Phúc trình môn thực tập các phương pháp phân tích hiện đại

Mỗi viên chứa một liều của một hay nhiều hoạt chất được điều chế bằng cách nén nhiều khối phân tử đồng đều của các chất với viên nén chứa Paracetamol chế phẩm phải đáp ứng được các yêu c

BÀI 1 KIỂM THUỐC VIÊN NÉN CHỨA PARACETAMOL

I Giới thiệu

Viên nén là chế phẩm rắn dùng để uống, nuốt hoặc nhay, có thể hòa với nước trước khi uống hoặc ngậm trong miệng Mỗi viên chứa một liều của một hay nhiều hoạt chất được điều chế bằng cách nén nhiều khối phân tử đồng đều của các chất với viên nén chứa Paracetamol chế phẩm phải đáp ứng được các yêu cầu trong chuyên luận “thuốc viên nén”(với các chỉ tiêu như: độ đồng đều khối lượng, độ tan rã, độ đồng đều hàm lượng, độ nhiễm khuẩn )và các yêu cầu sau đây:

1 Tính chất

Thuốc viên rắn, màu trắng, không mùi

2 Định tính

Có các phản ứng đặc trưng khi

 Định tính bằng phản ứng hóa học và

 Định tính bằng sắc ký lớp mỏng

3 Độ hòa tan

Thử theo chuyên luận “Nang paracetamol”

Thiết bị hòa tan: kiểu cánh khuấy

Môi trường hòa tan: 900ml nước

Tốc độ quay: 50 vòng/ phút

Thời gian: 45 phút

4 4-Aminophenol

Thử theo chuyên luận “Nang paracetamol”

Nhưng mà môi trường hòa tan là: 900ml đệm phosphat pH 5,8(TT)

5 Tạp chất liên quan

Thử theo chuyên luận “Nang paracetamol” bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng

6 Định lượng

Hàm lượng của paracetamol: C H NO

Đối với viên 100mg: Từ 90,0 đến 110,0% so với hàm lượng ghi trên nhãn

Đối với viên 300mg và 500mg từ 95,0 đến 105,0% so với hàm lượng ghi trên nhãn

7 Bảo quản

Để nơi mát, trong đồ đựng kín

8 Loại thuốc

Giảm đau, hạ sốt

II Tiến hành thí nghiệm

1 Tính chất

Đánh giá cảm quan:

- Màu sắc: màu trắng

- Mùi vị: không mùi vị đắng

- Bề mặt: nhẵn bóng, cứng

2 Định tính

A Lấy một lượng bột thuốc tương ứng với khoảng 0.5g paracetamol, thêm 30ml aceton,

khuấy kỹ, lọc, làm bay hơi dịch lọc đến cắn, lấy cắn làm các phản ứng sau đây: Đun sôi 0.1g cắn với 1ml acid hydrocloric 10% trong 3 phút, thêm 10ml nước cất, để nguội Thêm 1 giọt dung dịch kali dicromat 5% sẽ xuất hiện màu tím, không chuyển sang màu

đỏ

B Sắc ký lớp mỏng

Bản mỏng: Silicagel GF254 đã hoạt hóa ở 1050C trong 1 giờ

Hệ dung môi: Aceton – Eter etylic (20ml : 10ml )

Dung dịch thử: Hòa tan một lượng bột chế phẩm tương ứng với 10 mg paracetamol trong 10ml methanol Lọc

Dung dịch đối chiếu: Hòa tan 10 mg paracetamol trong 10 ml methanol

Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 20µl các dung dịch trên Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi được 9 cm Lấy bản mỏng ra để khô ngoài không khí Cho hiện hình bằng dd KMnO4 trong môi trường kiềm – (phun nhẹ hoặc nhúng nhanh trong dd KMnO4 rồi làm khô) cũng có thể quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm) ta thể hiện qua sắc kí đồ như sau:

Vết chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải tương ứng về vị trí và màu sắc với vết chính thu được trong sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu Từ sắc kí đồ ta thấy độ tinh khiết của mẫu so với dd chuẩn hầu như tương nhau và thành phần khác không phát hiện

3 Định lượng

Cân 02 viên, tính khối lượng trung bình viên và nghiền thành bột mịn Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng khoảng 0,2 g parracetamol vào bình định mức 250 ml, thêm 60

ml dung dịch natri hydroxyd 0,1 M và 60 ml nước, lắc 15 phút, thêm nước đến vạch định mức Lắc đều, lọc qua giấy lọc khô, bỏ 20 ml dịch lọc đầu tiên

Lấy chính xác 10 ml dịch lọc cho vào bình định mức 100 ml Thêm nước vừa đủ đến vạch, lắc đều Lấy chính xác 10 ml dd trên vào bình định mức 100ml, thêm 10ml dung dịch natri hydroxyd 0,1M, thêm nước đến định mức, lắc đều Đo độ hấp thụ của dung dịch thu được bước song 257nm, dung cuvet dày 1cm kết quả như sau:

Mẫu cần xác định 3,3983 Mẫu trắng là dung dịch natri hydroxyd 0,01M

Đo dung dịch chuẩn paracetamol 10ppm cũng được bước song 257nm

Dựa vào định luật Beer-Lambert, tính hàm lượng paracetamol, C8H9NO2 trong mẫu sau khi trừ nền:

III Câu hỏi

1 Các chỉ tiêu kiểm nghiệm thuốc dạng viên nén: kiểm nghiệm cảm quan, độ đồng đều

về khối lượng, độ mài mòn, độ tan rã, độ hòa tan, độ đồng đều về hàm lượng, độ nhiễu khuẩn, định tính dựa trên tính chất đặt trưng của sản phẩm, định lượng dựa trên nhưng phương pháp hiện đại dễ tiến hành, hiệu quả tối ưu Từ đó kết luận thành phần của từng sản phẩm so với thành phần ghi trên bao bì

2 Phương trình phản ứng định tính Paracetamol bằng phương pháp hóa học:

3 Bước cân bột paracetamol và pha nồng độ dung dịch sẽ gây ra sai số nhiều nhất, ảnh

hưởng đến kết quả lớn nhất

BÀI 2 XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CHO DƯỢC LIỆU: RAU MÁ KHÔ

I Giới thiệu

Công tác tiêu chuẩn là một phần quan trọng của công tác kiểm nghiêm Đó là những quy định mang tính pháp chế để kiểm nghiệm viên căn cứ vào đó mà tiến hành thực nghiệm, đánh giá kết quả, công bố kết quả là đạt hay không đạt và có được phép lưu hành ( hoặc sử dụng ) hay không Dựa trên thực tiễn của cơ sở và những yêu cầu về chất lượng đối với dược liệu khô tiêu chuẩn

cơ sở thường bao gồm những chỉ tiêu sau:

 Đánh giá cảm quan ( thể chất, màu sắc, mùi vị )

 Độ tinh khiết ( độ ẩm, cắn không tan, tro toàn phần, kim loại nặng, độ nhiễm khuẩn )

 Định tính nhóm hoạt chất chính bằng phương pháp sử dụng thuốc thử hóa học hoặc bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng

 Định lượng hoạt chất chính bằng phương pháp chiết, phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao,…

II Tiến hành thí nghiệm

1 Đánh giá nguyên liệu cây rau má

 Độ ẩm

Giới thiệu: Dùng sức nóng làm bay hơi hết nước trong dược liệu khô Cân trọng lượng trước và sau khi sấy khô, từ đó tính ra được phần trăm nước có trong dược liệu khô

Cách tiến hành:

 Sấy cốc thủy tinh có nắp ở 85oC trong 1/2 giờ đến khối lượng không đổi, làm nguội trong bình hút ẩm và cân (mog)

 Cho dược liệu khô rau má vào cốc cân thủy tinh có nắp,cân (m1g)

 Sấy dược liệu khô rau má ở 85oC trong 3 giờ đến khi khối lượng không đổi, làm nguội trong bình hút ẩm và cân (m2g)

Cách tính kết quả: m1-m2

Độ ẩm (H%) được tính theo công thức:

H(%) =

Với: m o là khối lượng chén sứ (g)

m 1 là khối lượng dược liệu khô rau má (g)

m 2 là khối lượng chen sứ và dược liệu khô rau má (g)

2 Định tính nhóm saponin trong rau má

a Phương pháp tạo bọt

Cân 1g bột rau má, thêm 5 ml nước nóng vào Lắc đều rồi lọc vào một ống nghiệm có nắp đậy Thêm nước cho đủ 10 ml, đậy nắp và lắc mạnh trong khoảng 1 phút (= 30 lần lắc) Để yên ống nghiệm quan sát cột bọt và đánh giá kết quả sau 15, 30,60 phút ( làm song song 2 mẫu)

Ta nhận thấy lượng bọt tạo ra ít, qua nhưng giai đoạn thời gian 15, 30, phút lượng bọt ít thay đổi, ở giai đoạn 60 phút bọt dần tan hết chứng tỏ độ nhớt của rau má kém và không bền

b Phương pháp hóa học ( Phản ứng Liebermann- Burchard)

Lấy 1 g bột rau má cho vào ống nghiệm, thêm 3-5 ml alcol etylic, lắc đều, lọc lấy dung dịch Cho vào ống nghiệm đã sấy khô 5 giọt dịch chiết alcol Thêm vào 1 ml anhydric acetic và 2 ml chloroform Dùng pipet Pasteur thêm cẩn thận 1 ml H2SO4 đđ xuống đáy ống nghiệm Quan sát vòng ngăn cách:

Có màu hồng đến đỏ tím thì sơ bộ kết luận dược liệu có saponin triterpen

Có màu xanh dương đậm hay xanh lá cây thì sơ bộ kết luận có saponin steroid Qua quan sát ta thấy vòng ngăn cách có màu nâu xanh Chứng tỏ có cả 2 loại saponin trên

 Chú ý: Không được lắc ống nghiêm vì axit sẽ bắn ra Lhi rửa ống nghiêm phải vặn

vòi nước trước, đổ nhẹ dịch ra rồi mới rửa lại bằng nước

3 Định lượng saponin toàn phần

a Giới thiệu: Chiết saponin tp bằng dm thích hợp, bay hơi dung môi Hàm lương

saponin toàn phần được tính bằng khối lương cắn trên khối lượng bột rau má khô

b Cách tiến hành:

Cân 5g rau má, chiết với 30ml methanol, lắc đều Lọc lấy dịch lọc Tiếp tục chiết thêm 2 lần, mỗi lần 20 ml methanol

Đun cách thủy làm bay hơi methanol ( còn khoảng 1-2 ml thì ngừng đun ), hòa tan với 15 ml nước cất rồi cho vào phiễu chiết Tráng rửa cốc bằng một ít ether dầu hỏa

Dịch nước được chiết với ether dầu hỏa,lấy lớp nước, chiết đến lớp ether không màu ( 3 lần chiết, mỗi lần 20 ml ether dầu )

Lớp nước tiếp tục được chiết với Butanol đã bảo hò nước ( lấy 30 ml n-Butnol+10 ml nước,lắc đều để yên cho tách lớp, lấy lớp n-butanol, có thể lấy luôn cả lớp nhũ ở giữa ), vhieets 3 lần, mỗi lần dung 10 ml n-Butanol, đến khi lớp n-Butanol không màu…cân cốc thủy tinh, tập trung dịch chiết

Cô cách thủy dịch n-Butanol được saponin toàn phần

c Cách tính kết quả:

Hàm lượng saponin toàn phần (A%) được tính theo công thức:

A(%) =

Với: As: khối lượng saponin (g)

An: khối lượng bột rau má (g)

H: độ ẩm bột rau má (%)

III Câu hỏi

1 Các chỉ tiêu kiểm nghiệm dược liệu khô: trạng thái, độ ẩm, độ mịn, độ đồng đều về khối lượng, độ đồng dề về hàm lượng, định tính dựa trên phản ứng tạo màu, kết tủa đặt trưng, định lượng dựa trên các kĩ thuật có độ chính xác cao

2 Phương trình phản ứng định tính bằng phương pháp hóa học các nhóm chức chính trong dược liệu:

- Tinh dầu: đun bốc hơi đến cắn  Có mùi thơm

- Acid béo: Nhỏ dung dịch lên giấy  vết trong mờ

- Carotenoid: Dùng H2SO4 đậm đặc  Màu xanh dương đậm

- Saponin triterpenoid: phản ứng Liebermann – Burchard  vòng ngăn cách màu

đỏ nâu, lớp dung dịch trên có màu xanh lục

- Alkaloid: thuốc thử Dragendorff (KBiI4)  Tủa đỏ cam

R3N + KBiI4  R3NHBiI4

- Tanin: Dung dịch FeCl3 Màu xanh rêu

OH R

+ Fe3+

O

O R

R

O

O

Fe

-OH

OH

- Flavonoid: Mg/HCl đậm đặc  Màu hồng tới đỏ

- Saponin: Lắc mạnh  Tạo bọt bền

- Acid hữu cơ: Na2CO3  Sủi bọt khí

RCOOH + Na2CO3  RCOONa + CO2 + H2O

3 Giai đoạn gây sai số nhiều nhất cho kết quả phân tích:

Giai đoạn có thể gây sai số nhiều nhất đó là giai đoạn định lượng saponin và quá trình tách chiết cũng gây sai số: Tách mẫu với methanol chưa hết, chiết với eter dầu hỏa khó mà lấy chính lượng khi 2 lớp tách nhau và chiết với N-Butanol bão hòa cũng vậy

có thể Butanol chưa bão hòa hết nên làm cho phần thủy dịch butanol bay ra trước mẫu là cho mẫu không ổn định cũng gây ra sai số

BÀI 3 ĐỊNH LƯỢNG PARACETAMOL BẰNG PHUONG PHÁP

SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

I Giới thiệu

Paracetamol là một thuốc có tác dụng hạ sốt và giảm đau Công thức pha chế các thuốc

có paracetamol ngoài thành phần chính là paracetamol các cơ sở sản xuất thường cho thêm tá dược Polysorbat, chất bảo quản và chất màu

Tiến hành định lượng trong thuốc có đầy đủ các thành phần trên bằng phương pháp quang phổ tử ngoại-khả kiến thông thường sẽ cho kết quả không chính xác do ảnh hưởng của các tá dược

Để khắc phục nhược điểm trên người ta áp dụng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao(HPLC) để định lượng paracetamol

II Phân tích bằng HPLC

1 Chuẩn bị dung dịch thử, mẩu thử

Pha động: Nước: methanol (80:20)

Dung dịch chuẩn: cân khoảng 25 mg paracetamol chuẩn vào bình định mức 50 ml thêm

4 ml methanol lắc cho tan hoàn toàn rồi thêm nước đến vạch định mức

Dung dịch mẫu thử:

Cân 1 viên, tính khối lượng trung bình viên nghiền thành bột , cân chính xác một lượng bột viên tương ứng khoảng 100 mg paracetamol cho vào bình định mức 50 ml, thêm 7.5 ml methanol, lắc cho bột tan hoàn toàn , pha loãng với pha động đến vạch định mức, lắc đều

3 Tiến hành phân tích:

Máy HPLC themo

Máy HPLC L 4000 detector UV

Máy HPLC L 6000 Pump

Cột: Lichrosorb Rp 18 ( 4.6 mm x 15 mm; 5µm)

Detector UV: 280nm

Tốc độ dòng : 1ml/phút

Thể tích bơm: 20µl

Cho máy chạy ổn định và tiến hành bơm dung dịch nền( pha động) kiểm tra sắc đồ của nền

Bơm các dung dịch chuẩn sau đó là các dung dịch mẩu Paracetamol

4 Tính toán kết quả

So sánh thời gian lưu để định tính các thành phần trong mẩu

Xác định diện tích peak của từng thành phần để từ đó tính toán nồng độ của các chất trong mẫu

IV Báo cáo kết quả

Thời gian lưu của Paracetamol:khoảng 1.2

Ta đã đo số liệu theo bảng dưới đây(đã trừ nền)

Mẫu trắng

Mẫu chuẩn 1

Mẫu chuẩn

2

Mẫu chuẩn

3

Mẫu phân tích

Diện tích peak 0 3009844 3946304 21349018 23457570

Ta có phương trình : y=455663x - 2156544

Y= 23457570 => x=56.2(ppm)

Nồng độ paracetamol trong mẫu = 56,2 ppm

Tính lại phần trăm Paracetamol: % =

90, 6%

V.Câu hỏi

1 Vẽ sơ đồ hệ thống sắc kí lỏng cao áp:

2 Vài cách chuẩn bị mẫu thực phẩm,dược phẩm, dược liệu, môi trường:

Mẫu thực phẩm: Lấy mẫu,nghiền nhỏ, đối với những chất hữu cơ cần phân tích thì ta có

thể chưng cất lôi cuốn hơi nước, chiết soxlet, chiết bằng SPE…rồi đem đi phân tích

Mẫu môi trường:

Đối với mẫu khí:Thu khí ở hiện trường bằng thiết bị hấp thụ, sau đó tùy từng loại chất

cần phân tích mà ta tiến hành xử lí như tạo phức bằng thuốc thử thích hợp…sau đó đem đi phân tích

Đối với mẫu nước thải, rác thải: lấy mẫu, làm sạch tạp chất,phá mẫu bằng hóa chất

thích hợp hoặc chiết lấy chất phân tích bằng phương pháp thích hợp như chiết lỏng- lỏng, lỏng rắn, chiết bằng SPE, sau đó tùy theo từng loại chất mà ta có thể tạo phức và tiến hành phân tích

Mẫu dược phẩm ,dược liệu: đối với mẫu rắn thì ta lấy mẫu, nghiền, rồi hòa tan bằng

dung môi thích hợp,mẫu lỏng thì ta có thể hòa tan trực tiếp bằng dung môi, tùy chất phân tích

mà ta có thể tiến hành tạo phức bằng thuốc thử thích hợp rồi tiến hành phân tích

3 Sắc kí lỏng hiệu năng cao trên gel thường dung để phân tích: lipid, polymer, protein, PAHs…

4 Khi phân tích các hỗn hợp thuốc khác của Paracetamol :cần chú ý đến các thành phần

có trong thuốc như : tá dược, chất bảo quản, chất màu, vì các thành phần này có thể sẽ ảnh hưởng đến tín hiệu peak , có thể gây ra hiện tượng nhiều hoặc chồng phổ làm ảnh hưởng đến kết quả phân tích

Bài 5 XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN TINH DẦU TRÀM BẰNG SẮC KÝ

KHÍ GHÉP KHỐI PHỔ

I Giới thiệu

Sắc ký ghép khối phổ là 1 phương pháp hiệu quả nhất hiện nay để tách và xác định các hợp chất bay hơi ( hay được làm cho bay hơi) nhất là các loại tinh dầu qua một cột sắc ký

Trong phương pháp này, các hỗn hợp đa thành phần của tinh dầu được tách ra trên cột mao quản có độ phân giải cao rồi được định tính và định lượng nhờ việc phân tích cấu trúc có so sánh với thư viện phổ Các máy sắc ký ghép khối phổ hiện đại thường có sẵn thư viện phổ có thể so sánh và đánh giá trực tiếp các kết quả

Sắc ký ghép khối phổ có độ chính xác cao và được ứng dụng nhiều trong việc phân tích, kiểm tra an toàn thực phẩm, đánh giá chất lượng môi trường, dược liệu, thực phẩm…

II Tiến hành thí nghiệm

1 Chuẩn bị cột

- Mở máy, đặt các thông số cho máy để ổn định và làm sạch cột trước khi tiến hành phân tích 30 phút

- Đặt chương trình chạy:

+ Nhiệt độ Injector: 300°C

+ Nhiệt độ cột: 250°C

+ Nhiệt độ Detector: 250°C

+ Khí mang: Khí heli

+ Tốc độ dòng: 50ml/phút

2 Chuẩn bị dd mẫu thử

Tinh dầu tràm được thu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước sau khi cô đặc sau đó làm khan với Na2SO4

- Mẫu đo: 1 μL tinh dầu+ 1ml aceton Lắt đều

- Mẫu chuẩn: 1μL dd chuẩn Eucalypton 98% (dược Hậu Giang) + 1ml aceton Lắt đều

3 Cài đặt chương trình cho máy