ĐỘ TUYẾN TÍNH CỦA ĐƯỜNG CHUẨN Ø Đường chuẩn được xây dựng kèm theo nội chuẩn trên nền mẫu trắng.. Ø Cách thực hiện: xác định các giá trị đo theo nồng độ của mỗi chất với 6 điểm chuẩn, mỗ
Trang 1CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH KHÁNG SINH TRÊN MẪU THỦY SẢN BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG
GHÉP HAI LẦN KHỐI PHỔ (LC/MS/MS)
THEO TIÊU CHUẨN CHÂU ÂU
1
CBHD: TS Trần Minh Phú HVTH: Nguyễn Văn Luy
Trang 2QUY TRÌNH XỬ LÝ MẪU
Cân 3g mẫu vào ống nghiệm 50 mL
Bổ sung nội chuẩn
Thêm 1 mL đệm phosphate Thêm 20 mL acetonitril
Lắc đều 1phút
Ly tâm 6 phút ở tốc độ 6000 vòng/phút
Lấy dịch trích vào ống nghiệm 50 mL khác
Thêm acetonitril đến 24 mL, lắc đều
Trang 3QUY TRÌNH XỬ LÝ MẪU
Hút 8 mL cho vào ống 15 mL chứa 400 mg bột C18
Lắc kỹ trên máy lắc 20 phút
Ly tâm 4 phút ở tốc độ 6000 vòng/phút
Hút lớp trên vào ống nghiệm thủy tinh 10 mL
Cô cạn ở nhiệt độ 40 ±1 0 C dưới dòng khí nitrogen
Hòa tan bằng 1 mL nước cất HPLC Lắc kỹ, lọc qua màng lọc 0,2 µm và cho vào lọ 1,5 mL
Tiêm vào và xác định trên LC/MS/MS
Trang 4ĐIỀU KIỆN PHÂN MẢNH TRÊN KHỐI PHỔ
(m/z)
Ion con (m/z)
Dwell time (s)
Cone (V)
NL Cone (eV)
Florfenicol (ESI-) 355,9 184,8
118,8
30 Florfenicol amin
(ESI+)
247,9 129,9
90,8
45
Amoxicillin (ESI+) 366,0 349,0
113,4
20 Doxycycline (ESI+) 445,1 428,1
153,9
30 Chloramphenicol d5
(ESI-)
326,0 157,0
262,0
12 Penicillin V (ESI+) 351,0 159,9
113,9
35
Trang 5CÁC THÔNG SỐ CẦN XÁC ĐỊNH
1 Tuyến tính của đường chuẩn 0,99≤ R 2 ≤1
2 Độ đặc hiệu/độ chọn lọc RSD RT (%) ≤ ±2,5% và IP ≥ 4
3 Giới hạn phát hiện Tín hiệu/nhiễu (S/N) ≥ 3
4 Giới hạn định lượng Độ thu hồi và độ lặp lại đạt
5 Giới hạn quyết định Độ thu hồi và độ lặp lại đạt
6 Khả năng xác định Độ thu hồi và độ lặp lại đạt
7 Độ lặp lại Độ thu hồi và độ lặp lại đạt
8 Độ tái lặp Độ thu hồi và độ tái lặp đạt
9 Độ đúng/độ thu hồi Độ thu hồi đạt
10 Khoảng xác định 0,99≤ R 2 ≤1
Trang 6ĐỘ TUYẾN TÍNH CỦA ĐƯỜNG CHUẨN
Ø Đường chuẩn được xây dựng kèm theo nội chuẩn
trên nền mẫu trắng.
Ø Cách thực hiện: xác định các giá trị đo theo nồng độ
của mỗi chất với 6 điểm chuẩn, mỗi điểm chuẩn được
đo lặp lại 3 lần, thiết lập phương trình hồi quy y = ax
+ b Tính hệ số tương quan (R 2 ).
Ø Xây dựng 03 đường chuẩn trong 03 ngày khác nhau
Ø Tiêu chí chấp nhận: 0.99 ≤ R 2 ≤1
(EC, 2002)
Trang 7ĐỘ ĐẶC HIỆU/ĐỘ CHỌN LỌC
Ø Tổng hợp thời gian lưu của các chất phân tích, tính toán, độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu được chấp nhận tối đa là ± 2,5%
Ø Mặt khác đối với các phương pháp dùng kỹ thuật sắc
ký ghép hai lần khối phổ, sử dụng thêm cách tính điểm
IP (Indentification point) và số điểm tối thiểu là 4 điểm Tương ứng với 01 ion mẹ và 02 ion con, trong đó ion mẹ 1 điểm và 02 ion con, mỗi ion con 1,5 điểm.
(EC, 2002)
Trang 8GIỚI HẠN PHÁT HIỆN CỦA PHƯƠNG PHÁP (LOD)
Ø Phân tích tối thiểu 20 mẫu trắng, tính độ lệch chuẩn
Sr, sau đó tính LOD bằng công thức: LOD = Xtb +
3*Sr (AOAC Guidelines, 2002)
Ø Thực hiện phân tích tối thiểu 10 mẫu thêm chuẩn tại
LOD để đánh giá thẩm tra và xác định giá trị LOD
thực tế của phương pháp, sao cho tại LOD thì S/N ≥ 3
Ø Nếu tỉ lệ này không đạt, phải tiến hành thực hiện
thêm chuẩn với nồng độ cao hơn nồng độ đã thực
hiện.
Trang 9GIỚI HẠN ĐỊNH LƯỢNG (LOQ)
Ø Từ kết quả phân tích 20 mẫu trắng và độ lệch chuẩn
đã tính, LOQ được tính bằng công thức sau: LOQ =
Xtb + 10*Sr (Xtb: giá trị trung bình của mẫu trắng)
Ø Thực hiện phân tích tối thiểu 10 mẫu thêm chuẩn tại
LOQ Kết quả độ thu hồi, độ lặp lại phải đạt với tiêu
chí chấp nhận theo quy định của theo Quy định số
657/2002/EC.
(AOAC Guidelines, 2002)
Trang 10GIỚI HẠN QUYẾT ĐỊNH (CCα)
Phân tích ít nhất 20 mẫu trắng có bổ sung các chất
phân tích ở giới hạn cho phép (MRL) Khi đó CCa
được tính như sau:
CCa = MRL + 1.64*SD Trong đó:
CCa: giới hạn quyết định MRL: giới hạn cho phép SD: Độ lệch chuẩn tại MRL
(EC, 2002)
Trang 11KHẢ NĂNG XÁC ĐỊNH (CCβ)
Phân tích ít nhất 20 mẫu trắng có bổ sung các chất
phân tích ở tại giới hạn quyết định CCa Khí đó CCβ
được tính như sau:
CCβ = CCα + 1.64*SD Trong đó:
CCβ: khả năng xác định CCα: giới hạn quyết định SD: Độ lệch chuẩn tại CCα
(EC, 2002)
Trang 12ĐỘ LẶP LẠI
Với cùng điều kiện phân tích Mẫu trắng thêm chuẩn
ở các mức nồng độ 0,5; 1,0 và 1,5 lần tại MRL Mỗi mức
nồng độ thực hiện lặp lại 07 lần Tính toán nồng độ phân
tích được, tính nồng độ trung bình, độ lệch chuẩn (SD) và
độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của mỗi nồng độ, công
thức tính độ lệch chuẩn tương đối:
RSD (%) = SD*100/Xtb Trong đó: SD: độ lệch chuẩn lặp lại
Xtb: giá trị trung bình của n lần lặp lại trong cùng điều kiện phân tích
(EC, 2002)
Trang 13ĐỘ TÁI LẶP
Phép thử được thực hiện với các thời điểm khác Mẫu trắng thêm chuẩn ở các mức nồng độ 0,5; 1,0 và 1,5 lần đối với các chất có công bố MRL Mỗi mức nồng độ thực hiện lặp lại ít nhất 07 lần/nền mẫu, với ít nhất 03 thời điểm khác nhau, với tổng số là 63 mẫu Tính nồng độ phân tích, tính nồng độ trung bình, SD và RSD của mỗi nồng độ.
Tính độ lệch chuẩn tương đối tái lặp :
RSD (%) = SD*100/Xtb Trong đó: SD: độ lệch chuẩn tái lặp
Xtb: giá trị trung bình của n lần lặp lại trong các điều kiện phân tích
(EC, 2002)
Trang 14ĐỘ THU HỒI
Từ kết quả phân tích xác định độ tái lặp, ta tính độ
thu hồi, thường được biểu thị bằng phần trăm
R(%) = C a *100/C b Trong đó:
R: độ thu hồi
C a : nồng độ chất phân tích được
C b : nồng độ chuẩn thêm vào
(EC, 2002)
Trang 15KHOẢNG XÁC ĐỊNH
Ø Chuẩn bị đường chuẩn tối thiểu 8 điểm với nồng độ tăng dần (tăng thêm 2 điểm).
Ø Tính toán, vẽ đồ thị xác định khoảng xác định cho phương pháp.
Ø Khoảng nồng độ này bao gồm giới hạn trên và giới hạn dưới của chất phân tích (bao gồm cả các giới hạn này) được chứng minh qua độ tuyến tính đạt theo yêu cầu.
(EC, 2002)