Phương pháp Thử nghiệm Vi Sinh

Định nghĩa kháng sinh (antibiotics) THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT Định nghĩa kháng sinh (antibiotics) Kháng sinh (Antibiotics) chất có nguồn gốc tự nhiên, bán tổng hợp tổng hợp có khả ức chế tăng trưởng vi sinh vật không gây độc người động vật Lịch sử tiến hóa độc lập vi khuẩn (prokaryotic) tế bào chủ (eukaryotic) dẫn đến khác biệt có ý nghĩa tổ chức tế bào, đường sinh hóa, cấu trúc ADN nhân Sự khác có ý nghĩa cho chọn lọc thuốc Những điểm chọn lọc kháng sinh Mục tiêu tác động (target) kháng sinh diện vi khuẩn không diện tế bào chủ (người) Mục tiêu tác động (target) vi khuẩn khác với mục tiêu đồng dạng tế bào chủ (chân hạch) Hiểu biết gen có vai trò giúp xác định target cho kháng sinh chọn lọc Sự chọn lọc kháng sinh ‘không tự nhiên’ Antibiotics: bacteriostatic bactericidal Kháng sinh tự nhiên vi khuẩn nấm cạnh tranh với vi sinh vật khác Sự chọn lọc đặc điểm tự nhiên kháng sinh Phần lớn thuốc sử dụng kháng sinh chọn lọc ngẫu nhiên Bacteriostatic drugs: vi khuẩn bất hoạt (ngủ yên) không giết chết vi khuẩn Nhiều kháng sinh có hiệu ức chế tăng trưởng phổ rộng vi sinh vật Kháng sinh phát triển thành thuốc chọn lọc thông qua biến đổi cấu trúc hóa học Phần lớn tế bào tăng trưởng sau loại bỏ kháng sinh (chloramphenicol) Bactericidal drugs: giết chết vi khuẩn (ciprofloxacin) Antibiotics: bacteriostatic bactericidal 2000 2003 linezolid daptomycin 1962 1958 1949 1952 Không khám phá thuốc macrolides glycopeptides streptogramins lincosamides 1947 1942 -lactams aminoglycosides tetracycline 1920 Kỷ nguyên vàng khám phá kháng sinh sulfonamides Kháng sinh hoạt động dạng bactericidal ưa chuộng hơn, đặc biệt bệnh nhân khả miễn dịch Hoạt động kháng sinh hai dạng khác tác nhân gây bệnh phụ thuộc nồng độ thuốc Các giai đoạn phát triển kháng sinh Sự kháng thuốc tăng Sự kháng kháng sinh kết chọn lọc theo Darwin Hai chế làm cho vi khuẩn trở nên kháng với kháng sinh Sự đột biến gen bình thường thành gên kháng Thu nhận gen kháng từ môi trường Vi khuẩn nhạy cảm Sự đột biến bên gen vi khuẩn Vi khuẩn kháng Sự lan truyền dọc (đến hệ cháu) Thu nhận gen kháng (từ vector chuyển gen) Beta-lactams Glycopeptides Bacitracin  Sự cải biến thuốc (enzyme biến đổi aminoglycoside)  Sự cải biến mục tiêu thuốc (Erm methylases, target site mutations)  Giảm nồng độ thuốc bên tế bào: protein vận chuyển chuyên biệt thuốc (drug-specific transporters, mefA), giảm khả hấp thu thuốc (reduced drug uptake (mutations in porins)) Vi khuẩn kháng Sự lan truyền ngang (trao đổi gen) Sự lan truyền dọc (đến hệ cháu) Số lượng target sử dụng lâm sàng kháng sinh giới hạn Sự tổng hợp vỏ tế bào Ba chế kháng thuốc vi khuẩn: Tổng hợp protein Aminoglycosides Oxazolidinones Tetracyclines Macrolides Chloramphenicol Lincosamides Streptogramins DNA Gyrase RNA Polymerase Fluoroquinolones Rifampicin Vỏ tế bào vi khuẩn target kháng sinh Sulfonamides Phần lớn tế bào vi khuẩn có vỏ tế bào bảo vệ tế bào tránh thay đổi áp suất thẩm thấu Sự diện vỏ tế bào vi khuẩn quan trọng cho sống sót tế bào Tính tồn vẹn màng Cấu trúc thành phần vỏ tế bào vi khuẩn khác với tế bào chân hạch Chính vậy, enzymes cần thiết cho tổng hợp vỏ tế bào cho tế bào vi khuẩn target hữu ích cho kháng sinh Tổng hợp folate Cationic peptides Lipopeptides Dựa vào cấu trúc vỏ tế bào, tất tế bào vi khuẩn chia thành vi khuẩn Gram âm Gram dương theo phương pháp nhuộm Christian Gram năm 1884 Vỏ tế bào vi khuẩn Gram-dương dày Vỏ tế bào vi khuẩn Gram âm mỏng có cấu trúc tinh vi Periplasmic space Bên màng nguyên sinh vỏ tế bào vi khuẩn Gram dương lớp vỏ dày peptidoglycan Ở vi khuẩn Gram dương, peptidoglycan chiếm từ 50% đến 90% trọng lượng vỏ tế bào Peptidoglycan dày từ 20-80 nm Thành phần peptidoglycan Vỏ tế bào vi khuẩn Gram âm lớp dày peptidoglycan nằm bên màng tế bào Khoảng màng lớp peptidoglycan khoảng periplasmic Thành phần peptidoglycan Đuôi peptide nhô khỏi sợi polysaccharide liên kết chéo với sợi polysaccharide khác Nên vỏ tế bào vững NAG glycan NAM tetrapeptide pentaglycine bridge Peptidoglycan gồm sợi polysaccharide liên kết “cầu nối” peptide 35% đến 50% peptide gắn với sợi polysaccharide liên kết chéo Sự tổng hợp peptidoglycan Sự tổng hợp peptidoglycan N-acetyl glucosamin N-acetyl muramic acid transpeptidase (10) Tiền chất (monomers) sợi peptidoglycan, disaccharidepentapeptides, tổng hợp dịch bào, vận chuyển ngang màng tế bào, gắn lên sợi peptidoglycan tăng trưởng (9) pentaglycin pentapeptide periplasmic space p p p p membrane (8) phospholipid p cytoplasm p p p p p p (5) (7) (6) UDP UDP GlcNAc D-Ala-D-Ala racemase synthetase L-Ala D-Ala (4) UDP L-Lys D-Glu UDP UDP L-Ala UDP MurNAc (3) (2) (1) Sự tổng hợp peptidoglycan Transpeptidase D-Ala D-Ala D-Ala TPase TPase TPase Liên kết chéo sợi glycan thành lập xúc tác enzyme transpeptidase (TPase) Trong phản ứng này, TPase thủy phân liên kết peptide hai đầu tận gốc D-Ala thành lập liên kết cộng hóa trị tạm thời với sợi peptide Chất trung gian tạm thời sau chuyển đổi liên kết peptide thành lập Phản ứng thành lập liên kết cộng hóa trị trung gian target kháng sinh -lactam Penicillin A Fleming khám phá năm 1929 Penicillin Howard Florey Alexander Fleming Photo: L Segovia Ernst Chain Sự phát triển phương pháp nuôi Penicillium notatum tinh penicillin Florey Chain → thuốc Các khám phá sau • Ernest Duchesne (1896), • Alexander Fleming (1928) – Quan sát hoạt động penicillin dĩa bị nhiễm – Nhưng khơng nghiên cứu tiếp tục • • Penicillium mold kills S.aureus Hiệu chứng minh Florey, Chain, Heatley (1939) Fleming, Florey Chain nhận giải Nobel Prize 1945 Đặc điểm kháng sinh • Độc tính có chọn lọc • Selman Waksman (1944): Streptomycin, kháng sinh điều trị lao phổi (Giải Nobel năm 1952) • Năm 1953 chloramphenicol, terramycin, neomycin, tetracycline phân lập (Paul Ehrlich) – Khả thuốc giết ức chế tác nhân gây bệnh, ảnh hưởng mức tối thiểu tới tế bào chủ Đặc điểm kháng sinh tốt: • Liều điều trị (Therapeutic dose) – Liều thuốc cần cho điều trị lâm sàng: phải thấp • Liều gây độc (Toxic dose) – Liều thuốc gây độc cho bệnh nhân (như tạo tác dụng phụ): phải cao • Chỉ số điều trị (Therapeutic index) – Tỷ lệ liều điều trị/ liều gây độc: phải cao Xác định hoạt tính kháng khuẩn Xác định hoạt tính kháng khuẩn Một số lưu ý thực thử nghiệm • Đo nhạy dòng vi khuẩn với chất kháng sinh pH • Mức độ hiệu kháng sinh  pH phải kiểm tra chuẩn bị mơi trường • Xác định kháng kháng sinh vi khuẩn nuôi vi khuẩn  Môi trường bán đặc (agar) pH nên 7.2 đến 7.4 nhiệt độ phòng Độ ẩm  Nếu pH thấp, thuốc hiệu (ví dụ., aminoglycosides, quinolones, macrolides), số thuốc hoạt động mức (ví dụ tetracyclines)  Nếu pH q cao, có hiệu dương tính giả  Thường bề mặt môi trường (dĩa petri) độ ẩm cao, nên trước sử dụng cần làm khô bề mặt môi trường cách để dĩa vào tủ vô trùng  Bề mặt môi trường phải đủ ẩm, không xuất giọt nước bề mặt Mật độ chủng vi khuẩn Thời gian đặt khoanh kháng sinh  Nếu dĩa petri chủng dòng vi khuẩn thí nghiệm,  Thường kết quan sát kích cở vi khuẩn định đặt nhiệt độ phòng khoanh giấy kháng sinh đặt vào dĩa phải thời gian thích hợp, khơng nên để lâu  Nếu để thời gian lâu đặt khoanh giấy kháng sinh vào, đường kính vùng ức chế giảm, nên trương hợp kết luận vi khuẩn nhạy cảm thành vi khuẩn kháng kháng sinh Nhiệt độ ủ Thời gian ủ  Những thử nghiệm kiểm tra độ nhạy vi khuẩn  Thường thử nghiệm xác định hoạt tính thường ủ 35 C để quan sát tăng trưởng kháng khuẩn thời gian ủ thường từ 16 đến 18 Nếu nhiệt độ thấp nhiệt độ cần cho tăng trưởng, đường kính vùng ức chế lớn  Nếu nhiệt độ cao nhiệt độ cần cho tăng trưởng, vi khuẩn thể tính nhạy cảm Kích thước dĩa, độ sâu mơi trường agar, khoảng cách khoanh giấy kháng sinh  Thử nghiệm độ nhạy vi khuẩn thường sử dụng dĩa có đường kính - 10 cm không nhiều khoanh giấy kháng sinh dĩa  Nếu số lượng kháng sinh thử nghiệm nhiều  Khi mơi trưởng mỏng đường kính vùng ức chế lớn, kết ngược lại môi trường dày  Sự thay đổi nhỏ độ sâu lớp agar ảnh hưởng không đáng kể đến hiệu  Khoảng cách khoanh giấy kháng sinh quan trọng tránh nằm trùng lên vùng ức chế kháng sinh thử, dĩa, dĩa 14- cm Hiệu lực khoanh giấy kháng sinh  Đường kính vùng ức chế tương quan với lượng thuốc cho vào khoanh giấy  Nếu hiệu lực thuốc giảm (do thời gian tồn trữ), tương ứng vùng ức chế giảm Xác định hoạt tính kháng khuẩn • Hai cách – Nồng độ ức chế tối thiểu (minimal inhibitory concentration, MIC) • Nồng độ thấp thuốc ức chế tăng trưởng tác nhân gây bệnh – Nồng độ gây chết tối thiểu (minimal lethal concentration (MLC) minimal bactericidal concentration (MBC)) • Nồng độ thấp để giết tác nhân gây bệnh • Hai kỹ thuật xác định MIC MBC Thử nghiệm độ nhạy kháng sinh nồng độ pha loãng Thử nghiệm độ nhạy kháng sinh nồng độ pha loãng MIC=16 ug/ml Pha loãng nồng độ kháng sinh môi trường agar: dãy ống nghiệm pha lỗng kháng sinh mơi trường đặc (agar) quan sát diện khuẩn lạc (nhiều loại vi sinh vật kháng sinh) Thử nghiệm pha loãng ống nghiệm: nhiều ống nghiệm kháng sinh • MIC: nồng độ dãy pha lỗng kháng sinh mơi trường Müller Hinton • lượng vi khuẩn cho vào 2n 128 64 32 16 Antibiotic concentration (ug/ml) MBC=64 ug/ml • 37°C thời gian 18 giờ, quan sát tăng trưởng • MBC: nồng độ kháng sinh thấp giết toàn vi khuẩn 2n 128 64 32 16 Antibiotic free medium Phương pháp Kirby-Bauer : khuếch tán thạch  Phương pháp Kirby-Bauer sử dụng để xác định độ nhạy Phương pháp Kirby-Bauer : khuếch tán thạch  Phương pháp khuếch tán đĩa thạch: nuôi vi sinh vật, phương pháp Kirby-Bauer đề nghị vi khuẩn môi trường đĩa thạch NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory  kháng sinh đặt bề mặt môi trường Standards guidelines )  khuếch tán kháng sinh tạo nên  Tính xác tính lập lại thử nghiệm phụ thuộc vào trì chuỗi nồng độ chất chuẩn AMP khuynh độ nồng độ Tb Tet  đường kính vùng ức chế tăng trưởng đo so sánh với bảng chuẩn Gm  đường kính vùng ức chế tăng trưởng tương quan nghịch với MIC • Phương pháp chuẩn phương pháp khuếch tán thạch • Sự nhạy cảm kháng thuốc vi sinh vật xác định dựa bảng tương quan đường kính vùng ức chế kháng Xác định độ nhạy kháng vi sinh vật 512 • MIC so sánh với bảng chuẩn theo chuẩn quốc tế 128 64 (μg/ml) Phương pháp Kirby-Bauer Suceptibility order: Tet>Tb>Gm>Amp • log2 MIC với đường kính vùng ức chế tăng trưởng đường thẳng • liều hiệu xác định 32 A 16 Resistant Intermediate Susceptible B 10 14 18 Diameter if inhibition zone (mm) 22 Thử nghiệm khuếch tán qua thạch Vùng ức chế tăng trưởng Thử nghiệm khuếch tán qua thạch  Xác định chắn vi sinh vật trải bề mặt đĩa agar ủ vi sinh vật  Mỗi giấy (kháng sinh) chắn tiếp xúc với bề mặt môi trường Mỗi giấy kháng sinh không gần 24 mm tính từ tâm đến tâm  Không nhiều 12 khoanh giấy kháng sinh dĩa petri 150 mm khoanh với dĩa 100 mm Đọc kết tính kết  Sau 16- 18 ủ, dĩa kiểm trả  Vùng ức chế vòng đồng dạng  Nếu có khuẩn lạc xuất vòng, bắt buột phải lặp lại thí nghiệm  Đường kính vùng hoàn toàn bị ức chế đo (bao gồm đường kính giấy kháng sinh  Đường kính vùng ức chế thường biểu diễn đơn vị millimeter, đo cách lật ngược dĩa petri  Màu sắc vùng ức chế mơi trường có vi sinh vật phát triển nên tương phản để dễ quan sát đo Phương pháp tăng trưởng  Phương pháp tăng trưởng thực sau: Lac- = dark blue Lac+ = yellow Khoảng từ đến khuẩn lạc phân lập chọn lọc dĩa môi trường Trên bề mặt khuẩn lạc đặt vòng kim cấy lấy vi khuẩn cho vào ống nghiệm Hemin NAD NAD+Hemin H Influenza requires NAD and hemin Oxidase test chứa đến ml mơi trường thích hợp N meningitidis is has cyt C Môi trường nuôi cấy lỏng ủ 35C môi trường đục xuất vi khuẩn so sánh với với dung dịch chuẩn 0,5 McFarland (thường từ đến giờ)  Trong vi sinh vật, McFarland chuẩn sử dụng để điều chỉnh độ đục (turbidity) Độ đục điều chỉnh môi trường buffer vô trùng McFarland Standard No 0.5 1.0% Barium chloride (ml) 0.05 0.1 0.2 1.0% Sulfuric acid (ml) 9.95 9.9 9.8 1.5 3.0 6.0 Tuy nhiên, sử dụng máy đo quang phổ để điều chỉnh độ đục Approx cell density (1X10^8 CFU/mL) Absorbance (660 nm)* 0.132 0.257 0.451 10 ... lạc (nhiều loại vi sinh vật kháng sinh) Thử nghiệm pha loãng ống nghiệm: nhiều ống nghiệm kháng sinh • MIC: nồng độ dãy pha loãng kháng sinh mơi trường Müller Hinton • lượng vi khuẩn cho vào... MBC Thử nghiệm độ nhạy kháng sinh nồng độ pha loãng Thử nghiệm độ nhạy kháng sinh nồng độ pha loãng MIC=16 ug/ml Pha loãng nồng độ kháng sinh mơi trường agar: dãy ống nghiệm pha lỗng kháng sinh. .. zone (mm) 22 Thử nghiệm khuếch tán qua thạch Vùng ức chế tăng trưởng Thử nghiệm khuếch tán qua thạch  Xác định chắn vi sinh vật trải bề mặt đĩa agar ủ vi sinh vật  Mỗi giấy (kháng sinh) chắn