Phương pháp thử nghiệm tế bào (Nuôi cấy tế bào động vật)

Nuôi cấy mô động vật Nuôi cấy mô động vật gì? • Ni cấy in vitro (culture) (duy trì và/ tăng sinh (proliferate)) tế bào, mô quan • Các dạng ni cấy mơ • Ni cấy quan • Ni cấy mơ • Ni cấy tế bào Ni cấy quan • Phơi quan tách từ thể nuôi cấy in vitro • Thuận lợi • Chức sinh lý bình thường trì • Tế bào trì biệt hóa • Bất lợi • Khơng có khả làm tăng phơi quan • Tăng trưởng chậm • Mơi trường ni cấy cần vơ trùng lần thí nghiệm Ni cấy mơ • Một phần mô sau tách nuôi mơi trường ni cấy • Thuận lợi • Chức bình thường trì • So với ni cấy quan gia tăng mơ (nhưng thường khơng dễ đạt) • Bất lợi • Tổ chức gốc mô bị Nuôi cấy tế bào • Mơ sau tách thường phân cắt thành tế bào (thường sử dụng enzyme), tế bào sau ni mơi trường ni cấy • Thuận lợi • Phát triển dòng tế bào qua nhiều hệ • Có thể làm gia tăng số lượng • Bất lợi • Tế bào vài đặc tính biệt hóa EMP04 Tại cần phải ni cấy tế bào? • Nghiên cứu • Tránh khó khăn nghiên cứu phản ứng tế bào: • Ảnh hưởng (phá hủy) mơ xung quanh • Sự thay đổi động vật thử nghiệm điều kiện stress thử nghiệm • Làm giảm số lượng động vật thử nghiệm • Có khả thương mại hóa với tỷ lệ cao • Tạo tế bào (vật liệu): vaccine, antibody, hormone Những thuận lợi nuôi cấy tế bào • Thuận lợi: • Có thể kiểm sốt mơi trường • Mẫu đồng • Cần hóa chất/ thành phần mơ hình động vật • Bất lợi: • Khó trì dòng tế bào • Giá thành cao (do phần nhỏ mô tăng trưởng) • Khó biệt hóa Các dạng ni cấy tế bào Ni cấy sơ cấp (Primary Cultures) • Lấy trực tiếp từ mô động vật, phôi người trưởng thành • • • Thuận lợi: • • Ni cấy mơ từ động vật Ni cấy dòng tế bào đơn (bằng enzyme, học) Thường trì đặc tính biệt hóa tế bào in vivo Bất lợi: • • • Giai đoạn đầu tế bào không đồng nhất, sau nguyên bào sợi (fibroblast) trở nên trội Sự chuẩn bị dòng tế bào sơ cấp thường thủ cơng Có thể trì in vitro thời gian giới hạn Các dạng nuôi cấy tế bào Nuôi cấy thứ cấp (Secondary culture) • • • • • • • Ni cấy từ dòng tế bào sơ cấp Đã phân lập cách chọn lọc tạo dòng Các dòng tế bào đồng dạng Chu kỳ sống giới hạn in vitro Duy trì kiểu hình biệt hóa Phụ thuộc vào giá thể ni Có nhiễm tiếp xúc Quy trình ni cấy tế bào Mơ động vật Tách tế bào Dòng tế bào sơ cấp Ni cấy Lưu trữ Dòng tế bào Dòng tế bào liên tục Lưu trữ Số lượng tăng giới hạn Số lượng tăng khơng giới hạn Sự đa dạng hình thái tế bào phụ thuộc vào loại tế bào Fibroblastic Epithelial Endothelial Neuronal Môi trường nuôi cấy tế bào in vitro Để tế bào tăng trưởng cần điều kiện gì? • Cơ chất dung dịch (flask nuôi cấy tế bào) Dĩa nhựa có thành phần hóa học phù hợp tráng với protein ECM Môi trường lỏng (suspension) • Chất dinh dưỡng mơi trường ni • Điều kiện môi trường (CO2, nhiệt độ 37oC, độ ẩm) Oxy trì ổn định • Vơ trùng tuyệt đối Môi trường nuôi cấy tế bào in vitro Môi trường • Duy trì pH áp suất thẩm thấu (260-320 mOsm/L) • Cung cấp chất dinh dưỡng lượng Thành phần môi trường Muối vơ • Duy trì áp suất thẩm thấu • Kiểm sốt tính thấm màng (Na+, K+, Ca2+) • Ion cofactor enzyme Chất thị pH – Phenol Red • Thích hợp cho tế bào tăng trưởng pH 7.4 Môi trường nuôi cấy tế bào in vitro Thành phần môi trường Dung dịch đệm (Bicarbonate HEPES) • Dung dịch đệm bicarbonate cung cấp CO2 khí • HEPES có pH 7.2 – 7.6 (khơng cần CO2) Glucose • Cung cấp lượng Acid keto (oxaloacetate pyruvate) • Chất trung gian chu trình đường phân chu trình Krebs • Acid keto thêm vào môi trường nguồn lượng • Duy trì chuyển hóa tế bào mức cao Môi trường nuôi cấy tế bào in vitro Thành phần mơi trường Carbohydrate • Nguồn lượng • Glucose galactose • Nồng độ thấp (1 g/L) cao(4.5 g/L) môi trường Vitamin • Tiền chất nhiều cofactor • Vitamin nhóm B cần cho tăng trưởng tăng sinh tế bào • Vitamin phổ biến thường tìm thấy môi trường riboflavin, thiamine biotin Các yếu tố khác • Kẽm, đồng, selenium chất trung gian tricarboxylic acid Môi trường nuôi cấy tế bào in vitro Các chất bổ sung L-glutamine • Acid amin thiết yếu (tế bào khơng tổng hợp được) • Nguồn lượng (chu trình citric acid), sử dụng tổng hợp protein • Mơi trường lỏng thường khơng ổn định- thêm vào chất bổ sung Acid amin không thiết yếu • Thường thêm vào mơi trường • Nguồn luợng, tổng hợp protein Môi trường nuôi cấy tế bào in vitro Chất bổ sung Yếu tố tăng trưởng hormone (ví dụ: insulin) • Kích thích vận chuyển glucose sử dụng glucose • Hấp thu acid amin • Duy trì biệt hóa Chất kháng sinh, kháng nấm • Penicillin, streptomycin, gentamicin, amphotericin B • Giảm nguy nhiễm vi khuẩn nấm • Tế bào trở nên kháng kháng sinh– thay đổi kiểu hình • Tốt tránh ni thời gian dài Môi trường nuôi cấy tế bào in vitro Foetal Calf/Bovine Serum (FCS & FBS) • Yếu tố tăng trưởng hormone • Nơi tế bào gắn lên • Gắn trung hòa độc tố Đun 56oC, 30 phút sử dụng • Phá hủy kháng thể bổ thể • Phá hủy virus Lưu ý: khơng đun lâu, nhiệt độ cao gây phá hủy yếu tố tăng trưởng, hormone vitamin ảnh hưởng đến tăng trưởng tế bào Nuôi cấy tế bào phòng thí nghiệm nào? Phục hồi quần thể tế bào phân lập từ mô trữ lạnh Containment level cell culture laboratory Duy trì tế bào môi trường nuôi cấy Typical cell culture flask Cấy chuyền Đếm tế bào Bảo quản đông lạnh ‘Mr Frosty’ Used to freeze cells Cách đếm tế bào buồng đếm hồng cầu Diagram represent cell count using hemocytometer Đường cong tăng trưởng lý tưởng nuôi cấy tế bào Phương pháp xác định số lượng tế bào Phương pháp MTS Phương pháp so màu để xác định số lượng tế bào sống phát triển tế bào môi trường nuôi cấy  Hợp chất MTS (muối tetrazolium) bị khử sinh học NADPH/NADH tế bào tạo sản phẩm màu formazan  Sản phẩm formazan tỉ lệ thuận với số lượng tế bào môi trường nuôi cấy  Đo độ hấp thụ 490 nm Phương pháp xác định số lượng tế bào Phương pháp MTS Màu vàng Màu tím Thử nghiệm MTT Cơ sở: enzyme reductase có ty thể dạng kết tủa ... trưởng lý tưởng nuôi cấy tế bào Phương pháp xác định số lượng tế bào Phương pháp MTS Phương pháp so màu để xác định số lượng tế bào sống phát triển tế bào môi trường nuôi cấy  Hợp chất MTS (muối... • • Tế bào khối u Gene ung thư Xử lý hóa chất Đặc điểm ban đầu sinh vật bị thay đổi Quy trình ni cấy tế bào Mơ động vật Tách tế bào Dòng tế bào sơ cấp Ni cấy Lưu trữ Dòng tế bào Dòng tế bào liên...Ni cấy mơ động vật gì? • Ni cấy in vitro (culture) (duy trì và/ tăng sinh (proliferate)) tế bào, mơ quan • Các dạng ni cấy mơ • Ni cấy quan • Ni cấy mơ • Ni cấy tế bào Ni cấy quan • Phôi