Xác định dư lượng một số kháng sinh nhóm aminoglycosid trong thịt bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ (LC MS MS))

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ QUỲNH MAI XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MỘT SỐ KHÁNG SINH NHÓM AMINOGLYCOSID TRONG THỊT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP HAI LẦN KHỐI PHỔ LC – MS/MS KHÓA LUẬN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ QUỲNH MAI

XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MỘT SỐ KHÁNG SINH NHÓM AMINOGLYCOSID TRONG THỊT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP HAI LẦN KHỐI PHỔ

( LC – MS/MS )

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2015

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ QUỲNH MAI

XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MỘT SỐ KHÁNG SINH NHÓM AMINOGLYCOSID TRONG THỊT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP HAI LẦN KHỐI PHỔ

Viện Kiểm Nghiệm An Toàn Vệ Sinh Thực Phẩm Quốc Gia

HÀ NỘI - 2015

T ậ ố ệ , ậ

, em ậ

V ế ắ TS

C ận ư ng dẫ , ý ến cho em trong suố q c hiệ ề ế ận E ỏ ế ạo Viện kiểm nghiệ A

vệ sinh th c phẩm Quốc G , TS T ị Hồng H ạ ều kiệ ,

ề

E T T ị T T ư ậ

ư ẫ , ố q ệ ậ E

ị, ư ệ V ệ ể ệ

ệ ẩ Q ố q , , ạ ề ệ

ậ

C ố , ế ắ , ạ ,

, , , ậ ư

ố

D ệ ề ạ ế

E ậ ư ý ế ạ

H , 14 5 2015

S

T ị Q

MỤC LỤC

I C i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CÁC Ý HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC B NG vii

ẶT VẤ Ề 1

C ư 1: T G QUA 3

1.1 Tổng quan về aminoglycosid 3

1.1.1 q 3

1.1.2 C 3

1.1.3 T t 5

1.1.4 C ế diệt khuẩn c a aminoglycosid 5

1.1.5 Phổ ụng 5

1.1.6 T ụ ốn 6

1.2 Gi i hạ ư ư ng tố 6

1.3 C ư ịnh aminoglycosid 7

1.3.1 ễn dịch quang h c (Optical Imunobiosensor) 7

1.3.2 ện di mao qu n (capillary electrophoresis – CE) 7

1.3.3 Sắ ý ỏng hiệ (HPLC) 8

1.3.4 Sắ ý ỏng khối phổ (LC - MS, LC - MS/MS) 9

1.4 Tổ q ư c về sắ ý ỏng khối phổ 10

1.4.1 Sắ ý ỏng hiệ (HP C) 11

1.4.2 Khối phổ (Mass spectrometry) 12

CHƯ G 2: ỐI TƯỢ G VÀ PHƯ G PHÁP GHIÊ CỨU 16

2.1 ối ư ứu 16

2.2 ật liệu – trang thiết bị 16

2.2.1 ật liệu 16

2.2.2 Dụng cụ 18

2.3 N ứu 18

2.3.1 Kh ư 18

2.3.2 Thẩ ị ư 18

2.3.3 Ứng dụ ư 18

2.4 P ư ứu 18

2.4.1 P ư ý ẫu 18

2.4.2 P ư oglycosid 20

2.4.3 Q ẩ ị ư 20

2.4.3.1 T ặc hiệu /ch n l c 20

2.4.3.2 Gi i hạ ện (LOD), Gi i hạ ị ư ng (LOQ) 21

2.4.3.3 Kho ng tuyế ư ng chuẩn 21

2.4.3.4 lặp lạ thu hồi 22

2.4.4 P ư ý ố liệu 22

C ư 3: ẾT QU VÀ TH O LUẬN 23

3.1 Kh ư 23

3.1.1 Kh ều kiện khối phổ 23

3.1.1.1 Kh ều kiện bắ ối v i ion mẹ 23

3.1.1.2 Kh ều kiện bắ 24

3.1.2 ều kiện sắ ý ỏng 24

3.1.2.1 Ch ĩ 24

3.1.2.2 Ch ng 25

3.1.2.3 Kh ố ng 27

3.1.3 Kh ư ý ẫu thịt 28

3.1.3.1 Ch q ý ẫu 28

3.1.3.2 Kh ể ệm chiết 29

3.1.3.3 Kh H dịch chiết 31

3.1.3.4 Kh t chiết pha rắn SPE cho mẫu thịt 31

3.1.3.5 Kh a gi i 32

3.1.3.6 Kh ể a gi i 33

3.2 Thẩ ị ư 36

3.2.1 T ặc hiệu / ch n l c 36

3.2.2 X ịnh kho ng tuyế 38

3.2.3 lặp lạ thu hồi 39

3.2.4 Gi i hạ ệ i hạ ị ư ng 41

3.2.5 B ận 41

3.3 Á ụ ẫu th c tế 42

KẾT LUẬ VÀ IẾN NGHỊ 43

Kết luận 43

Kiến nghị 44 TÀI IỆU THAM KH O

PHỤ LỤC

DANH MỤ Á KÝ H ỆU, Á HỮ VIẾT TẮT

LOQ Limit of quantification Gi i hạ ị ư ng

DANH MỤ Á B NG

Bảng 1.1: Phân loại các kháng sinh nhóm aminoglycosid 4

Bảng 1.2: Mức giới hạn dư lượng tối đa của một số aminoglycosid 7

Bảng 1.3: Một số nghiên cứu dùng phương pháp HPLC xác định aminoglycosid 8

Bảng 1.4: Các nghiên cứu dùng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ để phân tích kháng sinh aminoglycosid 9

Bảng 3.1: Điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI 23

Bảng 3.2: Kết quả bắn phá các ion mẹ 23

Bảng 3.3: Năng lượng bắn phá các ion con của aminoglycosid 24

Bảng 3.4: Chương trình gradient 1 25

Bảng 3.5: Chương trình gradient 2 25

Bảng 3.6: Chương trình gradient 3 26

Bảng 3.7: Ảnh hưởng của hệ pha động đến thời gian lưu và diện tích pic 26

Bảng 3.8: Ảnh hưởng của tốc độ dòng đến thời gian lưu và diện tích pic 27

Bảng 3.9: Chương trình chạy gradient tối ưu 28

Bảng 3.10: Khảo sát thể tích dung môi chiết 30

Bảng 3.11: Khảo sát pH dịch chiết 31

Bảng 3.12: Khảo sát loại cột chiết pha rắn SPE cho mẫu thịt 32

Bảng 3.13: Khảo sát tỷ lệ dung môi rửa giải 33

Bảng 3.14: Khảo sát thể tích dung môi rửa giải 34

Bảng 3.15: Ion mẹ và ion con của một số aminoglycosid 36

Bảng 3.16: Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ streptomycin 38

Bảng 3.17: Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp xác định streptomycin trong thịt 40

Bảng 3.18: Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp xác định dihydrostreptomycin trong thịt 40

Bảng 3.19: Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp xác định gentamicin trong thịt 40 Bảng 3.20: Kết quả phân tích mẫu thực tế 42

DANH MỤ Á HÌ H VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1: Cấu trúc phân tử một số aminoglycosid 4

Hình 1.2: Sơ đồ khối của máy khối phổ 13

Hình 1.3: Bộ nguồn ion hóa ESI 14

Hình 1.4: Bộ phân tích tứ cực chập ba 15

Hình 2.1: Các bước của quy trình chiết pha rắn 19

Hình 3.1:Quy trình xử lý mẫu thịt 29

Hình 3.2: Đồ thị khảo sát sự ảnh hưởng của dung môi chiết đến hiệu suất thu hồi 30

Hình 3.3: Đồ thị khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến hiệu suất thu hồi 31

Hình 3.4: Đồ thị khảo sát sự ảnh hưởng của cột chiết đến hiệu suất thu hồi 32 Hình 3.5: Đồ thị khảo sát sự ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi rửa giải đến hiệu suất thu hồi 33

Hình 3.6: Đồ thị khảo sát sự ảnh hưởng của thể tích dung môi rửa giải đến hiệu suất thu hồi 34

Hình 3.7: Quy trình xử lý mẫu tối ưu 35

Hình 3.8: Sắc đồ mẫu trắng 36

Hình 3.9: Sắc đồ mẫu chuẩn 50 ppb và mẫu trắng thêm chuẩn streptomycin 37 Hình 3.10: Sắc đồ mẫu chuẩn 50 ppb và mẫu trắng thêm chuẩn dihydrostreptomycin 37

Hình 3.11: Sắc đồ mẫu chuẩn 50 ppb và mẫu trắng thêm chuẩn gentamicin 37 Hình 3.12: Đường hồi quy tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ streptomycin 38

Hình 3.13: Đường hồi quy tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ dihydrostreptomycin 39

Hình 3.14: Đường hồi quy tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ gentamicin 39

ặ

K ư c s dụng ỉ ụ a bệ , ể

ứ ề ư ng c a vậ V ệc lạm dụng thuố ư

tr ng t i sức khỏ ư i, dẫn t i ạng kh , ị ứng, ph n ứ q ẫ , c… aminoglycosid t

ư c s dụng r ể ều trị ệnh nhiễ ẩn hoặ ẩ ư ng [28] Việc ư

c hiệ th ư ố ư c khi xu dẫn t i việc

i kh ng sinh khỏ ể vậ ư ệ ể, tồ ư trong thịt , m ư ịt sẽ p thụ tồn

ư, ẫn t i ng b t l i cho sức khỏe  (EU), Trung Quốc, Mỹ, Nhật B n t số quốc gia ứ ư

ư ng ố (MRL) c a aminoglycosid trong ại th c phẩm ồn gốc ng vật [28]

-hiệ ề : “Xác định dư lượng một số kháng sinh nhóm aminoglycosid

trong thịt bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ (LC MS/MS)” ằ ục :

-1 X ng ư ị ư ư ng m t số aminoglycosid trong thịt bằng LC - MS/MS

2 Á ụ ư t số mẫu th c tế

n U 1.1 Tổng quan về n m k án sin aminoglycosid

1.1.1 Khái quát chung

lycosid, hay aminosid,

ậ ừ ư C ư

W ( ỹ) ệ 1944 ừ ư

Streptomyces griseus [24], [8] 1949, ư ư c neomycin từ Streptomyces fradiae [8], [25]; tiế ycin từ

Streptomyces kanamyceticus 1957 [8], [16] Gentami ư ập

từ xạ khuẩn Micromonospora purpurea 1963 [9], [21] Sisomicin ư c

Hình 1.1: Cấu trúc phân tử một số aminoglycosid Bảng 1.1: Phân loại các kháng sinh nhóm aminoglycosid

Diamino -1,3- cyclitol

Diamino - 1,4-cyclitol

Genin Streptamin Streptidin Deoxy – 2 - streptamin Fortamin

T

Spectinomycin Streptomycin T ế 4,5

Neomycin Framycetin Paromomycin Lividomycin Ribostamycin Butirosin

T ế 4,6 Kanamycin Gentamicin Tobramycin Sisomycin

T ế 4 Apramycin

Amikacin Dibekacin Netilmycin

- T , ạo muối tan v i acid

1.1.4 ơ chế diệt khuẩn của aminoglycosid

Aminoglycosid gắ ể ị 30S c ến dạng ribosom, ế q ổng h p protein c a vi khuẩ 3 :

ết qu ạ a tế ẩ ạt , ẩn bị ệt

v i s AR ể ư t d c theo s AR ể tổng h p chu i peptid m i [4]

1.1.5 Phổ tác dụng

C ụng hạn chế ẩn Gr (+),

ư ều trị nhiễm khuẩn Gr (-) hiế P ổ ụng bao

gồm: Serratia spp, Proteus spp, Klebsiella spp, Enterobacter spp, E.Coli,

Acinetobacter spp, Providencia spp, Flavobacter spp [4], [26]

1.1.6 Tác dụng không mong muốn

- :

Bao gồ ề [17], [18] : riệu chứ , t kh m nhậ n số cao

Gi i hạ ư ư ng tố ( R ) ư ng cao nh t c a m t loại ối

ư ng cụ thể ư q ị ý p nhận cho é ồn tạ ể

vậ , ứ ạ ư i s dụ

vậ ụ

T q ịnh số 46/2007/Q - BYT c a B ư ng B Y tế về “Q ịnh gi i hạn tố ễm sinh h c trong th c phẩ ”, mứ ư

ư ng tố é c phẩ ối v i m t số aminoglycosid [3] ư q ịnh b ng 1.2:

Bảng 1.2: Mức giới hạn dư lượng tối đa của một số aminoglycosid

S (µ / ) 200

Gan l n 600 Thận l n 1000

M l n 100

1.3 ác p n p áp xác định aminoglycosid

1.3.1 Đầu dò miễn dịch quang h c (Optical Imunobiosensor)

miễn dịch quang h c hoạ ng d

- ể G Baxter ng s ứng dụng ư ể ịnh

ư ư ng streptomycin trong s a [11]

1.3.2 Điện di mao quản (capillary electrophoresis – CE)

P w ng s [22] dụ ư ện di mao qu n trong việ ứ ỏ trứng

ứu s dụng dung dị ệm gồm 30 mM natri dihydrophosphat,

5 mM acid 5 natri tetraborat dụng acetonitril

 thu hồi :

Bảng 1.4: Các nghiên cứu dùng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ để

phân tích kháng sinh aminoglycosid

LOD, LOQ

HPLC MS/MS

-70

-

107

- LOD: 0,2 – 2 ng/g

- LOQ: 0,1 - 0,5 mg/kg

[26] S a

2,9 % acid perchloric, 0,6 mM

HPLC MS/MS

-113

-

139

LOQ: 0,01 - 0,1 mg/kg

[20] S a

10 mM

NH 4 OCOCH 3 / 0,4 mM

Na 2 EDTA/1 % NaCl/2 %TCA

20 mM HFBA/H2O –

20 mM HFBA/ACN

Oasis HLB

UPLC/

MS/MS

77,7 - 93,4

[7] S a

5 % acid trichloroacetic, 0,6 mM

Na 2 EDTA, 15

mM KH2PO4

H2O : ACN (950 : 50),

20 mM HFBA – ACN : H 2 O (800 : 200)

5 %

H2O : ACN (950 : 50), 20mM HFBA

- ACN : H 2 O (800 : 200),

20 mM HFBA

-MS/MS

71 - 93,3

[27] Mật

ong

15 ml acid trichloroacetic

5 %

H 2 O : ACN (950 : 50),

20 mM HFBA

- ACN : H 2 O (500 : 500),

20 mM HFBA

Oasis HLB

LC MS/MS

5 %

H2O : ACN (950 : 50),

20 mM HFBA

- ACN : H2O (500 : 500),

20 mM HFBA

Oasis HLB

MS/MS

LC-MS/MS

101 –

ể ư ng vết trong mẫ n phức tạp [28]

1.4.1 Sắc ký lỏng hiệu năng c o (HPL )

Sắ ý ỏ q ĩ t rắn

t lỏ C ển qua c t, tố di chuyể q ế ư ối c a ch t v ĩ pha T ư ển qua c t c n

ư ều chỉ ể r a gi i th i gian h ý [1]

- P ĩ HP C

P ĩ HP C t nhồi c ệm vụ n h p gồm nhiề t rắn xố , ư c nhỏ, ư 3 - 10

µ , P ĩ ư c chế tạo từ ức

é , ư ạt silica T

b n ch ĩ , ư ại:

 Sắ ý ậ : ĩ ề mặ ư glycol; ư: n-hexan, toluen, iso propyl ether Trong sắ ý ận ch c nh t

ư c r a gi c c ng, th ư

gi m d n

 Sắ ý o: p ĩ ư , c Trong sắ ý , c nh ư c r a gi ,

c c ng th ư [1]

- P ng trong HPLC

P a gi ỏi c t sắ ý P

ể , ặc h n h ỷ lệ nh t ịnh Trong sắ ý ậ , c ư: n - hexan, benzen, chloroform… Trong sắ ý , ệ ư: , ay h n h p c a [1]

1.4.2 Khối phổ (Mass spectrometry)

Khối phổ ết bị ịnh khố ư

t c p ch c bằng việc theo tỉ số gi a khối

ư ệ ( /z) C ư c tạ ồng ion , ư c gia tố b ố ư ến detector

T ệ ư ứng v ẽ ư c thể hiện bằng m t số vạ ( )

ư ập h ổ khố ị

Hệ c

Hình 1.3: Bộ nguồn ion hóa ESI

ẹ bị m nh tiếp theo tạ ỏ ,

é ối phổ tạo ra m ệu c ư ứng từ ứ

c ư c khuế ại hoặc tạo ra m ệ ển

HƯ 2 ĐỐ ƯỢ VÀ PHƯ PHÁP H Ê ỨU 2.1 Đối t ợn n iên cứu

ố ư ứu c ề ại mẫu thịt l n thị ư ng c

2.2 uyên vật liệu – trang thiết bị

2.2.1 Nguyên vật liệu

a Chất chuẩn

ư ồ , gentam 100 ppm (100 µ / )

b Hóa chất, dung môi

- T t c ịch (trừ ư ng h p s dụ ạ loại tinh khiết sắ ý) ề ư c l q 0,45 µ sau khi chuẩn bị ư ư ệ thống LC – MS

bằ ư c c ịnh mứ 1 , ịnh mức t i vạch, lắ ều

NaCl; 20,0 g TCA Lắ ều cho tan hết

ịnh mứ 500 , ịnh mức t i vạch bằ ư c c ắc

ý ắ ều

10,0 ml l y 10,0 ml dung dịch acid f ; 5,0 isopropanol ịnh mứ 100 ịnh mức t i vạch bằng

ư c c t 2 l n

+ Dung dịch HFBA 20 mM ư c: h 1,3 HFBA, pha trong ư 1000 ml L q 0,45 µ + Dung dịch HFBA 20 mM trong acetonitril: ư ư , thay ư c bằng acetonitril

2.4 P n p áp n iên cứu

2.4.1 Phương pháp xử lý mẫu

T ứ dụ ư ết pha rắn (SPE) ể x ý ẫu

Chiết pha rắn (chiết rắn – lỏ ) q ố t tan gi a hai pha rắ ỏ T ố trong pha lỏ ( ư c

hoặ ), ch ể h p thụ ch t tan dạng rắn (dạng hạt, nhỏ, ốp) g ắn Q ết:

Hình 2.1: Các bước của quy trình chiết pha rắn

- Thể a gi ố ư m b o

r a sạch ch ỏi vật liệu h p phụ

2.4.2 Phương pháp phân tích các minoglycosid

S dụng kỹ thuật sắ ý ỏng kết nối khối phổ 2 l n (LC - S/ S) ể , ẫu thịt l n q ạn

 T ồ ư ẫu thịt (nế ) ỏi nền mẫu

bằ ịch mẫ ý ư 2.4.1 qua

c t sắ ý ều kiệ h p

 Nhận diệ ị ( ế ) ng r a gi i ra khỏi c t bằ ặ ối phổ ư ẫu th

v i phổ ư ịch chuẩ , m b ư c

ều kiệ é ết qu ổ ặc hiệu

 L a ch n m ặ ư a từ ế

R ết bị khối phổ hai l ể ị ư ư ư ng từ sinh (nế ) trong mẫu thịt l n

ểm IP ( ểm nhận dạng - identification point) ối v ư

 Xác định: D ỷ lệ ệ ễu (S/N)

P ẫu nồ th ể xu t hiệ ệu c a ch

X ịnh tỷ lệ ệu chia cho nhiễu (S/N = Signal to noise ratio)

T : S: C ề ệu c a ch

N: Nhiễ ư ng nền

OD ư c ch p nhận tại nồ ạ ệu l n g p 2 - 3 l n nhiễu ư ng nề , ư ng l y S/N = 3

LOQ ư c ch p nhận tại nồ ạ ệu l n g p 10 - 20 l n nhiễ ư ng nề , ư ng l y S/N=10

2.4.3.3 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

 Khái niệm :

Khoảng tuyến tính c a m ư : ng nồ

phụ thu c tuyế ạ ư ư ồ ch t

Đường chuẩn: ư ng biểu diễn s phụ thu c tuyế ại

ư ư ồ

 Xác định: ịch chuẩ ồ ổ h

phụ thu c c ệ ồ Vẽ ư ng cong phụ thu c gi ệu

ồ , q phụ thu ế ế

2.4.3.4 Độ lặp lại và độ thu hồi

Độ lặp lại (đánh giá độ chụm): ứ ứ g n nhau c

g ị c é ặp lạ ư c biểu diễn bằ lệch chuẩn

Độ đúng của phương pháp: ệm chỉ mứ g n nhau gi

ị trung b a kết qu th nghiệ ị th c hoặ ị ư c

n 3 KẾT QU VÀ H O LUẬN 3.1 Khảo sát p n p áp p ân tíc k án sin amino lycosid

3.1.1 Khảo sát điều kiện khối phổ

3.1.1.1 Khảo sát điều kiện bắn phá đối với ion mẹ

T ứ ế ịnh aminoglycosid bằ ĩ ậ ện t (ESI) v i chế bắn ion

ư ể tố ư ều kiện khối phổ, tiế n h p chuẩ

b 3 1 3 2

Bảng 3.1: Điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI

T ố Vị G ị tố ư IonSpray Voltage (IS) V 5000

Temperature (TEM)

ºC 450 IonSource (GS1)

psi 30 IonSource (GS2)

3.1.1.2 Khảo sát điều kiện bắn phá ion con

D ư c s dụ ứ ối phổ 2 l , ể

ệ ệc ch ư t quan tr ng Ion con ph ệu g t 10 l n so v i ion mẹ ể ư c m nh

ệ n ph i ch ư c mứ ư ng bắ

D ẩn aminoglycosid 20 ppb ể

t ng tố ư ứ ư ng bắ ẹ ể tạ ết

qu ư c b ng 3.3:

Bảng 3.3: Năng lượng bắn phá các ion con của aminoglycosid

Aminoglycosid Ion mẹ Ion con DP (V) CE (eV) CXP (V)

3.1.2.2 Chọn pha động

T ư ắ ý ỏng khối phổ, ỉ nh

ư ng t q ư ng t q

ệu c a ch V i kỹ thuậ ện t bắ chế ư , q t ư acid acetic, acid formic D ịch chuẩn h n h p aminoglycosid 200 ppb