phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (lc-ms ms) xác định dư lượng một số kháng sinh nhóm sulfonamides trong thịt gia súc gia cầm

1 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- Vũ Thị Trang PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LC-MS/MS XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MỘT SỐ KHÁNG SINH NHÓM SULFONAMIDES TRONG TH

1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Vũ Thị Trang

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ (LC-MS/MS) XÁC ĐỊNH

DƯ LƯỢNG MỘT SỐ KHÁNG SINH NHÓM SULFONAMIDES

TRONG THỊT GIA SÚC GIA CẦM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2012

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRONG THỊT GIA SÚC GIA CẦM

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 60.44.29

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN XUÂN TRUNG

Hà Nội - 2012

3

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên cho em gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy PGS.TS Nguyễn Xuân Trung đã tận tình hướng dẫn, đóng góp những ý kiến quý báu, tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài và viết luận văn

Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo giảng dạy tại khoa Hoá học, đặc biệt là các thầy cô trong bộ môn Hoá Phân Tích, đã cho em những kiến thức quý giá, tạo điều kiện cho em được học tập và nghiên cứu trong môi trường hiện đại

Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm

An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi được học tập và hoàn thành đề tài này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các đồng nghiệp tại labo Hóa – Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình làm thực nghiệm

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên, chia sẻ mọi khó khăn cùng tôi

Hà Nội, năm 2012

Học viên

Vũ Thị Trang

4

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU……… 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN……… ……….… 3

1.1 Giới thiệu về kháng sinh nhóm sulfonamid (SAs)……… 3

1.1.1 Lịch sử phát hiện……… ….3

1.1.2 Phân loại SAs……… 3

1.1.3 Cấu tạo của SAs……….4

1.1.4 Tác dụng của SAs……… 6

1.1.5 Tình hình sử dụng kháng sinh Sulfonamid 8

1.1.6 Giới hạn tồn dư tối đa cho phép của SAs trong thực phẩm 9

1.2 Các phương pháp xác định SAs 9

1.2.1 Trong nước 10

1.2.2 Thế giới 10

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu 19

2.2 Phương pháp nghiên cứu 19

2.2.1 Nguyên tắc chung của sắc ký lỏng……… …19

2.2.2 Detector khối phổ……….…21

2.2.3 Phân tích định tính và định lượng bằng LC/MS……….26

2.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng trong nghiên cứu……… …26

2.3.1 Thiết bị và dụng cụ……… …26

2.3.2 Hóa chất, chất chuẩn……… …27

2.4 Lấy mẫu 28

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Tối ưu điều kiện tách và xác định Sulfonamid trên thiết bị LC/MS/MS 29

3.1.1 Tối ưu các điều kiện của detector khối phổ (MS)……… 29

3.1.2 Lựa chọn cột tách……… …32

3.1.3 Khảo sát chương trình gradient……… …32

3.1.4 Khảo sát tốc độ pha động 36

3.1.5 Khảo sát thành phần acid formic trong pha động 38

5

3.2 Tối ưu quá trình xử lý mẫu phân tích các SAs 40

3.2.1 Khảo sát qui trình chiết 43

3.2.2 Khảo sát nồng độ acid acetic trong dung môi chiết 46

3.2.3 Khảo sát thành phần MeOH trong dung môi chiết 48

3.2.4 Khảo sát khối lượng pha rắn PSA 49

3.3 Đánh giá phương pháp phân tích 52

3.3.1 Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đường chuẩn 52

3.3.2 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp 56

3.3.2 Đánh giá độ chụm (độ lặp lại) và độ đúng (độ thu hồi) 58

3.3 Phân tích mẫu thực 65

KẾT LUẬN 73

TÀI LIỆU THAM KHẢO 75

PHỤ LỤC 80

Phụ lục 1: Sắc đồ khảo sát nồng độ acid formic trong pha động 80

Phụ lục 2: Kết quả khảo sát qui trình chiết mẫu 82

Phụ lục 3: Kết quả khảo sát nồng độ acid acetic trong dung môi chiết 87

Phụ lục 4: Kết quả khảo sát nồng độ MeOH trong dung môi chiết và khối lượng PSA 92

Phụ lục 5: Sắc đồ thẩm định phương pháp (độ lặp lại, độ thu hồi) 94

Phụ lục 6: Một số sắc đồ phân tích mẫu thực tế 104

6

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang Bảng 1.1: Cấu trúc hoá học của một số SAs được xác định trong đề tài 4 Bảng 1.2: Giới hạn tồn dư tối đa cho phép đối với SAs tại một số thị trường 9 Bảng 3.1: Các thông số tối ưu hóa điều kiện phân mảnh 29 Bảng 3.2: Các thông số tối ưu cho nguồn và khí

31 Bảng 3.3: Ảnh hưởng nồng độ acid formic tới diện tích píc SAs 38 Bảng 3.4: Các qui trình chiết dự kiến chiết các SAs 44 Bảng 3.5: Ảnh hưởng của qui trình chiết đến hiệu suất thu hồi các SAs 45 Bảng 3.6: Ảnh hưởng của nồng độ acid acetic đến hiệu suất thu hồi các SAs 46 Bảng 3.7: Ảnh hưởng của nồng độ MeOH đến hiệu suất thu hồi các SAs 48 Bảng 3.8: Ảnh hưởng của khối lượng PSA đến hiệu suất thu hồi của các SAs 49 Bảng 3.9 : Cách pha các dung dịch chuẩn để lập đường chuẩn có chứa IS 53

Bảng 3.12: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của các SAs 56 Bảng 3.13: Độ lặp lại và hiệu suất thu hồi của các SAs trên nền mẫu thịt lợn

7

DANH MỤC HÌNH VẼ

Trang

Hình 2.3: Cấu tạo của bộ phân tích khối tứ cực MS/MS 25 Hình 3.1: Sắc ký đồ các SAs theo chương trình gradient 1

33 Hình 3.2: Sắc ký đồ các SAs theo chương trình gradient 2 34 Hình 3.3: Sắc ký đồ các SAs theo chương trình gradient 3 34 Hình 3.4: Sắc ký đồ các SAs theo chương trình gradient 4 35 Hình 3.5: Sắc ký đồ các SAs theo chương trình gradient 5 35 Hình 3.6: Sắc đồ rửa giải các SAs tại tốc độ dòng 0,2 ml/phút 36 Hình 3.7: Sắc đồ rửa giải các SAs tại tốc độ dòng 0,3 ml/phút 37 Hình 3.8: Sắc đồ rửa giải các SAs tại tốc độ dòng 0,4 ml/phút 37 Hình 3.9: Sắc đồ rửa giải các SAs tại tốc độ dòng 0,5 ml/phút 37 Hình 3.10: Sắc đồ các SAs tại nồng độ acid formic 0,15% 39 Hình 3.11: Ảnh hưởng của quy trình chiết đến hiệu suất thu hồi của SIM 45 Hình 3.12: Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ acid acetic đến hiệu suất thu hồi

9

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

ACN Acetonitrile

EI Electron Ionization Ion hóa bằng dòng electron ESI Eelectrospray ionization Chế độ ion hóa phun điện tử

HPLC High performance liquid

chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IUPAC International Union of Pure and

Applied Chemistry

Liên minh quốc tế về hóa học

cơ bản và ứng dụng LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện

LOQ Limit of quantity Giới hạn định lượng

MRL Maximum Residue Limit Giới hạn dư lượng tối đa

PSA Primary and secondary amine Các amin bậc 1, bậc 2

RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối

SPE solid phase extraction Chiết pha rắn

U.S NRP United States National Residue

Program

Chương trình quốc gia về tồn

dư chất độc của Mỹ UPLC-

MS/MS

Ultral performance liquid

chromatography tandem mass

spectrometry

Sắc ký lỏng siêu hiệu năng kết nối khối phổ

10

MỞ ĐẦU

An toàn thực phẩm đang là mối quan tâm hàng đầu của toàn xã hội An toàn thực phẩm trong sản phẩm chăn nuôi không chỉ đơn thuần là sản phẩm (thịt, trứng, sữa) không nhiễm bẩn, ôi thiu, nhiễm khuẩn (yếu tố gây ngộ độc cấp tính), mà còn

ở chỗ sản phẩm chứa các chất gây ra ngộ độc tích luỹ, mãn tính hay trường diễn (hocmon, kháng sinh, độc chất)

Trong vô số các nguyên nhân dẫn đến viê ̣c mất an toàn vê ̣ sinh thực phẩm , thì vấn đề về dư lượng thuốc kháng sinh và tồn dư chất kích thí ch tăng tro ̣ng trong thịt gia súc gia cầm cũng là thực trạng nan giải và đáng báo động Vớ i mô ̣t lươ ̣ng thực phẩm khổng lồ từ đô ̣ng vâ ̣t đang được tiêu thu ̣ trên thi ̣ trường , ít ai nghĩ đến viê ̣c mỗi ngày trong cơ thể chúng ta đa ng phải dần tích lũy dư lượng chất kích thích tăng tro ̣ng và thuốc kháng sinh Nguyên nhân do người dân sử du ̣ng rất tùy tiê ̣n các loại thức ăn tăng trọng và thuốc kháng sinh nhằm ngăn ngừa , trị bệnh và giúp vật nuôi mau ăn chó ng lớn Hâ ̣u quả là dư lượng chất kích thích và thuốc kháng sinh trong thi ̣t gia súc, gia cầm vượt ngưỡng cho phép gấp nhiều lần , tuy không gây ngô ̣

đô ̣c cấp tính tức thời, nhưng sẽ gây nguy ha ̣i về lâu dài cho sức khỏe của ngườ i tiêu dùng

Sulfonamid (SAs) là một nhóm thuốc kháng sinh tổng hợp đóng một vai trò quan trọng và hiệu quả trong việc hạn chế sự nhiễm trùng do vi khuẩn và vi sinh vật trong hệ thống tiêu hóa của vật nuôi Vì vậy, chúng được sử dụng trong thức ăn chăn nuôi nhằm kích thích tăng trưởng, ngăn chặn và điều trị một loạt các bệnh ở gia súc gia cầm như các bệnh về tiêu hóa hay hô hấp Song hệ quả không thể tránh khỏi khi sử dụng nhóm các chất kháng sinh này là tồn dư của chúng trên thịt gia súc gia cầm, gây nguy cơ kháng thuốc kháng sinh của vi sinh vật, làm giảm sức đề kháng của vật nuôi, và gây hại cho sức khỏe con người như: ung thư tuyến giáp, sốc phản vệ và kháng thuốc [1]

Ngộ độc thực phẩm thường xảy ra do thiếu sót trong công tác kiểm tra, thanh tra từ nguyên liệu dùng để chế biến thực phẩm, do sơ xuất trong nấu nướng, vệ sinh

11

Việc nghiên cứu xác định dư lượng SAs trong thịt gia súc gia cầm đã được nhiều tác giả trên thế giới quan tâm Tuy nhiên, ở Việt Nam, vấn đề này vẫn chưa được nghiên cứu sâu Việc nghiên cứu và đưa ra phương pháp xác định nhanh, chính xác SAs giúp cho công tác thanh tra kiểm tra được chặt chẽ, đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ là phương pháp hiện đại, có độ nhạy

cao, cho phép xác định nhanh và chính xác Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành đề tài:

“Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ(LC-MS/MS) xác đinh dư lượng một số kháng sinh nhóm Sulfonamid trong thịt gia súc gia cầm ” Với nội dung nghiên

cứu như sau:

- Tối ưu các điều kiện chạy máy LC-MS/MS để tách và xác định các SAs

- Tối ưu quá trình xử lý mẫu

- Ứng dụng phân tích trên một số mẫu thực tế

1.1.2 Phân loại SAs

Các SAs được phân loại theo khả năng hấp thu và thời gian bài thải chúng ra khỏi cơ thể, đa số bài thải qua đường thận bằng cách khuếch tán thụ động Tuy nhiên, có một số bị tái hấp thụ ở ống thận làm cho chúng duy trì lâu hơn trong cơ thể [8]

Dựa vào thời gian tác dụng có thể chia SAs thành 4 nhóm như sau:

- SAs tác động toàn thân, bao gồm:

+ SAs tác động nhanh (3-6 giờ), bài thải nhanh: sulfamerazin, sulfadimidin, sulfathiazole

+ SAs nửa chậm (6-10 giờ): sulfapyridin, sulfamethoxazol, sulfadiazine

13

+SAs bài thải chậm (10-12 giờ): sulfamethoxypyridazin, sulfadimethoxin, sulfadoxin

- SAs kháng khuẩn đường ruột: sulfaguanidin,phtalylsulfathiazon

- SAs tác động tại chỗ (thuốc nhỏ mắt): sulfacetamid,sulfadiazine bạc

- SAs trị cầu trùng (thường kết hợp với nhóm diaminopyrimidin): sulfadimidin, solfaquinoxalin, sulfadimethoxin,sulfadoxin

1.1.3 Cấu tạo của SAs

Thay thế các gốc R1, R2, R3 khác nhau, sẽ cho các SAs

pK a Công thức cấu tạo

1.1.4 Tác dụng của SAs

 Cơ chế tác động:

SAs là một hợp chất hữu cơ có chứa các gốc SO2NH2 (amid của acid sulfonic) Cấu trúc phân tử của nó tương tự như p-aminobenzoic acid (PABA) là cần thiết trong các vi khuẩn sinh vật, như một chất nền của enzym dihydropteroat cho sự tổng hợp của acid tetrahydrofolic (THF) Cơ chế tác dụng kìm khuẩn của SAs là do nó cạnh tranh với acid PABA trong tế bào vi khuẩn, làm cho việc tổng hợp và vận chuyển acid folic (động vật có vú dùng acid folic có trong thực phẩm còn vi khuẩn phải tổng hợp folic) thành nucleoprotein cần cho mọi tế bào sống của

vi khuẩn bị ngưng trệ, gây rối loạn sự sinh sản và phát triển của vi khuẩn PABA kết hợp với pteroic acid hoặc glutamic để tạo pteroylglutamic acid (PGA), chất này như một coenzyme trong sự tổng hợp purin và timin PGA cũng là một phần của phân tử B12 có liên quan tới sự biến dưỡng acid amin và purin Do đó khi thiếu

16

PABA sẽ gây thiếu purin, acid nucleic Điều này cũng giải thích tại sao các vi khuẩn tự tổng hợp được PABA thì đề kháng với SAs và tại sao thymin, purin, methionin, và một số amin khác lại đối kháng hiệu quả với SAs Do đó vi khuẩn bị tiêu diệt trước sức đề kháng của cơ thể hoặc nhờ tác dụng của thuốc Chúng được

sử dụng trong phòng và điều trị nhiễm trùng do vi khuẩn, đái tháo đường, phù, tăng huyết áp, và bệnh gút… Các sulfonamid có tác dụng kháng khuẩn cho hệ miễn dịch giữ vai trò chủ yếu trong loại trừ tận gốc sự nhiễm trùng Sulfonamid có hiệu quả cao trong giai đoạn đầu của nhiễm trùng cấp tính vì giai đoạn này vi khuẩn có mức biến dưỡng cao, dễ kết hợp với Sulfonamid, thêm vào đó khả năng thực bào còn mạnh và sự khuếch tán của thuốc chưa bị cản trở bởi quá trình xơ hóa trong viêm mãn tính Chúng có khả năng kháng khuẩn trên vi khuẩn Gram dương, Gram âm, Protozoa [9]

 Tác dụng phụ của SAs:

Các loại SAs được các nhà sản xuất đưa vào trong thức ăn gia súc, gia cầm, các thuốc chống mốc, thuốc chống oxy hóa giúp sinh vật tăng sức đề kháng, phòng trị nhiễm khuẩn đồng thời giống như một chất kích thích tăng trưởng đem lại lợi ích cho người chăn nuôi Tuy nhiên những năm gần đây xảy ra hiện tượng kháng kháng sinh và tồn dư kháng sinh trong thịt, cá, tôm…do người nông dân sử dụng không đúng cách và quá nhiều thuốc kháng sinh và không đảm bảo thời gian ngưng sử dụng trước khi thu hoạch, làm cho kháng sinh tích tụ trong thịt Khi người tiêu dùng

sử dụng thực phẩm có chứa dư lượng kháng sinh SAs trong thịt, tôm, cá, trứng, sữa sau một thời gian dài sử dụng chúng sẽ tích lũy trong cơ thể, có thể gây hiện tượng kháng kháng sinh ở người, làm mất đi cả vi khuẩn có lợi, ngoài ra SAs dễ bị acetyl hóa ở gan thành N4

- acetyl sulfonamid khó tan trong nước, đồng thời từ quản cầu thận tới ống dẫn tiểu, SA được làm đậm đặc 50 lần, sự bài tiết H+ vào ống thận làm nước tiểu càng acid hơn, giảm tính tan của sulfonamid từ đó trở thành tinh thể trong ống thận, gây hiện tượng kết tinh ở đường tiết niệu gây viêm thận và sỏi thận, tiểu ra máu Sulfonamid có khả năng gây ra một loạt các phản ứng bất lợi, bao gồm

cả rối loạn đường tiết niệu, rối loạn tạo máu , rối loạn chuyển hóa porphyrin, và

17

phản ứng quá mẫn cảm Khi sử dụng với liều lượng lớn, chúng có thể gây ra phản ứng dị ứng mạnh mẽ Hai hội chứng nghiêm trọng nhất là hội chứng Stevens-Johnson và hoại tử biểu bì độc hại (cũng được gọi là hội chứng Lyell)

SAs hấp thu tốt qua đường tiêu hóa, ngoại trừ các SAs có tác động tại chỗ

1.1.5 Tình hình sử dụng kháng sinh Sulfonamid

SAs là một trong những nhóm chất lâu đời nhất của các hợp chất kháng khuẩn Chúng được sử dụng lâm sàng trong 50 năm và lần đầu tiên được đăng ký tại Úc năm 1940 Tại nhiều quốc gia, việc sử dụng SAs trong chăn nuôi được xem xét trên nhiều khía cạnh như dư lượng còn lại trong thịt sau giết mổ, mức độ ảnh hưởng tới sức khỏe con người…trở thành vấn đề khá nhạy cảm trong thương mại quốc tế

Tại Hoa Kỳ, trong suốt 25 năm, dư lượng SAs trong thịt gia súc, đặc biệt là trong thịt lợn, thịt bê và thịt gia cầm rất cao là vấn đề được quan tâm bởi mức độ tồn dư vi phạm nhiều hơn bất cứ một loại thuốc kháng sinh nào khác Cục quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) bắt đầu tiến hành điều tra các SAs trong đầu những năm 1970, và tiến hành thủ tục thu hồi đối với sulfadimidine (SA được sử dụng rộng rãi nhất), bởi nó đã được chứng minh gây ra khối u cho động vật Năm

2009 chương trình kiểm soát dư lượng Hoa Kỳ (viết tắt là U.S NRP) [25] tiến hành kiểm tra 17.241 mẫu thịt gia súc, gia cầm phân tích 128 hợp chất thuốc thú y và thuốc trừ sâu thì mẫu có chứa SAs có tỉ lệ cao nhất, trong tổng số 2496 mẫu kiểm tra SAs có tới 0,24% mẫu vi phạm Kết quả phân tích trên gan các loài gia súc gia cầm trong 101 mẫu gan lợn và 99 mẫu thịt lợn quay có hai mẫu vi phạm hàm lượng trong khoảng 1,01-2,51 ppm, lấy 53 mẫu gan bê phân tích có một mẫu nhiễm hàm lượng lên tới 0,31-0,5 ppm Một mẫu gan lợn nhiễm sulfamethazine lên tới 2,39 ppm và một mẫu nhiễm sulfadimethoxine trong thịt bò là 0,38ppm

Tại Việt Nam, kháng sinh được sử dụng rộng rãi trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản với mục đích kích thích tăng trưởng, phòng và điều trị bệnh Mới đây, trên website của Cục Quản lý chất lượng nông lâm thủy sản, trong các báo cáo

18

Kết quả thực hiện chương trình kiểm soát dư lượng các chất độc hại hàng tháng [1]

cho thấy: trong tháng 2, tiến hành kiểm tra 250 mẫu phát hiện dư lượng nhóm Sulfonamid có Sulfadimidine hàm lượng 4,18 ppb và Sulfadiazine là 4,16 ppb trên

1 mẫu cá lóc thương phẩm tại vùng nuôi Vị Thủy (Hậu Giang), kết quả phân tích

400 mẫu vào tháng 3 phát hiện dư lượng Sulfadimidine là 123,26 ppb và Sulfadiazine có hàm lượng 15,26 ppb trên 1 mẫu cá rô đồng thương phẩm tại tỉnh Hậu Giang

Tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi rất phổ biến, khi dư lượng kháng sinh trong các sản phẩm thịt cao, thì hậu quả tất yếu là chất lượng thịt kém, không đáp ứng được yêu cầu của thị trường, điều này ảnh hưởng không nhỏ tới xuất khẩu

1.1.6 Giới hạn tồn dư tối đa cho phép của SAs trong thực phẩm

Giới ha ̣n tồn dư tối đa (MRL – Maximum Residue Limit ) của từng loại kháng sinh cho phép sử dụng đối với từng loại thực phẩm có thể được qu y đi ̣nh rất khác nhau ở các nước , căn cứ vào đă ̣c điếm sinh lý , sinh thái, nhất là đă ̣c điểm dinh dưỡng, thói quen ăn uống của người dân từng nước Qua tham khảo một số tài liệu [7, 11, 12] có mức MRL như bảng dưới đây

Bảng 1.2: Giới hạn tồn dư tối đa cho phép đối với SAs tại một số thị trường

1.2.1 Trong nước

Tổng Cục Tiêu chuẩn đo lường chất lượng đã ban hành TCVN 8345-2010 [10] xác định 10 SAs (bao gồm: sulfadiazin, sulfathiazol, sulfamerazin, sulfamethazin, sufamethoxypiridazin, sulfacloropyridazin, sulfadoxin, sulfamethoxazol, sulfadimethoxin và sulfachinoxalin) trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Các chất nhóm SAs có trong mẫu sản phẩm thủy sản được chiết tách bằng hỗn hợp axetonitril và diclometan Dịch chiết sau khi cô cạn cho tác dụng với dung dịch fluorescamin để tạo dẫn xuất huỳnh quang Hàm lượng các dẫn xuất được xác định trên hệ thống HPLC pha đảo: cột C18, pha động: dung dịch H3PO4 0,02 M, acetonitril, metanol theo chương trình gradient, phát hiện và định lượng bằng detector huỳnh quang tại bước sóng kích thích Ex: 405 nm và bước sóng phát xạ Em: 495 nm Giới hạn phát hiện của phương pháp nhỏ hơn 5 g/kg

1.2.2 Thế giới

1.2.2.1 Phương pháp sắc ký lỏng với detector UV

20

Phương pháp sắc ký lỏng rất phù hợp cho việc xác định SAs nên nó được sử dụng rộng rãi Các tác giả nghiên cứu bằng phương pháp sắc ký lỏng trên nhiều loại detector khác nhau Trong đó detector UV là loại detector thông dụng nhất Chất phân tích sau khi được tách khỏi cột sắc ký, dẫn vào flowcell đo được chiếu bởi một chùm tử ngoại Sự hấp thụ tia bức xạ bởi các chất tan tuân theo định luật Lambert-Beer

Tác giả Rodrigo H.M.M Granja [20] và cộng sự đã phát triển phương pháp

sắc ký lỏng với detector UV để xác định 3 SAs trong mật ong Các SAs được chiết từ mật ong với diclometan sau khi được hòa tan với NaCl 30%, làm sạch qua cột chiết pha rắn Florisil Dịch rửa giải được phân tích trên hệ thống HPLC: cột C18 (4µm×3.9mm×150mm), pha động: Natri acetate 0,005mol/L, pH 4,5 (kênh A), metanol (kênh B), acetonitril (kênh C) theo chương trình gradient; detector UV tại bước sóng 280nm Giới hạn phát hiện lần lượt là: sulfathiazole: 3µg/kg, sulfamethazine: 4µg/kg và sulfadimethoxine: 5µg/kg Hiệu suất thu hồi lần lượt là: 61% (sulfathiazole), 94,5% (sulfamethazine) và 86% (sulfadimethoxine)

Tác giả W Hela [24] và cộng sự đã phát triển phương pháp HPLC với detector DAD để xác định 12 SAs trong thịt, gan, thận động vật (lợn, bò, gà) Mẫu được đồng nhất với acetonitril, loại béo với n-hexan, làm sạch qua cột chiết pha rắn trao đổi cation OASIS MCX Dịch rửa giải được bơm vào hệ thống HPLC-DAD: cột Phenomenex Luna C18 (250×2mm; 5µm) , pha động: amoni acetate 0,01M ; pH 4,6 (kênh A) và acetonitril (kênh B) theo chương trình gradient Detector DAD tại bước sóng 260nm Giới hạn phát hiện của phương pháp là 1ppb cho tất cả các SAs

Sử dụng bước sóng 270 nm phân tích trên đối tượng mẫu sữa bò tại Hàn Quốc nhóm nghiên cứu Hyun-Hee Chung, Jung-Bin Lee,Yun-Hee Chung [15] qua kiểm tra 269 mẫu sữa phát hiện có 21 mẫu nhiễm kháng sinh SAs Trong đó sulfamethazine lên tới 12ng/g vượt quá giới hạn cho phép

Nhóm tác giả Nancy T Malintan [18] xác định 8 SAs trên đối tượng mẫu nước tiểu của lợn tại Malaysian Mẫu được làm sạch, làm giàu bằng chiết qua cột

21

Oasis HLB, sau khi hoạt hóa cột bằng metanol, nước, tiến hành nạp mẫu và rửa tạp bằng nước, cuối cùng rửa giải chất bằng hỗn hợp amoniac và metanol Phương pháp phân tích có giới hạn định lượng 5 ppb Kết quả phân tích 300 mẫu có tới 103 mẫu nhiễm kháng sinh chủ yếu là sulfanilamide lên tới 500ppb

1.2.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng với detector huỳnh quang

Để tăng độ nhạy và độ chọn lọc, nhiều nghiên cứu đã sử dụng detector huỳnh quang, bằng cách cho chất phân tích tạo dẫn xuất có khả năng phát huỳnh quang Đây là phương pháp rất phổ biến để xác định các SAs trong giai đoạn trước đây Dẫn xuất huỳnh quang thường được sử dụng là Fluorescamine

Tác giả T.A Gehring và cộng sự [21] đã phát triển và thẩm định phương pháp xác định 14 SAs trong thịt cá trê, cá hồi và tôm Các SAs được tách ra khỏi nền mẫu bằng hỗn hợp dung dịch 0.2% acetic acid–metanol–acetonitril (85:10:5), chiết lỏng – lỏng với diclometan, làm sạch dịch chiết trên cột chiết pha rắn trao đổi cation mạnh SPE SCX Điều kiện sắc ký: Cột Symmetry C18, 3.5μm, 150mm×4.6mm; pha động: 2% acetic acid–metanol–acetonitril với chương trình gradient, dẫn xuất sau cột với fluorescamine và phát hiện với detector huỳnh quang tại λex = 400nm, λem = 495nm Hiệu suất thu hồi của các SAs nằm trong khoảng từ

67 – 90%

Tác giả G Stoev và cộng sự [13] đã phát triển phương pháp xác định định lượng 10 SAs trong thực phẩm có nguồn gốc động vật bằng sắc ký lỏng với detector huỳnh quang Các SAs được tách ra khỏi nền mẫu bởi sự chiết lỏng-lỏng, lần 1 với etyl acetate, lần 2 với acetone, và làm sạch thêm bởi sự chiết lặp 3 lần với nước-metylen clorid SAs được dẫn xuất trước cột với Fluorescamine, được tách trên hệ HPLC: cột (ODS-2 RP18 (250 × 4 mm, 5µm); pha động: kênh A (đệm phosphate 0,01M, pH 3,0), kênh B (acetonitril) với tỉ lệ 65/35 Detector huỳnh quang tại λex = 405nm, λem = 490nm Hiệu suất thu hồi trong khoảng 64-75%, giới hạn phát hiện là 1µg/kg cho sulfaquinoxaline và 0,5µg/kg cho các SAs còn lại

1.2.2.3 Phương pháp điện di mao quản

22

Đây là phương pháp tách các chất phân tích là các ion hoặc các chất không ion nhưng có mối liên hệ chặt chẽ với các ion trong một ống mao quản hẹp chứa đầy dung dịch đệm, đặt trong điện trường Do độ linh động điện di của các ion khác nhau, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau

Tác giả Ming-Ren S Fuh [17] và cộng sự đã phát triển phương pháp điện di mao quản vùng CE kết hợp với chiết pha rắn để chiết và định lượng 8 SAs trong thịt lợn, bò, gà Mẫu được đồng nhất với acetonitril, làm sạch lần một qua cột chiết pha rắn SPE Alumina, làm sạch lần hai qua cột chiết SPE HLB, dịch rửa giải được bay hơi, hòa cặn và xác định bằng điện di mao quản vùng: cột mao quản silica nung

chảy không phủ (80.5 cm × 50 µm i.d.; 72 cm to detector), pha động: đệm

phosphate 35mM, pH 6,5; thế: 25kV; detector UV tại 205nm Hiệu suất thu hồi từ

80 – 97% Giới hạn phát hiện cho mỗi SAs trong khoảng 5 - 10µg/kg Độ nhạy đáp ứng yêu cầu về MRLs theo qui định của liên minh Châu Âu EC

1.2.2.4 Phương pháp sắc ký khí kết nối với detector phát xạ nguyên tử (GC-AED)

Các SAs được tách trên hệ thống sắc ký khí và phát hiện bằng phổ phát

xạ nguyên tử Ứng dụng phương pháp này, tác giả B Chiavarino và cộng sự [11] đã phát triển phương pháp để xác định 9 SAs Các SAs được metyl hóa sử dụng diazomethane Điều kiện sắc ký khí: cột mao quản silica nung chảy 12.5 m × 30.22

mm, chương trình nhiệt độ: 75o

C trong 1 phút, tăng nhiệt độ lên 290oC, với bước tăng 20oC/phút, duy trì ở 290oC trong 5 phút Nhiệt độ tiêm mẫu 300o

C Detector AED với việc lựa chọn các nguyên tố: C, S, N

1.2.2.5 Phương pháp ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)

Hiện nay, ELISA được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như

y học, nông nghiệp và đặc biệt là trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lượng các sản phẩm sinh học Nguyên tắc chung đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme, thường

là một phương pháp nhạy phát hiện sulfamethoxazole tại nồng độ 15ppt Tuy nhiên,

có sự nhiễm chéo giữa sulfamethoxypyridazine, sulfachloropyridazine và sulfadimethoxine do bị ảnh hưởng bởi điều kiện môi trường phản ứng và các phản ứng cạnh tranh có thể gây ra hiện tượng âm tính hoặc dương tính giả Do vậy việc xác nhận lại các mẫu dương tính bằng LC-MS là rất cần thiết

1.2.2.6 Phương pháp sắc ký lỏng với detector khối phổ LC/MS/MS

Đây là một phương pháp nhanh, nhạy để xác định đồng thời các SAs Sau khi qua cột tách, chất phân tích được hóa hơi, các hợp chất hữu cơ trung hoà bị ion hoá thành các ion phân tử hay ion mảnh của phân tử mang điện dương hoặc âm, các gốc tự do Sau đó, các ion đựơc đưa sang bộ phận tách theo khối lượng Từ các tín hiệu thu được, dựa vào khối lượng ion phân tử, dựa vào đồng vị, dựa vào các mảnh ion phân tử, dựa vào cơ chế tách và dựa vào ngân hàng dữ liệu các ion và mảnh ion, người ta định tính và định lượng được chất phân tích một cách chính xác

Thomas S Thompson và Donald K Noot [22] đã ứng dụng và phát triển phương pháp sắc kí lỏng khối phổ để xác định dư lượng kháng sinh trong mật ong Quá trình chuẩn bị mẫu gồm có thủy phân acid để giải phóng liên kết đường với sulfonamid, sau đó lọc qua màng lọc và đem phân tích LC-MS/MS Điều kiện chạy máy pha động kênh A là acid formic 0,1% (v/v) trong nước, kênh B là acid formic 0,1% (v/v) trong acetonitril (ACN) và kênh C là trifluoroacetic 2% (v/v) trong acetonitril (ACN) Phương pháp có độ nhạy cao, giới hạn phát hiện (LOD) 0,5µg/kg, khoảng tuyến tính từ 5-100µg/kg, độ thu hồi nằm trong khoảng cho phép của cấp hàm lượng phân tích, sự lặp lại trong ngày có độ thu hồi trong khoảng RSD

± 12%, trong các ngày khác nhau có RSD ± 17,2% Tính toán hàm lượng của SAs bằng phương pháp thêm chuẩn có sử dụng nội chuẩn sulfachloropyridazine Ngoài

24

định tính chất bằng thời gian lưu thì ưu điểm của phương pháp là xác nhận chính xác chất bằng sự phân mảnh phổ, mảnh pic đặc trưng cho cấu trúc SAs là mảnh có m/z 156 [NH2C6H4SO2]+ dùng để định lượng

Trong nghiên cứu nồng độ của dung dịch đệm, thành phần pha động, loại ion hóa để tách và xác định SAs tồn dư trong thịt bò tác giả Dal-Ho Kim và Dai Woon Lee [13] cũng dùng phương pháp LC-MS Tác giả khảo sát nguồn ion hóa hóa học

áp suất khí quyển (Atmospheric pressure chemical ionization APCI) và nguồn ion hóa phun electron (Electrospray ionization-ESI) Khi dùng CH3COONH4 làm đệm thì ion hóa áp suất khí quyển cho phản ứng tốt hơn, theo tác giả nếu sử dụng dung dịch đệm là acid acetic thì dùng nguồn ESI thay thế APCI, chế độ ESI sự proton hóa các ion SAs dễ dàng xảy ra trong điều kiện dung dịch acid Mặt khác nguồn APCI ion H3O+ và NH4+ có thể được tạo thành từ dung môi, dung dịch đệm và cation nitrogen do sự phóng điện khí N2, vì vậy mà ion H3O+ và NH4+ trong pha khí

dễ dàng proton SAs, nồng độ của CH3COONH4 lựa chọn là 0,05M có (pH 6-7) trong nước chứa 13-15% acetonitril Xác định hàm lượng SAs bằng phương pháp thêm chuẩn cấp hàm lượng 75ng/g với nội chuẩn 13C6-sulfamethazine kết hợp chiết lỏng-lỏng bằng acetonitril và chiết pha rắn (Solid phase extraction SPE)

Tại bộ môn khoa học thực phẩm và dinh dưỡng trường đại học Zhejiang, Hangzhou, Trung Quốc tác giả Zengxuan Cai và cộng sự [26] đã sử dụng phương pháp sắc kí lỏng siêu hiệu năng kết nối khối phổ (Ultral performan liquid chromatography tandem mass spectrometry UPLC-MS/MS) xác định kháng sinh SAs trong thịt Mẫu thịt được chiết bằng acetonitril và loại chất béo bằng n-hexan, chiết lỏng-lỏng bằng ethyl acetate, phương pháp đã tách 24 SAs trong 15 phút thông qua theo dõi nguồn ion hóa phun electron ESI+

. Đường chuẩn được xây dựng trên nền mẫu thực để loại trừ các ảnh hưởng nền mẫu trong quá trình ion hóa, phương pháp có hệ số tương quan tuyến tính tốt R2

= 0,991-0,999 và khoảng tuyến tính rộng từ 0,2-50ng/g, độ thu hồi đạt 67,8-113,9% cho tất cả sulfonamid Trong phương pháp này tác giả đã khảo sát và lựa chọn cột C18 (2,1mm × 100mm × 1,7µm), hai kênh pha động sử dụng là acid formic 0,2% (v/v) trong nước và acid formic 0,2%

25

(v/v) trong metanol Hàm lượng acid formic trong pha động có thể cải thiện hiệu quả ion hóa, tuy nhiên lại ảnh hưởng tới phân tách sắc kí Kết quả phân tích 240 mẫu thịt được mua từ các công ty, xác định tổng SAs trong thịt có hàm lượng lớn hơn 5µg/kg có 40 mẫu (xấp xỉ 15%), có 9 mẫu (xấp xỉ 3,75%) có chứa hàm lượng vượt giới hạn cho phép 100µg/kg Sulfamethazine có hàm lượng cao nhất được tìm thấy trong mẫu lên tới 774,9µg/kg, sulfanilamide có nồng độ 5,9µg/kg, sulfamethoxazole 78,3µg/kg, sulfamethazine 14,8µg/kg trong cùng một mẫu

Năm 2011 tác giả Huan Yu và các cộng sự [16] đã nghiên cứu phương pháp chiết lỏng-lỏng, 5g mẫu được chiết bằng acetonitril, dịch chiết được thổi khô bằng khí N2, hòa cặn bằng 10ml acid acetic 2% (v/v) trong nước, sau đó làm sạch bằng chiết pha rắn dùng cột HLB, sử dụng metanol và nước để hoạt hóa và rửa tạp, cuối cùng rửa giải bằng metanol, xác định 18 SAs bằng HPLC-UV tại bước sóng 285 nm trong thời gian 60 phút, sau đó xác nhận lại trên sắc ký LC-MS/MS tứ cực với chương trình gradient hai kênh pha động là acid formic trong nước và ACN, chế độ ion hóa phun điện tử ESI ở chế độ dương trong 30 phút Phương pháp có độ nhạy cao, giới hạn phát hiện 3 ppb và giới hạn định lượng 10 ppb, độ thu hồi đạt 71,1%-118,3%

Bằng sự tương tác trực tiếp chiết pha rắn phân tán cột C18-Silica với sắc ký lỏng khối phổ chế độ bẫy tứ cực nhóm tác giả Yanbin Lu, Quing Shen [25] tiến hành đồng nhất 0,6g C18 đã được hoạt hóa bằng 2ml ACN và làm khô chân không với 0,2g mẫu sau đó làm khô tại nhiệt độ phòng, tất cả chuyển vào ống chiết và nút chặt, tiến hành chiết trực tiếp khuôn pha rắn phân tán (MSPD-matrix solid-phase dispersion) dùng 5ml ACN/nước (v/v 1:1) để chiết SAs với tốc độ dòng 1ml/phút trong 5 phút, dịch chiết được chuyển vào cột phân tách, chế độ rửa giải gradient bao gồm acid acetic 0,1% (v/v) trong nước và acetonitril Phương pháp này đã xác định được 13 SAs chỉ trong 7 phút với độ nhạy cao, LOQ từ 2-10 ppb, phương pháp đạt

độ thu hồi tốt RSD < 13% Phân tích trên mẫu cá trắm phát hiện 4 mẫu nhiễm với tổng SAs là 124,6ng/g, 6 mẫu nhiễm sulfamethazine, sulfameter với tổng là 48,8ng/g

và đặc biệt rất an toàn đối với con người và môi trường Trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật này

Tác giả George Stubbings và cộng sự [14] đã ứng dụng kỹ thuật QuEChERS

và phương pháp sắc ký lỏng khối phổ để phát triển và thẩm định phương pháp phân tích dư lượng 30 thuốc thú y (bao gồm các nhóm: nitroimidazoles, sulphonamides, fluoroquinolones, quinolones, ionophores and dinitrocarbanilide) trong thịt gia súc, gia cầm Các kháng sinh trong mẫu được chiết vào dung môi ACN chứa 1% acid acetic, loại nước với Na2SO4 khan, ly tâm Dịch chiết được làm sạch trong ống dSPE chứa 500mg chất hấp thụ NH2 và định lượng trên hệ thống sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS: cột sắc ký Synergi Fusion-RP Phenomenex (100mm × 2mm × 2.5µm), pha động: kênh A (nước chứa 0,1% acid formic), kênh B (ACN chứa 0,1% acid formic), kênh C (metanol chứa 0,1% acid formic) theo chương trình gradient

Tác giả đã thẩm định phương pháp theo hướng dẫn tại Council Directive 96/23/EC

với các thông số: độ thu hồi, hệ số biến thiên CV%, CCα, CCβ đạt yêu cầu theo qui định

Cũng ứng dụng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ và kỹ thuật chiết QuEChERS, tác giả Renata Pereira Lopes và cộng sự [19] đã phát triển và thẩm định phương pháp phân tích 13 SAs trong thức ăn chăn nuôi Sau khi tìm được điều kiện chiết tối ưu (dung môi chiết acid acetic 1% trong ACN : MeOH = 75/25, 200mg PSA), tác giả đã tiến hành thẩm định phương pháp theo hướng dẫn tại European Commission Decision 2002/657/EC tại các cấp độ 25, 50, 75µg/kg Các kết quả thẩm định thu được như sau: độ tuyến tính (0,9864 < R2

< 0,9993), giới hạn

27

phát hiện (50,4 µg/kg < CCα < 55,8 µg/kg), khả năng phát hiện (50,7 µg/kg <CCβ

< 55,8 µg/kg), giới hạn định lượng (0,9 µg/kg < LOQ < 7,1 µg/kg), hiệu suất thu hồi 86,0 – 106,8, độ lặp CV% 3,6 – 19,5%

Các phương pháp: sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC (detector UV, huỳnh quang); điện di (CE); sắc ký khí GC thường khá phức tạp và kém chính xác do ảnh hưởng của nền mẫu Chúng tôi lựa chọn phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS để xác định các SAs trong thịt gia súc, gia cầm Phương pháp có độ nhạy, độ chọn lọc và độ chính xác cao

28

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu

Vấn đề tồn dư kháng sinh trong thực phẩm đang đặt ra cho cơ quan thanh tra, kiểm tra thực phẩm cần có phương pháp xác định nhanh, chính xác trên địa bàn rộng đảm bảo an toàn và sức khỏe người tiêu dùng Phù hợp với thực tiễn, chúng tôi tiến hành xác định dư lượng một số kháng sinh nhóm SAs bao gồm (sulfisomidine-SIM, sulfadiazine-SD sulfathiazole-STZ, sulfapyridine-SP, sulfamerazine-SM, sulfamonomethoxine-SMM, sulfachloropyridazine-SCP, sulfamethoxazole-SMX, sulfisoxazole-SSA, sulfadimethoxine-SDM, và sử dụng nội chuẩn sulfadimethoxine-d4) trong thịt gia súc gia cầm bằng sắc ký lỏng ghép nối khối phổ LC-MS/MS

 Mục tiêu tiến hành nghiên cứu của đề tài:

 Tối ưu các điều kiện chạy máy LC-MS/MS để tách và xác định các SAs

 Khảo sát, tối ưu hóa quá trình xử lý mẫu

 Tiến hành phân tích trên một số mẫu thực tế

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Nhóm SAs là hợp chất trong phân tử có chứa nhóm (-SO2NH2-) phân cực nếu dùng phương pháp sắc ký khí thường píc sẽ bị kéo đuôi, chất phân tích cần phải được dẫn xuất hóa chuyển về dạng hợp chất dễ bay hơi và bền nhiệt, trang thiết bị đắt tiền, mặt khác nhóm kháng sinh này phù hợp với tách bằng sắc ký lỏng Do vậy, chúng tôi tiến hành xác định dư lượng 10 kháng sinh nhóm SAs trong thịt gia súc gia cầm bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) Đây là phương pháp hiện đại, có độ nhạy và độ chính xác cao Cơ sở lý thuyết của phương pháp được tóm tắt như sau

2.2.1 Nguyên tắc chung của sắc ký lỏng

Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn hoặc chất lỏng và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn, lỏng-lỏng) Mẫu phân tích

29

được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau [10]

2.2.1.1 Pha tĩnh trong sắc ký lỏng [3]

Trong LC, pha tĩnh (stationary phase) chính là chất nhồi cột làm nhiệm vụ tách hỗn hợp chất phân tích Đó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ, từ 3-7µm Tuỳ theo bản chất của pha tĩnh, trong phương pháp sắc ký lỏng pha liên kết thường chia làm 2 loại: sắc ký pha thường (NP-HPLC) và sắc ký pha đảo (RP-HPLC) Khi dùng chất nhồi cột có cỡ hạt nhỏ hơn đường kính hạt 1,7 µm, chịu được áp suất cao lên tới 700 atm làm tăng độ phân giải và giảm thời gian phân tích

đó là những ưu điểm của sắc ký lỏng UPLC (Ultra Performance Liquid Chromatography)

Loại thứ hai là các dung môi ít phân cực như cychlorpentan, pentan, heptan, n-hexan, 2-chloropropan, cacbondisulfua (CS2), CCl4, toluene…Tuy nhiên pha động một thành phần đôi khi không đáp ứng được khả năng rửa giải, người ta thường phối hợp 2 hay 3 dung môi để có được dung môi có độ phân cực từ thấp đến cao phù hợp với phép phân tích Sự thay đổi thành phần pha động đôi khi diễn ra theo thời gian, trường hợp này người ta gọi là chương trình rửa giải gradient

n-2.2.1.3 Detector trong HPLC [4]

30

Detector là bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phương pháp Đối với chất phân tích là các SAs trong cấu trúc phân tử hợp chất thơm, có các liên kết bội giữa C, H, S, O do đó có khả năng hấp thụ tia UV có thể dùng để xác định nhóm chất này Dựa trên sự phát triển detector UV có thể so sánh phổ và định danh phổ người ta thường dùng detector diod array có độ nhạy cao hơn Ngoài ra nhóm amin bậc 1 trong phân tử có thể tạo dẫn xuất với hợp chất flourescamine cho sản phẩm phát huỳnh quang nên có thể dùng detector huỳnh quang để xác định

Hiện nay, detector có thể cung cấp thông tin định tính, định lượng và cấu trúc của các chất phân tích là detector khối phổ

2.2.2 Detector khối phổ ( Mass spectrometry - MS)

2.2.2.1 Nguyên tắc

Khối phổ (Mass spectrometry – MS) là dựa vào chất nghiên cứu được ion hóa trong pha khí hoặc pha ngưng tụ dưới chân không cao, tạo thành các ion có số khối khác nhau, các ion này được phân tách thành các mảnh theo tỉ số khối trên điện tích (m/z) [6, 8] Các ion này có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích như loại bỏ electron, proton hóa Các ion tạo thành theo tỉ số m/z và phát hiện từ đó cho thông tin về khối lượng hay cấu trúc phân tử của hợp chất

Bơm chân không

Hình 2.1: Sơ đồ khối của khối phổ kế Cấu tạo của thiết bị khối phổ gồm 3 bộ phận chính: nguồn ion, thiết bị phân tích và detector Các mẫu được ion hóa trong nguồn ion sau đó đưa vào bộ

Ion hóa Phân tách

khối

Thu nhận ion

Xử lý dữ liệu

Nạp mẫu

31

phận phân tích khối để tách các ion theo tỉ số m/z, các tín hiệu thu được sẽ chuyển vào máy tính xử lý và lưu trữ

Ưu điểm của phương pháp là:

 Giúp phát hiện hầu hết các chất tan

 Độ nhạy cao

 Có thể giúp xác định được các chất tan ngay khi độ phân giải chưa tốt

 Hữu hiệu cho nghiên cứu các hợp chất

 Cung cấp đầy đủ thông tin về cấu trúc và khối lượng [4]

2.2.2.2 Bộ nguồn ion (Ion sources)

Chất phân tích ra khỏi cột sắc ký ở dạng lỏng, khó khăn lớn nhất ở đây là phải chuyển chất phân tích từ pha lỏng sang pha hơi Theo kỹ thuật ion hoá của LC/MS, năng lượng của máy trực tiếp tác động vào pha lỏng hoặc rắn để tạo thành ion ở thể hơi Trong máy khối phổ, có rất nhiều cách để ion hoá phân tử và nguyên

tử của mẫu ở trạng thái khí hoặc hơi Sau đây là một số kỹ thuật thường dùng:

a) Ion hóa bằng dòng electron (Electron Ionization – EI):

Trong phổ EI-MS, dòng electron có năng lượng cao được phát ra từ sợi dây catot vonfram hoặc reni được đốt nóng sinh ra dòng electron chuyển động vuông góc với mẫu về phía anot xảy ra sự va chạm biến các mẫu thành các ion phân tử hoặc ion mảnh Thông thường các hợp chất hữu cơ có thế ion hóa nằm trong khoảng 8 eV đến

15 eV nhưng để đạt được hiệu quả cao thường áp dụng dòng 70 eV

ABC + e → ABC+● + 2e (1) (ion phân tử) ABC+● → A+ + BC● (2) (ion mảnh, gốc tự do, mảnh trung hòa)

ABC+● → A+ + B +C●

Ưu điểm: áp dụng cho phân tử nhỏ, cho cơ sở dữ liệu phổ Tuy nhiên, một số hợp chất dễ phân mảnh thì thời gian sống ngắn, nhiều mảnh nhỏ hay ít hoặc không thu được ion phân tử và đòi hỏi hợp chất phải dễ bay hơi

32

b) Chế độ ion hóa phun điện tử (Electrospray Ionization- ESI)

Nguyên tắc: biến đổi ion ở thể lỏng thành ion ở thể hơi, dung dịch mẫu được dẫn vào điện trường mạnh và duy trì ở hiệu điện thế cao 4kV Tại đây, dung dịch mẫu

bị chuyển thành các giọt nhỏ tích điện và được hút tĩnh điện tới lối vào của bộ phân tích khối phổ Các giọt tích điện trước khi vào bộ phân tích khối phổ sẽ kết hợp với dòng khí khô để làm bay hơi hết dung môi

Hình 2.2: Chế độ ion hóa phun điện tử ESI

Ưu điểm của ESI là có hai chế độ bắn phá: bắn phá chế độ ion dương và ion

âm, ESI-MS thích hợp cho cả phân tử có phân tử khối nhỏ (khoảng 100-150 amu) cũng như phân tử khối lớn của các phân tử sinh học, các hợp chất khó bay hơi, không bền nhiệt, phân cực và không phân cực

c) Chế độ ion hóa hóa học áp suất khí quyển (Atmospheric Presure Chemical Ionization-APCI)

Sự ion hóa trong APCI phụ thuộc vào sự va chạm của dòng ion dương hay

âm với phân tử, mẫu bị ion hóa bởi phản ứng với các ion được tạo ra từ các chất khí như methan (ở dạng CH5+), amoniac (ở dạng NH4+)

Khi sử dụng khí methan làm chất khí phản ứng ta có các quá trình ion hóa như sau:

Quá trình 1:

CH4 + e → CH4+● + CH3+ + CH2+

CH4+● + CH4 → CH5+ + CH3●

33

CH3+ + CH4 → C2H5+ + H2Quá trình 2: ion mảnh va chạm trực tiếp với phân tử mẫu

CH5+ + M → CH4 + (MH)+ (chuyển proton thành dương m/z = M+1)

C2H5+ + M → (MH)+ + C2H4 (chuyển proton thành dương m/z = M+1)

C2H5+ + M → (MC2H5)+ (thêm ái lực điện tử thành dạng m/z = M+29)

C2H5+ + M → (M-H)+ (hydrua chuyển thành dạng m/z = M-1)

Sự thay đổi chất khí trong phản ứng APCI-MS cho phép thay đổi tính chọn lọc của sự ion hóa và mức độ phân mảnh Đây là phương pháp có độ nhạy cao cho phép phân tích định lượng ở mức picomol tới femtomol, thích hợp cho những chất

có phân tử khối 1000 đơn vị nhưng đòi hỏi chất phân tích phải dễ dàng bay hơi

2.2.2.3 Bộ phân tích khối phổ (analyser)

Bộ phân tích được coi là quả tim của máy khối phổ, có nhiệm vụ tách các ion

có trị số m/z khác nhau thành từng phần riêng biệt Một số bộ phân tích khối phổ thông thường

- Bộ phân tích tứ cực

- Bộ phân tích thời gian bay

a) Bộ phân tích tứ cực (Quadrupole analyser)

Nguyên tắc: tạo ra một trường tần số vô tuyến biến đổi (trường tứ cực).Bộ phân tích tứ cực bao gồm 2 loại: Bộ phân tích tứ cực đơn, bộ phân tích tứ cực chập

ba

bằng kim loại đặt song song và theo hướng của chùm ion Trường tĩnh điện được tạo ra do thế một chiều (DC) và tần số radio (RF) được đặt vào các thanh Các tứ cực như bộ lọc khối, khi có điện trường thì ion chuyển động trong nó sẽ dao động

34

phụ thuộc vào tỉ số m/z và từ trường RF Chỉ những ion phù hợp mới đi qua bộ lọc này

khối bao gồm ba bộ tứ cực ghép nối với nhau Ion sinh ra được tập trung và gia tốc bằng hệ quang học ion để đưa vào bộ phân tích khối Tại bộ phân tích khối, tứ cực thứ nhất sẽ lọc ion mẹ có m/z xác định, các phân mảnh của ion này được tạo ra tại buồng va chạm (collision cell) nhờ tương tác với khí trơ và được phân tích bằng tứ cực thứ ba Đây là kỹ thuật phân tích khối phổ hai lần (MS/MS)

Hình 2.3: Cấu tạo của bộ phân tích khối tứ cực MS/MS

Kỹ thuật MS một lần có nhược điểm là không nghiên cứu được cơ chế phân mảnh, sự khác biệt giữa các đồng phân, chịu ảnh hưởng rõ rệt của nền mẫu chất phân tích, trên phổ đồ chỉ cho thấy ion phân tử Kỹ thuật MS/MS không chỉ khắc phục được những nhược điểm trên mà còn tăng độ nhạy phân tích tới hàm lượng femtogram, tăng độ chính xác của kết quả phân tích, loại bỏ ảnh hưởng của nền mẫu Hệ MS/MS là hệ hai máy khối phổ độc lập được nối với nhau cách nhau buồng va chạm (Collision Cell)

b) Bộ phân tích thời gian bay (Time of flight analyser – TOF)

Các ion ra khỏi buồng ion hoá được gia tốc nhờ thế 10-20 kV bay qua một ống phân tích (không có trường điện từ) có chiều dài đến 2m với cùng động năng Tuy nhiên, tùy thuộc vào tỉ số m/z mà các ion có tốc độ khác nhau tới detector Thời gian bay hết ống này đến detector tỷ lệ thuận với m z của các ion Các ion sẽ

2.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng trong nghiên cứu

2.3.1 Thiết bị và dụng cụ

 Thiết bị

- Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ khối phổ LC/MS/MS bao gồm: HPLC 20 AXL

của Shimadzu và khối phổ ABI 5500 QQQ của Aplied Biosystem: bộ phận bơm dung môi, bộ loại khí, bộ phận điều nhiệt và detector MS

- Dung dịch chuẩn gốc 100 µg/ml: cân chính xác 0,01g từng chất chuẩn trên cân phân tích có độ đọc 0,0001g, hòa tan và định mức 100ml bằng metanol Bảo quản trong tủ lạnh 40C, sử dụng trong 1 năm

- Dung dịch chuẩn đơn trung gian (10 µg/ml): hút 1ml dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 10ml, pha loãng và định mức đến vạch bằng metanol

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian (1000 ng/ml): hút 1ml mỗi chuẩn đơn trung gian (10 µg/ml) vào bình định mức 10ml, pha loãng và định mức đến vạch bằng metanol

- Pha loãng dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian 1000 ng/ml trong metanol để thu được các dung dịch chuẩn làm việc nồng độ 0,5; 1; 2; 5; 10; 25; 50; 100; 200; 500 ng/ml

- Dung dịch nội chuẩn (IS) gốc nồng độ 1000 µg/ml được chuẩn bị bằng cách hút chính xác 1ml metanol cho vào lọ chứa 1mg IS

- Dung dịch nội chuẩn làm việc 1000 ng/ml: hút 100µl IS gốc 1000 µg/ml vào bình định mức 100ml và định mức bằng metanol Bảo quản trong tủ lạnh

40C

 Các loại hóa chất, dung môi khác

- Metanol (Merck 99,9%), Acetonitril (Merck 99,9%), acid formic (Merck 98%), acid acetic băng (Merck)…

- Chuẩn bị pha động để khảo sát là acid formic trong nước các nồng độ 0%; 0,05%; 0,1%; 0,15%; 0,2% (v/v)

37

2.4 Lấy mẫu

phủ tạng

phần còn lại sau xử lý mẫu bảo quản ở -20 o C

38

3.1 Tối ưu điều kiện tách và xác định Sulfonamid trên thiết bị LC/MS/MS

3.1.1 Tối ưu các điều kiện của detector khối phổ (MS)

Các chất thuộc nhóm sulfonamid có khối lượng phân tử và độ phân cực trung bình Qua tham khảo một số tài liệu [25, 26], chúng tôi tiến hành khảo sát xác định các SAs bằng kĩ thuật ion hóa phun điện tử ESI với chế độ bắn phá ion dương

3.1.1.1 Tối ưu hóa điều kiện phân mảnh của từng chất (Compound Optimization)

Trong kỹ thuật ion hóa phun điện tử với chế độ bắn phá ion dương, các ion

mẹ có dạng (M+H) Detector được sử dụng trong nghiên cứu này là khối phổ hai lần, do đó để phát hiện đúng chất phân tích thì việc chọn được ion con là rất quan trọng Với hệ thống Tripquards 5500, điều kiện phân mảnh của từng chất được tối

ưu hóa tự động Cố định các thông số của nguồn và khí như sau:

- Thế phun điện tử: 5,5 kV

- Nhiệt độ đầu phun (IS): 55000C

- Nhiệt độ mao quản (TEM): 350oC

- Khí màn (CUR): 35 psi

- Khí va chạm (CAD): 7 eV

- Nguồn khí ion 1 (GS1): 25 psi

- Nguồn khí ion 2 (GS2): 10 psi

- Thế phân nhóm (DP): 80 eV

- Thế đầu vào (Entrance Potential) (EP) 10 eV

39

Dùng xilanh 500 μL, bơm từng chuẩn SAs 20 ng/ml trực tiếp vào detector khối phổ, xác định các giá trị DP, CE, CXP và lựa chọn 2 ion con có cường độ tín hiệu cao nhất để định tính và định lượng

mảnh

STT Ion mẹ Ion con DP (eV) CE

(eV)

CXP (eV)

o Quét 2 mảnh cho cường độ tín hiệu cao nhất

o Thế phân nhóm (Declustering Potential-DP) trong khoảng từ 80 đến 110 (eV) với bước quét (step) là 5 (eV)

o Khí va chạm (CAD) trong khoảng từ 5 đến 10eV bước quét là 1eV

o Khí màn (CUR) trong khoảng 15 psi đến 35 psi với bước quét là 5 psi

o Nhiệt độ mao quản (TEM) khảo sát từ 250 0 C đến 350 0 C với bước tăng

50 0 C

o Nhiệt độ đầu phun (IS) từ 4000 o C đến 5500 o

C với bước tăng 500 o C

o Nguồn khí ion hóa 1 (GS1) từ 15 psi đến 30 psivới bước tăng 5 psi

o Nguồn khí ion hóa 2 (GS2) từ 0 psi đến 10 psi với bước tăng 5 psi

o Thể tích tiêm mẫu 10µl

o Tổng tốc độ dòng 0,5 ml/phút