CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HIỆN đại

BÀI 1:TRÍCH LY DẦU HẠT THỰC VẬT BẰNG THIẾT BỊ SOXTECA.TỔNG QUAN1.Giới thiệu chungHệ ly trích SoxtecTM Avanti 2055 – Thế hệ mới của hệ ly trích bằng dung môi thủ công để xác định an toàn các chất hòa tan trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, đất, polymers, vải, giấy, bột giấy, … Chức năng thời trình được tách riêng cho từng bước ly trích làm cho việc lập trình và qui trình có khả năng lập lại một cách thuận lợi: chỉ cần một thao tác để di chuyển tất cả các mẫu cùng một lúc; có công cụ để phân tích đồng thời nhiều mẫu, làm tăng hiệu suất phòng thí nghiệm; dung môi được thêm vào trong một hệ thống kép kín nên hạn chế việc phơi nhiễm đối với người điều khiển máy; thể tích thimble lớn 65 ml; được công nhận chính thức bởi các tổ chức quốc tế như AOAC 991.36 (thịt), SCANCM 49:93 (giấybột giấy), Phương pháp EPA 3541 (PAH trong đất)Đây cũng là hệ thống trích ly hiệu quả cho quá trình trích ly chất béo trong thực phẩm. Do đó, việc vận dụng hệ thống trích ly này đối với việc trích ly thực phẩm là vô cùng cần thiết.2.Hóa chấtHenxanMẫu hạt thực vật: đậu phộng.Ống nghiệm3.Thiết bị•Hệ ly trích SoxtecTM Avanti 2055Hệ SoxtecTM Avanti 2055 là thế hệ mới của hệ ly trích Soxhlet bằng thủ công. Hệ thống được thiết kế nhằm tạo thuận lợi cho người sử dụng thông qua việc xử lý 6 mẫu một lần, cho phép giảm tối đa các thao tác trên hệ thống.Hệ thống tự động Soxtec 2055 bao gồm:

TT TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHIỆP TPHCM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM - - BÁO CÁO THỰC HÀNH CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HIỆN ĐẠI GVHD: Nguyễn Thị Ngần NHÓM : 1-SÁNG THỨ LỚP: DHTP11D 1.Huỳnh Lâm Kim Khánh 2.Lê Hoàng Phúc 3.Nguyễn Văn Vủ 4.Nguyễn Thị Hồng Nguyên 5.Nguyễn Thị Lịch 6.Dương Thị Bảo Ngọc 7.Trần Thùy Linh TP HCM, tháng 11, năm 2018 BẢNG PHÂN CÔNG HỌ VÀ TÊN Huỳnh Lâm Kim Khánh Lê Hoàng Phúc MSSV 15038201 15041791 NHIỆM VỤ Tổng hợp word Bài 1: Trích ly dầu hạt thực vật Nguyễn Văn Vủ 15078011 Nguyễn Thị Hồng Nguyên 15040891 Nguyễn Thị Lịch Dương Thị Bảo Ngọc 15092391 15044891 Trần Thùy Linh 15043651 thiết bị Soxlet Thuyết trình powerpoint Bài 2: Sử dụng sắc ký bảng mổng (TLC) xác định thành phần chất màu rau củ Bài 3: Phân lập hợp chất màu từ rau củ phương pháp sắc ký cột Bài 4: Phương pháp chuẩn độ điện Bài 5: Trích ly caffeine phương pháp chiết pha rắn (SPE) Powerpoint 4:Phương pháp chuẩn độ điện MỤC LỤC BÀI 1: TRÍCH LY DẦU HẠT THỰC VẬT BẰNG THIẾT BỊ SOXTEC A TỔNG QUAN Giới thiệu chung Hệ ly trích SoxtecTM Avanti 2055 – Thế hệ hệ ly trích dung mơi thủ cơng để xác định an tồn chất hòa tan thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, đất, polymers, vải, giấy, bột giấy, … Chức thời trình tách riêng cho bước ly trích làm cho việc lập trình qui trình có khả lập lại cách thuận lợi: cần thao tác để di chuyển tất mẫu lúc; có cơng cụ để phân tích đồng thời nhiều mẫu, làm tăng hiệu suất phòng thí nghiệm; dung mơi thêm vào hệ thống kép kín nên hạn chế việc phơi nhiễm người điều khiển máy; thể tích thimble lớn 65 ml; cơng nhận thức tổ chức quốc tế AOAC 991.36 (thịt), SCAN-CM 49:93 (giấy/bột giấy), Phương pháp EPA 3541 (PAH đất) Đây hệ thống trích ly hiệu cho q trình trích ly chất béo thực phẩm Do đó, việc vận dụng hệ thống trích ly việc trích ly thực phẩm vơ cần thiết Hóa chất - Henxan - Mẫu hạt thực vật: đậu phộng - Ống nghiệm Thiết bị • Hệ ly trích SoxtecTM Avanti 2055 Hệ SoxtecTM Avanti 2055 hệ hệ ly trích Soxhlet thủ công Hệ thống thiết kế nhằm tạo thuận lợi cho người sử dụng thông qua việc xử lý mẫu lần, cho phép giảm tối đa thao tác hệ thống Hệ thống tự động Soxtec 2055 bao gồm: Bộ phận chiết Bộ phận điều khiển Bộ phận xử lý Ống đỡ Thimble (7 bộ) Giá cầm tay giữ thimble Các thimble (25 bộ) Bộ tiếp hợp thimble (bộ 6) 13 14 15 16 17 18 19 Khay đựng cốc Các cốc chiết ( bộ) Ống nước ống bổ sung dung mơi Cáp nguồn Cáp mở rộng 15 pin (D-sub) Tấm gắn cho phận xử lý 10 11 12 Dụng cụ cầm thimble Dụng cụ lấy cốc Giá đựng thimble kim loại Ống nước làm mát Giá đựng cốc • 20 21 22 23 24 Vòng kim loại Ống Cáp Hướng dẫn sử dụng Ống dẫn khí Thơng số kỹ thuật - Hệ thống bao gồm: Bộ phận ly trích, Bộ phận điều khiển - Thể tích thimble tối đa: Approx 65 ml (33 x 80 mm) - Tổng thể tích dung mơi: 70-90 ml trích ly (m2) Cân cốc - Số lượng mẫu: mẫu/lần 36 mẫu/ngày - Tốc độ trích: từ 40 đến 60 phút tùy loại áp dụng - Khoảng đo: từ 0.1 đến 100% béo Lắp giá đỡ vào ống lọc - Độ lặp lại: ± 1% thấp (5-100%) o - Thời gian gia nhiệt từ 20 C đến 280oC: 7-9 phút (với điện 230V) B CÁCH TIẾN HÀNH Lắp vào thiết bị Nguyên tắc chung Tinh dầu từ hạt điều trích ly dung môi hexan với kỹ thuật chiết Soxtec Hàm lượng tinh dầu tính từ lượng cân sau sấy đến khối lượng không đổi Cho 15ml hexan vào ống thimble Chuẩn bị mẫu Mẫu hạt thực vật Vận hành máy Lấy ống chiết Xay nhuyễn SấyCân 1050C 30 phút 5gram (m1) - Mẫu hạt thực vật (đậu phộng, hạt điều ) cần xác định hàm lượng lipid xay nhuyển trước tiến hành Cân khoảng gam mẫu cho vào thimble dùng cho q trình trích ly ChoLàm vào thimble - Dung mơi sử dụng q trình trích ly nguội hexan (15 ml) tổng dung môi cần sử dụng 90ml Quá trình chiết Đem cân (m3) Khối 4lượng dầu Sau cho mẫu xay vào thimble thimble gắn vòng sắt vào đầu đặt vào ống đỡ để giữ cân Sau ta tiến hành cân cốc trích ly đánh dấu từ đến (m2) Mở van nước cho hệ thống nước mát chạy tuần hoàn máy, sau gạt hai tay điều khiển lên mức cao Lắp ống đỡ vào giá giữ lắp vào máy Gạt tay điều khiển xuống mức thấp nhất, gạt lên lại vị trí đầu, lấy giá giữ Lấy cốc trích ly vào giá giữ cốc gắn vào máy Gạt hai tay điều khiển xuống mức thấp nhất, đóng kính lại bơm dung môi vào máy ống ta bom 15 ml hexan tổng dung môi cần sử dụng 90ml hexan Mở cơng tắc nguồn mở khóa ta cài đặt thơng số tối đa dung môi hexan 210oC sau gặt xuống khóa lại Tiếp tục ta chỉnh thông số sau thời gian đun sôi (20 phút), thời gian trích lý (40 phút), thời gian thu hồi (10 phút), thời gian làm khô (5 phút) Sau cài đặt xong ta bấm nút Start để tiến hành vận hành máy Khi nhiệt độ máy lên đến nhiệt độ cần điểu chỉnh, ta nhấn nút có biểu tượng hình đồng hồ để thay đổi chế độ thông số Sau kết thúc ta tiến hành thu cốc trích ly đem sấy 105 0C 30 phút sau làm nguột bình hút ẩm Khi cốc nguội ta tiến hành cân xác định m 3, tính tốn tìm khối lượng dầu phần trăm dầu có mẫu ban đầu - - - - - -  Khi tiến hành trình tách chiết ta cần có lưu ý sau đây: Cần gắn thật cố định vòng sắt vào thimble, khơng phép để hở gắn bị méo Vì trình tách chiết dầu thao tác máy thimble bị rơi xuống gắn khơng chặt ảnh hưởng đến q trình trích củng sấy làm nguội Làm cho mẫu khơng tính xác, làm lại mẫu Lưu ý đến nhiệt độ lúc vận hành Cần ý đến nhiệt độ máy nhiệt độ bắt đầu trích dầu Khi nhiệt độ máy sau nhấn nút Start phải lên đến 160 0C nhiệt độ bắt đầu trích lúc ta nhấn nút có biểu tượng đồng hồ để chuyển chế độ khác theo theo số Ta gạt cần bên theo chế độ máy theo hình in thiết bị Tránh trường hợp máy chế độ gạt cần chế độ khác Ví dụ máy chế độ trích béo cần bên trái lúc đầu mức phải gạt lên nắt để theo chế độ máy hiệu suất trích béo đạt u cầu cao nhất, làm khơng gạt lên nứt khơng thể thực q trình trích béo Ta phải ln phải mở nước bắt đầu trích, máy có dòng nước để tuần hồn Khi ta tiến hành trích béo xong ta cần phải thu hồi lượng dung mơi lưu trữ máy Dung môi đươc lưu trữ góc cuối phía phải máy, lưu ý phải dung mơi nguội thu hồi nóng q trình trích béo Thiết bị sấy phòng F06.08 ta cần phải mở trước 30 phút trước sấy nhiệt độ thiết bị sấy lên 1050C, tiết kiệm thời gian thực Các cốc trích ly cần phải làm nguội bình hút ẩm tránh làm nguội bên ngồi Vì tốn thời gian làm nguội bên ngồi dầu bị oxy hóa để tiếp xúc với oxi nhiệt độ cao dễ xảy phản ứng oxy hóa dầu Cốc trích ly sau làm nguội ta cần phải giấy tiến hành lau xung quanh cốc điều chỉnh lại cân cho trọn tâm làm vệ sinh cân trước cân Nếu làm gây sai số đến kết C KẾT QUẢ Kết Sau ta tiến hành trích béo mẫu đậu phộng ta thu kết sau đây: STT m1-gr 5.03 4.97 5.03 5.14 4.95 4.97 Trong đó: m2-gr 44.28 44.36 44.23 44.18 44.16 44.25 m3-gr 44.52 44.44 45.04 44.32 45.3 45.05 Dầu-gr 0.24 0.08 0.81 0.14 1.14 0.79 % dầu/mẫu 4.77 1.6 16 2.73 23.03 15.89 m1: khối lượng mẫu ban đầu (gram) m2: khối lượng cốc trích ly (gram) m3: khối lượng cốc dầu (gram) Cơng thức tính phần trăm dầu mẫu ban đầu sau: X=( (%) Kết luận Nhìn cách tổng thể % dầu/mẫu mẫu từ đến khơng có đồng với nhau, có chênh lệch lớn mẫu cho dù làm chung điều kiện định Vì có số lý mà dẫn đến kết vậy, gồm có: • Do nhóm thực chưa có kinh nghiệm thực hành thiết bị Soxtec này, nên trình thực bỡ ngỡ thao tác khơng nhanh nhẹn chuẩn xác Và phụ thuộc nhiều vào giảng viên hướng dẫn, khơng có kinh nghiệm xử lý vấn đề có trường hợp xấu xảy • Tìm hiểu tài liệu chưa kỹ, nên lượng dung môi sử dụng q trình khơng đủ để trích béo với lượng mẫu ban đầu sử dụng gần gram Nhưng thực tế khơng sử dụng gram dung mơi sử dụng có 15ml mẫu nên cần phải tính lại lượng mẫu cần sử dụng để hiệu suất trích tốt • Ngồi số thứ tự bom dung môi vào mẫu không đồng nhất, tức mẫu chưa bom bom lần dung mơi • Thao tác thực chậm chạp, vụng gắn vòng sắt vào thimble khơng khít nên q trình bị rơi xuống làm ảnh hưởng trực tiếp đến mẫu thực nghiệm Qua số lỗi mà nhóm mắc phải, nhóm rút kinh nghiệm cho thân ta thực thiết bị Soxtec nói riêng thiết bị khác nói chung Là cần phải cẩn thận xác, tỉ mỉ quan trọng xem kỹ tài liệu trước ta tiến hành thí nghiệm Phụ lục Sau số hình ảnh q trình thực trích béo thiết bị Soxtec: Hình Các thimble để đựng mẫu trình trích béo Hình Các cốc trích ly giá đỡ Hình Q trình trích béo thiết bị Soxtec Hình Bàn điều khiển thiết bị Soxtec Hình Thiết bị bom dung mơi thủ cơng Bài SỬ DỤNG SẮC KÝ BẢNG MỎNG (TLC) XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN CHẤT MÀU TRONG RAU CỦ A TỔNG QUAN Giới thiệu chung 10 Lưu ý: - Cốc phải trán mẫu để tránh nồng độ bị pha loãng trước lần đo Lúc lắp cốc vào phải ý cánh quạt tránh làm cánh quạt tiếp xúc với đày cốc làm gãy cánh gây hư hỏng thiết bị 38 Hình ảnh mẫu lắp vào vị trí load mẫu - - Đối với điện cực chuẩn độ phải rửa nước cất lau nhẹ nhàng khăn giấy khô trước cho vào mẫu tránh việc lau mạnh làm hỏng điện cực máy Trong trình chuẩn độ máy chuyển sang hình có đồ thị với trục tung pH đầu cuối mẫu, trục hồnh thể tích NaOH chuẩn độ Trong đồ thị trình chuẩn độ pH dung dịch tăng đến điểm tương đương kết thúc Tuy nhiên, dung dịch cốc chứa mẫu đầy mà máy tiếp tục chuẩn độ thao tác thực sai Ghi nhận kết quả: Kết máy ghi nhận tính tốn cho thơng số pH tích NaOH chuẩn độ thông qua điểm tương đương Lưu ý: - Tại điểm tương đương có đường thẳng qua điểm tương đương vng góc với trục tung tức trục thể thể tích NaOH tiêu tốn cho trình chuẩn độ Rửa điện cực thay dung mơi: Tương tự, sau chuẩn độ xong, tiến hành thay dung môi buret nước cất chọn nút lệnh Manual → chọn Burette → Rinse (rửa) xuất chọn → Cycle (số lần bơm dung môi) ta chọn bơm lần - Điện cực rửa kỹ nước cất lau khô khăn giấy nhúng dung dịch bảo quản điện cực Tắt máy rút dây nguồn J KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT Kết quả: Hoạt tính enzyme PE tính theo phương trình sau: PEU = , N/Phút Bảng kết đo: Mẫu VNaOH (ml) pH PEU (N/Phút) 2.520 5.711 5.04 1.428 9.060 2.856 39 2,715 8.867 5,43 2,365 8.347 4,73 Hình ảnh kết đo: Kết mẫu Kết mẫu 40 Kết mẫu Kết mẫu Nhận xét: Hoạt tính enzyme PE mẫu có chênh lệch cụ thể sau: Đối với lần 1: giá trị PEU 5.04 N/phút, pH tương đương 5.711 thể tích NaOH 0.1N dùng để chuẩn độ 2.520 ml • Đối với lần 2: giá trị PEU 2.856 N/phút, pH tương đương 9.060 thể tích NaOH 0.1N dùng để chuẩn độ 1.428 ml • 41 Đối với lần 3: giá trị PEU 5.43 N/phút, pH tương đương 8.867 thể tích NaOH 0.1N dùng để chuẩn độ 2.715 ml • Đối với lần 4: giá trị PEU 4.73 N/phút, pH tương đương 8.347 thể tích NaOH 0.1N dùng để chuẩn độ 2.365 ml • Dựa vào số liệu ta thấy lần 1,3 hoạt tính PEU khoảng khác biệt khơng lớn, ta chấp nhận (5.04 5.43), thể tích NaOH để chuẩn độ lần có kể Đối với lần có khác biệt q trình ủ 300C vòng 30 phút bể ổn nhiệt lượng nước bên cao làm cho mẫu không giữ thăng bị ngã tiếp xúc với lượng nước bể ổn nhiệt Do vấn đề thời gian mà nhóm khơng thể làm lại lần đó, nên kết diễn đạt gây sai số Và khoảng cách lần đo lần mẫu với rửa lau không khô cốc đựng mẫu, nước vành cốc nên làm pH thay đổi dẫn đến thể tích cần chuẩn độ củng thay đổi Việc nhóm khơng có pha NaOH 0.1N để tiến hành chuẩn mà sử dụng hóa chất trước đó, nên khơng thể đẩm bảo hóa chất nhóm sử dụng có vấn đề hay khơng, củng cố làm cho kết bị lệch BÀI 5: TRÍCH LY CAFEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾT PHA RẮN (SPE) A TỔNG QUAN Giới thiệu chung 1.1 Nguyên tắc chung Chiết pha rắn trình phân bố chất pha, lúc đầu chất mẫu dạng lỏng (pha nước, hay hữu cơ), chất chiết dạng rắn, dạng hạt nhỏ xốp đường kính 25 - 70 μm Vì nên có tên chiết pha rắn (Solid Phase Extraction ), hay chiết rắn-lỏng Chất chiết gọi pha tĩnh, nhồi vào cột chiết nhỏ, cột chiết kích thước: x cm, hay dung lượng chiết 100-600 mg, dạng đĩa chiết có kích thước dầy 1-2 mm đường kính 3-4 cm Chất chiết hạt Silica trung tính, hạt ơxit nhơm, hay Silicagen trung tính bị alkyl hố nhóm -OH nhóm mạch carbon thẳng -C2, -C4, -C8, -C18, , hay nhân phenyl Nó chế 42 tạo điều kiện giống pha tĩnh sắc ký HPLC, hạt có độ xốp lớn, với diện tích bề mặt xốp thường từ 50 - 300 m2/gam Khi xử lý mẫu, dung dịch chất mẫu dội lên cột chiết Lúc pha tĩnh tương tác với chất giữ nhóm chất phân tích lại cột (trên pha tĩnh), nhóm chất khác khỏi cột với dung mơi hồ tan mẫu Như thu nhóm chất cần phân tích pha tĩnh (chất chiết rắn) Sau dùng dung mơi thích hợp hồ tan tốt chất phân tích để rửa giải chúng khỏi pha tĩnh (cột chiết), thu dung dịch có chất phân tích để xác định chúng theo cách chọn 1.2 Các loại chất chiết pha rắn Theo đặc điểm chất chiết, chất chiết pha rắn chế tạo phân chia theo loại chất: - Loại hấp phụ pha thường Đó Silica trung tính ơxit nhơm, Hấp phụ pha ngược Đó Silica thường alkyl hố nhóm-OH, Loại chất trao đổi iôn (để tách Cation Anion), Chất rây hay sàng lọc phân tử theo độ lớn, kích thước phân tử chất, Loại chất hấp phụ khí (purge and trap Extraction), để hấp thụ chất khí 1.3 Các kiểu chế chiết pha rắn Chính có nhiều loại chất chiết pha rắn, kỹ thuật chiết pha rắn có nhiều chế trình động học khác nhau, theo chất loại chất chiết (pha chiết) Nói chung, chất chiết pha rắn tương tự pha tĩnh sắc lý lỏng hiệu cao (HPLC) Nó dạng cột chiết (1x6 cm tích 4-6 mL) hay dạng đĩa chiết (dầy 1-2 mm đường kính 3-4 cm) Do chiết pha rắn có loại chế là: - Hấp phụ pha thường (loại NP), Hấp phụ pha ngược (loại RP), Trao đổi ion cặp ion chất dạng ion (loại IEx), Rây phân tử theo độ lớn chất phân tích (Gel) 1.4 Các điều kiện chiết pha rắn Quá trình chiết thực chất phân bố chất phân tích pha, pha rắn (chất chiết) pha lỏng (dung dịch chứa chất phân tích) khơng trộn lẫn vào điều kiện định, pH, dung môi, nhiệt độ, tốc độ chảy mẫu qua cột chiết Trong hệ số phân bố nhiệt động Kb chất phân 43 tích hai pha (rắn lỏng chứa mẫu) yếu tố định hiệu chiết Nó tương tự hệ sắc ký cột lỏng-rắn (của hệ HPLC) Vì muốn thực chiết pha rắn tốt phải có điều kiện sau đây: • Pha rắn hay chất chiết (dạng cột chiết hay đĩa chiết) phải có tính chất hấp thụ hay trao đổi chọn lọc với chất, hay nhóm chất phân tích định, tức tính chọn lọc pha tĩnh chiết • Các chất chiết dung môi rửa giải phải có độ cao theo yêu cầu cấp hàm lượng phân tích • Hệ số phân bố nhiệt động Kfb cân chiết phải lớn, để có hiệu suất chiết cao • Q trình chiết phải xẩy nhanh nhanh đạt cân bằng, khơng có tương tác phản ứng hoá học làm hay hỏng pha rắn chất phân tích • Q trình chiết phải có tính thuận nghịch, để rửa giải tốt chất phân tích khỏi pha chiết pha động phù hợp • Khơng làm nhiễm bẩn thêm chất phân tích q trình chiết từ nguồn • Sự chiết phải thực điều kiện định phù hợp, phải lặp lại tốt tất nhiên đơn giản dễ thực tốt 1.5 Ưu nhược điểm phạm vi áp dụng Chiết pha rắn kĩ thuật chiết đời, phát triển ứng dụng khoảng chục năm trở lại đây, nước tiên tiến vào Việt nam ta từ năm 1997 Hiện có số hãng sản xuất cung cấp thị trường nhiều loại chất chiết dụng cụ chiết khác cho nhiều đối tượng tiện dụng Chất chiết thường chất Silica hoạt hoá để chúng có khả hấp thụ cao chọn lọc chất theo nhóm Kỹ thuật chiết có ưu nhược điểm sau đây: • Có tính chọn lọc nhóm hợp chất phân tích, • Cân chiết nhanh đạt có tính thuận nghịch, 44 • Thích hợp cho mẫu lượng nhỏ phân tích lượng vết chất, • Thao tác đơn giản nhanh kỹ thuật chiết khác, • Trong q trình chiết ln ln có làm giầu chất phân tích, • Chất chiết pha rắn khơng đắt Chính mà sử dụng phổ biến phân tích, đặc biệt phân tích đối tượng mơi trường chất vi lượng độc hại 19 Hóa chất - Methanol 50% - Nước cất - Ethyl acetate - Bột cà phê 20 Thiết bị - Máy cô quay ( bếp điện để chưng cách thủy) - Bộ dụng cụ chiết pha rắn - Cột SPE C18 - Ống nghiệm - Cốc thủy tinh, Pipet 10 ml 21 Hệ thống chiết pha mẫu chất rắn chân không Model: 12 - Port Vacuum SPE Manifolds Hộp thủy tinh Nắp nhựa PP Đồng hồ đo chân không Van Giá đựng mẫu Van điều khiển bơm chân không Cột sắc ký Ống nối Ống nối cấp dung môi 45 + SPE column = cột SPE + Frit = cát + Soild phase = pha rắn + Luer fitting, female = ống nối luer ( đực cái) + Lid of vacuum manifold with bore = nắp ống hút chân không + Stainless steel needle = kim thép không rỉ Hệ thống chiết pha rắn chân không K CÁCH TIẾN HÀNH: Nguyên tắc chung Trong kỹ thuật SPE điều kiện động, vật liệu pha rắn nạp trước vào cột (cartridge) cố định ngăn polyetylen xốp Có vật liệu SPE cố định mạng lưới polytetrafluoroethylene (PTFE) ép thành khối dạng dĩa Kỹ thuật SPE điều kiện động gồm bước mơ tả hình 1.1 - Bước 1: Chuyển dạng chất hấp thụ pha rắn (conditioning) Đầu tiên, vật liệu hấp thụ chuyển từ dạng ban đầu (của hãng sản xuất) sang dạng thích hợp cho q trình hấp thụ (dạng H+ OH-) cách cho dung mơi chạy qua làm ướt vật liệu, solvat hóa nhóm chức chất hấp thụ đuổi khơng khí, lấp đầy khoảng trống dung mơi Sau đó, cột làm ướt dung dịch đệm nước cất để có hiệu hấp thụ tốt mẫu 46 dung dịch nước (chất hấp thụ phải ngâm dung môi) Trong thực tế, để khơ cột khả hấp thụ xảy khơng hồn tồn độ thu hồi chất phân tích giảm, phải tiến hành q trình chuẩn bị cột (pha tĩnh) lại từ đầu Trong trình chuyển dạng, cần thiết nên có thêm bước làm cột để loại bỏ tạp chất - Bước 2: Q trình hấp thụ chất phân tích (sample application) Dung dịch mẫu chứa chất phân tích cho qua cột với tốc độ thích hợp Chất phân tích giữ lại cột chất khác dung mơi khỏi cột Cũng có trường hợp chất gây cản trở bị giữ lại cột, chất phân tích khỏi cột với dung mơi Sau chất phân tích thu hồi xác định phương pháp phân tích cơng cụ thích hợp chọn Ở bước này, điều quan trọng chế lưu giữ chất phân tích chất hấp thụ cho mẫu chảy qua cột Các chế trình lưu giữ bao gồm tương tác Van der Wall, tương tác lưỡng cực - lưỡng cực, liên kết hydro, trao đổi cation, trao đổi anion, tạo phức vòng càng,… Q trình hấp thụ giữ lại số thành phần khác cột với chất phân tích - Bước 3: Rửa cột (washing) Đây bước loại bỏ chất gây ảnh hưởng mẫu khỏi cột giữ lại chất phân tích Nếu mẫu dung dịch nước, cần phải sử dụng dung dịch đệm dung môi hữu Nếu mẫu hòa tan dung mơi hữu rửa cột dùng dung mơi - Bước 4: Rửa giải (elution) Đây bước cuối để thu hồi chất phân tích Dung môi chọn phải phá vỡ dễ dàng tương tác chất phân tích chất hấp thụ Thể tích dung mơi sử dụng rửa giải tốt phải đảm bảo rửa chất phân tích khỏi vật liệu hấp thụ, ưu điểm kỹ thuật SPE so với kỹ thuật LLE Kĩ thuật chiết pha rắn ( SPE ) điều kiện động 47 22 Chuẩn bị mẫu Mẫu cafe Cân 0.1g 10ml nước cất Hòa tan Đánh siêu âm 30ph Lọc Dịch lọc Thuyết minh quy trình Mẫu nguyên liệu (bột cà phê, cà phê hòa tan thương mại…) có chứa caffeine đem cân khối lượng xác ~ 0.1g cốc thủy tinh 50mL Dùng pipet cho 10 ml nước cất vào cốc 50ml hòa tan mẫu đo Đánh siêu âm 30 phút để cafein mẫu hòa tan vào nước Lọc hỗn hợp thu nhiều lần qua bơng gòn để loại bỏ cặn, sau lọc qua đầu lọc 0.45µm Dung dịch lọc thu bào quản điều kiện nhiệt độ phòng để sử dụng cho thí nghiệm 48 Mẫu cafein Đánh siêu âm mẫu Cột C18 6ml Methanol 50% Hoạt hóa cột Hấp thu chất phân tích 1ml Mẫu Rửa cột Rửa giải Lọc cặn Dịch chiết 23 Quá trình tiến hành Đun cách thủy Sấy 49 Cafein thơ 10ml ethy acetate Thuyết minh quy trình - Hoạt hóa cột: Cho ml dung dịch methanol 50% chạy qua thật chậm làm ướt vật liệu, solvat hóa nhóm chức chất hấp thụ đuổi khơng khí, lấp đầy khoảng trống Tiếp tục cho 3mL nước qua cột; tiếp tục giữ cho chất hấp phụ ngập dung mơi • Lưu ý: Ln đảm bảo chất hấp phụ cột SPE ngập dung mơi 50 - - Hấp thu chất phân tích: Cho vào 1.00mL (micro-pipette) mẫu thí nghiệm vào cột SPE hoạt hóa mở bơm hút chân khơng Giữ lại dịch lọc • Lưu ý: Ln đảm bảo cột ngập dung môi Rửa cột: Tiếp tục cho dịch lọc vào lại cột SPE tiến hành chiết tách Lập lại trình lần Để hấp thu hết cafein có dịch Lần cuối tiến hành rút tất chất lỏng khỏi cột SPE khơng khí qua cột 3-5 - phút chất hấp thụ khô Rửa giải: Cho 10 mL ethyl acetate vào cột SPE, hút chân không thật chậm, thu mẫu rửa giải vào ống nghiệm khô Dung môi rửa giải dịch chiết thu sau rửa giải - Đun cách thủy: Chuyển dịch chiết thu vào cốc sấy khô cân khối - lượng m1 Đun cách thủy tủ hút đến vừa khô Sấy: Cho cốc sau đuổi dung môi vào sấy 105 0C 30 phút Sau đem cân khối lượng cafein thu m2 L KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT Kết m0 m1 0,1048 47,2787 Phần trăm cafein có mẫu là: 51 m2 47,2800 % cafein = = × 100 = 1,24 24 Nhận xét Hàm lượng cafein thơ thu sau q trình chiết pha rắn ( SPE ) 1,24% Có thể trình lọc loại bảo cặn nhiều lần làm hao hụt lượng cafein có mẫu 52 ... rau củ Bài 3: Phân lập hợp chất màu từ rau củ phương pháp sắc ký cột Bài 4: Phương pháp chuẩn độ điện Bài 5: Trích ly caffeine phương pháp chiết pha rắn (SPE) Powerpoint 4 :Phương pháp chuẩn độ... tả so sánh thành phần mẫu khác Các hợp chất màu rau quả, hoa phân tách xác định cách sử dụng sắc ký lớp mỏng (TLC) Các sắc tố xanh, gọi chất diệp lục, đóng vai trò phân tử hấp thụ ánh sáng Carotenoid,... Với chất cần phân tích có màu, q trình giải ly sắc ký cột theo dõi mắt thường 29 - Tuy nhiên, phần lớn hợp chất thiên nhiên không màu hứng hủ bi tích đánh số thứ tự kiểm tra phương pháp sắc ký