoặc bằng 0,99. Đường chuẩn được xây dựng trên nền mẫu trắng (mẫu không phát hiện clen, sal) với nội chuẩn clen-d9, sal- d3 nhằm loại bớt ảnh hưởng nền trong giai đoạn chuẩn bị mẫu cũng như trong giai đoạn tạo ion ở đầu dò khối phổ nếu có.
b. Giới hạn phát hiện.
Bảng 3. 36. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của clen và sal
Nền mẫu Clen LOD Sal Clen LOQ Sal Đơn vị
Thịt 0,017 0,026 0,051 0,079 μg/Kg
Thức ăn chăn nuôi 0,074 0,084 0,22 0,248 μg/Kg
c. Tỷ lệ cường độ ion
Theo quyết định 2002/657/EC của Châu Âu, để xác nhận chất phân tích khi đầu dò khối phổ vận hành theo chế độ MS/MS-SRM, thì ngoài tiền ion, cần phải có thêm hai mảnh ion con để hội đúng 4 điểm cần thiết. Tỷ lệ cường độ ion của hai mũi ion con phải có trị số xác định và chỉ được thay đổi trong khoảng cho phép
Bảng 3.37.Ion định lượng, ion xác nhận, tỉ lệ cường độ ion của clen và sal Chất phân tích Tiền ion Ion định lượng (m/z) Ion xác nhận (m/z) Tỉ lệ cường độ ion(%) A132/A203 A166/A148 Clen 277,05 203,01 277,05; 203,01; 132,10 22, 63 - 36,63 Clen-d9 286,05 204,01 Sal 240,10 148,10 240,10; 148,10; 166,01 21,10 - 35,10 Sal-d3 243,10 151,15 d. Tính kết quả
Nồng độ chất cần phân tích có trong mẫu kiểm được tính theo công thức sau:
Trong đó: - X: Lượng chất cần phân tích có trong mẫu kiểm, μg/kg hoặc μg/L - Co: Nồng độ chất cần phân tích tính từ đường chuẩn, μg/L
- 1 : Thể tích định mức 1 mL