- Đối tượng nghiên cứ u
1.3.1.Giới thiệu phương pháp phân tích sắc ký lỏng ghép khối phổ
(LC-MS/MS) [8],[9],[10],[13],[15],[17].
1.3.1.1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Trong sắc ký lỏng hiệu năng cao, pha động là chất lỏng còn pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn ở dạng hạt có kích thước xác định hoặc một chất lỏng đã phủ lên một chất mang rắn hay là một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ (rây phân tử)
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) được sử dụng phổ biến để phân tích các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ bị phân hủy nhiệt, được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu khoa học, công nghiệp, nông nghiệp và phân tích thủy sản…
Những hợp chất có thể được phân tích bằng sắc ký lỏng tương đối nhiều như: amino acid, protein, nucleic acid, hydrocarbon, carbohydrate, kháng sinh, các hợp chất terpenoid , thuốc trừ sâu, chất hoạt động bề mặt, steroid,…
Dựa vào khả năng tách của cột sắc ký, trong HPLC, người ta chia ra nhiều loại: sắc ký hấp phụ, sắc ký phân bố, sắc ký ion, sắc ký rây phân tử, trong đó sắc ký phân bố được ứng dụng rộng rãi và phổ biến. Tùy theo độ phân cực của pha tĩnh và dung môi trong pha động, có hai loại sắc ký lỏng:
Sắc ký lỏng pha thường: Pha tĩnh có độ phân cực cao hơn độ phân cực của dung môi pha động. Cơ chế là chất phân cực nhiều sẽ tương tác mạnh với pha tĩnh và được giữ lại lâu hơn, kỹ thuật này thường dùng để phân tích các chất có độ phân cực cao.
Sắc ký lỏng pha đảo: ngược với sắc ký lỏng pha thường, pha tĩnh có độ phân cực thấp, pha động có độ phân cực cao hơn. Cơ chế là chất phân cực nhiều sẽ được giữ lại yếu hơn trên pha tĩnh, chất càng ít phân cực thì càng bị giữ mạnh hơn trên pha tĩnh. Phương pháp này dùng để phân tích các hợp chất từ không phân cực đến phân cực vừa. Dung môi sử dụng là các dung môi phân cực như methanol, acetonitrile, tetrahydrofuran, nước và hỗn hợp của chúng. Sắc ký lỏng pha đảo thường được sử dụng nhiều hơn
1.3.1.2. Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao
Thiết bị gồm các bộ phận chính: bơm chịu áp suất (pump), van tiêm mẫu (injector), cột sắc ký lỏng (column), đầu dò (detector) và phần điều khiển và xử lý số liệu (data processor) Khi hỗn hợp chất phân tích được tiêm vào cột, pha tĩnh tương tác với mỗi cấu tử và có tác dụng giữ cấu tử lại, pha động cũng tương tác và có tác dụng lôi cấu tử ra khỏi cột. Dựa vào khả năng tương tác khác nhau giữa các chất với pha tĩnh và pha động, các hợp chất cần phân tích được tách ra khỏi nhau và sau khi ra khỏi cột sẽ được ghi nhận bởi đầu dò cụ thể.
Sắc ký lỏng có thể ghép với nhiều loại đầu dò: đầu dò tử ngoại – khả kiến (UV-Vis), đầu dò huỳnh quang (FLD), đầu dò chỉ số khúc xạ (RID), đầu dò ELSD dựa trên cường độ phân tán của bức xạ laser sau khi chạm vào chất phân tích, đầu dò điện hóa (ECD), đầu dò khối phổ (MS). Hiện nay đầu dò khối phổ được ứng dụng rộng rãi trong phân tích các hợp chất cần nhận danh chính xác và đặc biệt trong phân tích vết.
1.3.1.3. Sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS)
Trong sắc ký lỏng ghép khối phổ, đầu dò khối phổ có các bộ phận chính sau đây: bộ tạo ion, bộ phân tích khối và bộ dò ion. Xin trình bày sau đây hai bộ phận cơ bản nhất là bộ tạo ion và bộ phân tích khối phổ.
Bộ tạo ion[14],[13],[36]
Sự tạo ion trong sắc ký lỏng ghép khối phổ được thực hiện ở áp suất thường. Có hai cách tạo ion chính: ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI, Atmospheric pressure chemical ionization) và ion hóa bằng cách phun điện tử ESI (Electrospray ionization). Hai kỹ thuật ion hóa này được xem là loại ion hóa “mềm” (soft ionization), ít phân mảnh hơn so với ion hóa điện tử (electron ionization) trong GC/MS.
a). Kiểu ion hóa APCI
Nguyên tắc hoạt động: Phân tử chất phân tích và dung môi đi qua bộ phận gia nhiệt
khoảng 350oC sẽ bị hóa hơi và được khí nitơ đẩy vào vùng phóng điện. Ở đây, các phân tử khí bị ion hóa bởi kim phóng điện theo hai cơ chế tạo ion dương hoặc tạo ion âm.
• Tạo ion dương
N2 + e- → N2+ + 2e- H2O + e- → H2O+ + 2e- H2O + H2O.+ → H3O+ + .OH
M + H3O+ → MH+ + H2O [ phản ứng giữa ion và phân tử] • Tạo ion âm
Với những phân tử có H linh động trong vùng phóng điện, có sự ion hóa của phân tử bằng cách mất đi H+, phần còn lại là một anion
Chú thích:
• Ống phun khí (1) : phun khí đẩy chất phân tích dưới dạng hơi vào vùng phóng điện
• Kim phóng điện (2):được áp thế có thểđến 3-4kV, có chức năng ion hóa chất phân tích.
• Hút khí (3): là đường dẫn mà ở đầu của đường dẫn này có đặt một bơm tạo chân không, dùng để tạo chân không cho hệ thống MS, khi chân không đạt 10-5 torr máy MS mới hoạt
động được.
• Skimmer (4): bộ phận gạn lọc nhằm loại bỏ một phần các chất gây nhiễu, không cho vào bộ
phận phân tích khối.
• Bộ phận gia nhiệt (5): bộ phận dùng để hóa hơi dung môi, bao bọc chất phân tích.
Hình 1.6. Sơđồ hệ thống ion hóa theo kỹ thuật APCI b). Kiểu ion hóa ESI
Nguyên tắc hoạt động: Các phân tử hóa chất và dung môi ra khỏi cột sắc ký được
đưa vào một ống mao quản bằng kim loại có điện thế từ 3- 5 kV, sau đó được phun sương bằng khí N2 tạo thành những hạt sương nhuyễn, có mang điện tích, thoát ra từ đầu ống mao quản. Các phân tử dung môi từ từ bốc hơi. Các hạt mang điện tích có thể tích nhỏ dần và do sự đẩy nhau giữa các điện tích cùng dấu sẽ bể dần ra thành những hạt nhỏ mang điện tích và cuối cùng cho ra ion. Các ion dương hoặc âm tạo thành được đưa vào bộ phận phân tích ion qua một hệ thống dẫn ion. Dung môi và khí N2 bị bơm hút ra ngoài.
So với kỹ thuật APCI thì kỹ thuật ESI ít tạo ra sự phân mảnh hơn. ESI được sử dụng nhiều hơn cho phân tử phân cực và có phân tử khối lớn
Hình 1.7. Sơđồ hệ thống ion hóa theo ESI c) So sánh hai kỹ thuật APCI và ESI
Cả hai kỹ thuật đều thuộc loại ion hóa “mềm” nghĩa là ít tạo sự phân mảnh ion thành những ion nhỏ hơn và do đó, trong nhiều trường hợp, còn thấy được ion tạo thành từ phân tử ban đầu: ion dương [M+H]+ hay ion âm [M-H]-. Hơn nữa, nếu có sự phân mảnh ion thì cách phân mảnh cũng có thể đơn giản hơn so với ion hóa “cứng” (hard ionization), giúp sự đoán nhận cấu trúc hóa học ban đầu dễ dàng hơn.
Cả hai kỹ thuật đều có thể tạo ion âm hay dương tùy cấu trúc hóa học, tuy nhiên APCI có thể tạo sự phân mảnh nhiều hơn.
Về nguyên tắc, APCI được sử dụng nhiều cho những phân tử phân cực vừa, có phân tử khối nhỏ, dưới 1000 amu. ESI được sử dụng cho phân tử phân cực nhiều hơn và có khối lượng phân tử lớn.
Với kỹ thuật ESI, có thể tạo ion đa điện tích trong trường hợp các phân tử có phân tử khối lớn và có thể nhận nhiều proton (ion dương) hay mất nhiều proton (ion âm). Ngược lại kỹ thuật APCI chỉ có thể cho hoặc nhận một proton H+.
Với ESI, tốc độ pha động 5µl-1ml/phút tùy kích cỡ cột sắc ký.
Với APCI, tốc độ pha động thường khoảng 0,1-2ml/phút tùy theo kích cỡ cột sắc ký.
Bộ phân tích khối
a) Bộ phân tích khối một tứ cực
Tứ cực gồm 4 thanh kim loại hình trụ hoặc hyperbol được đặt song song nhau (hãng Thermo Fisher hay Agilent), chịu tác dụng đồng thời của điện thế một chiều U và điện thế xoay chiều cao tần V, từng cặp đối diện được nối vào cùng một cực của điện thế.
Hình 1.8. Bộ phân tích khối một tứ cực
Nguyên tắc vận hành: Về nguyên tắc, có hai chế độ vận hành:
• SIM ( Selected ion monitoring)
Ứng với một ion được chọn có trị số m/z, thì U và V phải có trị số xác định (được tính bởi phần mềm của máy) để cho phép ion đi xuyên qua được tứ cực và đến được bộ dò ghi nhận. Những ion có trị số m/z lớn hay nhỏ hơn không xuyên qua tứ cực được. Do đó, tứ cực còn được xem như có vai trò lọc khối (mass filter). Độ phân giải có thể được điều chỉnh bởi cặp U, V (về thực tế, điều nầy có thể do người thao tác cài đặt sai số ∆m trên phân tử khối m của ion, ∆m càng nhỏ thì độ phân giải càng cao), tuy nhiên khi tăng độ phân giải thì độ nhạy sẽ giảm.
• FULL SCAN
Để thu được các ion trong một khoảng khối lượng xác định đã được cài đặt, thì phải thay đổi U và V liên tục nhưng vẫn giữ tỉ lệ U/V không đổi. Độ phân giải phổ tùy thuộc tỉ lệ nầy.
Lưu ý:
- Khi U = 0, chỉ còn điện thế xoay chiều cao tần V, tứ cực không còn đóng vai trò lọc khối nữa. Tất cả ion đều đi qua tứ cực được, lúc bấy giờ tứ cực chỉ đóng vai trò chuyển ion. Đặc tính nầy được áp dụng trong sự chuyển ion từ nguồn tạo ion đến bộ phân tích khối trong đầu dò khối phổ, tuy nhiên thay vì dùng tứ cực thì người ta dùng lục cực (hexapole) hay bát cực (octapole) có đặc tính chuyển ion tốt hơn.
- Khối phổ một tứ cực vận hành theo chế độ Full Scan có độ nhạy không cao, trái lại với chế độ SIM, độ nhạy đạt khá cao, cho nên trong phân tích vết, phải luôn luôn sử dụng SIM để định lượng. Ngoài ra, với đầu dò khối phổ một tứ cực, với những nền mẫu phức tạp, việc chuẩn bị mẫu phải được thực hiện rất kỹ lưỡng để giảm bớt nhiễu nền, dù vậy độ nhạy và độ chọn lọc cũng kém hơn so với đầu dò khối phổ ba tứ cực.
b) Bộ phân tích khối ba tứ cực
Với hệ khối phổ (MS) ba tứ cực Q1, Q2, Q3, vai trò của bộ tứ cực thứ nhất Q1 và thứ ba Q3 là tách và cô lặp ion, còn Q2 có vai trò phân mảnh các ion chuyển từ Q1 sang. Các ion này còn gọi là tiền ion (precursor ion) được chọn thông qua Q1 và tiếp đó được cung cấp đủ năng lượng, gọi là năng lượng phân mảnh hay va chạm (collision energy) để khi va chạm với argon (hay N2) được cấp vào Q2, bị phân mảnh tạo ra các mảnh ion đặc trưng cho phân tử hóa chất. Xu thế hiện nay là chọn
một lục cực dùng làm Q2 để tăng tốc độ chuyển ion vào Q3, tránh hiện tượng nhiễm ion chéo (cross-talk) ảnh hưởng đến việc định lượng
Hình 1.9. Sơđồ bộ phân tích khối ba tứ cực
Trước đây 3 tứ cực được xếp thẳng hàng (hãng Varian, Agilent, Applied Biosystems, Thermo Fisher, Waters), nhưng sau đó hãng Varian nhanh chóng chuyển sang cấu hình 1800, Thermo chuyển sang cấu hình 900, gần đây hãng Applied Biosystems cũng chuyển sang cấu hình 1800 với sự ra đời của hệ thiết bị LC-MS/MS AB Sciex 5500 (2008) và mới gần đây nhất Agilent cũng chuyển sang cấu có Q2 dạng cong với hệ thiết bị LC-MS/MS 6490 (2010). Mục đích là giảm nhiễu nền rất hiệu nghiệm bằng cách loại bỏ các nhiễu trung hòa.
Hình 1.10. Sơđồđầu dò khối phổ ba tứ cực (LC-MS/MS)TSQ Quantum Access của hãng Thermo Fisher với cấu hình 900
Với hệ thống ba tứ cực, chế độ vận hành rất phong phú, cho phép có nhiều thông tin hữu ích trong phân tích, thí dụ có thể ghi Full Scan, SIM, Full Scan
MS/MS hay Product ion, SRM (Selected Reaction Monitoring)...thể hiện trên sơ đồ của hình 1.11.
c) Ưu thế của đầu đò khối phổ ba tứ cực
- Thông qua hai lần phân mảnh ion, việc nhận danh chất phân tích trở nên đúng hơn
- Sự khử nhiễu nền đạt cao hơn, khiến độ nhạy được tăng lên. Trong phân tích dư lượng, áp dụng chế độ MS/MS-SRM cho kết quả định lượng tốt hơn.
- Ngoài ra với độ nhạy khá cao của thiết bị LC-MS/MS hiện nay, có thể sử dụng ít mẫu trong chuẩn bị mẫu, vừa tốn ít hóa chất, vừa làm giảm đáng kể hiệu ứng nền trong tách chiết cũng như trong hiệu suất tạo ion tại bộ phận thu nhận tín hiệu khối phổ.
Chú thích: Với đầu dò khối phổ vận hành theo chế độ MS/MS
• Q1: hệ thống tứ cực thứ nhất có nhiệm vụ tiếp nhận tiền ion
• Q2: hệ thống tứ cực thứ hai, nơi xảy ra sự phân mảnh tiền ion
• Q3: hệ thống tứ cực thứ ba có nhiệm vụ nhận tất cả ion con sinh ra ở Q2 (Full MS/MS hay Product Ion) hay chỉ một số ion nhỏ nhất định (SRM).
1.3.2. Quy trình định tính và định lượng β-agonists (salbutamol và clenbuterol) [1],[14],[19],[29],[42],[43],[46],[53],[64]
Hầu hết các phương pháp phân tích sắc ký dùng phát hiện và định lượng salbutamol và clenbuterol đều trãi qua ba giai đoạn như sau
• Chiết chất phân tích ra khỏi nền mẫu (mẫu nguyên liệu)
• Làm sạch mẫu, loại tạp chất ra khỏi dịch chiết và làm giàu chất phân tích • Sử dụng các phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ để xác nhận và định
lượng chất phân tích.
1.3.2.1. Chiết chất phân tích ra khỏi mẫu
Clenbuterol và salbutamol được chiết ra khỏi nền mẫu bằng dung dịch methanol hay acetonitrile ở pH = 6. Có thể dùng đệm để ổn định môi trường chiết. 1.3.2.2. Làm sạch dịch chiết và làm giàu chất phân tích.
Giai đoạn này là giai đoạn quan trọng trong quá trình phân tích chất ở dạng vết vì cần phải giảm đến mức gần như tuyệt đối ảnh hưởng của các tạp chất đến quá trình phân tích chất cần khảo sát, tránh làm dơ cột sắc ký và đầu dò khối phổ.
Trước đây thường áp dụng kỹ thuật chiết lỏng – lỏng nhưng với cách này phải tốn kém nhiều dung môi, thời gian, chưa kể đến khả năng mất chất phân tích nhiều hơn trong tách chiết và gây ô nhiễm môi trường. Do đó, hiện nay thường áp dụng phương pháp chiết pha rắn (SPE: Solid Phase Extraction), sử dụng cột trao đổi cation SCX trong trường hợp clen và sal vốn có tính base . Kỹ thuật này có nhiều ưu điểm là nhanh, tương đối ít tốn dung môi, dễ thao tác, có thể chuẩn bị nhiều mẫu cùng một lúc và có tỉ lệ thu hồi cao
1.3.3. Kỹ thuật chiết pha rắn (Solid Phase Extraction: SPE)
Chiết pha rắn là kỹ thuật rất tiện lợi dùng chuẩn bị mẫu trong sắc ký, kỹ thuật chiết pha rắn có thể loại bỏ các cấu tử gây nhiễu, cô lập có chọn lọc chất phân tích trong phân tích vết để đạt hiệu quả cao nhất. Sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn mang đến nhiều thuận lợi như tiêu tốn ít lượng dung môi, tiết kiệm được thời gian phân tích và thiết bị thường dễ sử dụng.
Có nhiều loại cột SPE dùng để chiết và làm sạch chất phân tích. Cột SPE là những cột nhỏ bằng nhựa bền, có dung tích tùy thuộc vào khối lượng chất hấp phụ được nhồi vào cột và tùy thuộc vào thể tích dung dịch chứa chất phân tích đi qua cột. Cột trao đổi cation SCX (Strata- SCX của hãng Phenomenex) có chứa nhựa trao đổi ion mang điện tích âm trên nền cố định và đối ion dương di động
Salbutamol và clenbuterol là những hợp chất mang điện tích dương ở pH acid nên các hợp chất này có thể được giữ tốt bởi cột trao đổi cation. Nguyên tắc hoạt động của cột SPE-SCX gồm các bước sau:
1.3.3.1. Hoạt hóa cột
Đây là công việc cần thiết đảm bảo cho cột được cân bằng và tương tác tốt của chất hấp phụ với chất phân tích. Mục đích là để loại trừ các chất bẩn có thể có trong cột trước khi sử dụng, đồng thời chuẩn bị cột đạt được điều kiện tương hợp với dung dịch sắp đưa vào để tách chiết chất cần phân tích từ hỗn hợp.
1.3.3.2. Nạp mẫu vào cột