PHƯƠNG PHÁP xác ĐỊNH VIBRIO và hàm LƯỢNG AMONI TRONG mẫu nước

Một số loài vi khuẩn Vibrio gây bệnh cho động vật thủy sản và người Có 4 loài vi khuẩn Vibrio gây bệnh cho người: V.cholerae, V.vulnificus, V.parahaemolyticusvà V.alginolyticus được phân

VIỆN SINH NÔNG



BÁO CÁO RÈN NGHỀ

PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VIBRIO VÀ HÀM LƯỢNG AMONI

TRONG MẪU NƯỚC

Giảng viên hướng dẫn : TS Đỗ Mạnh Hào Sinh viên thực hiện: : Hoàng Thị Thanh Nga Lớp : Công nghệ Sinh học K13 Địa điểm thực tập : Trạm nghiên cứu biển Đồ Sơn,

Viện Tài nguyên và Môi trường Biển

Hải Phòng, tháng 9 năm 2015

PHẦN 1: GIỚI THIỆU

Vi khuẩn Vibrio là một trong những tác nhân gây ngộ độc cho thủy sản đáng lo ngại nhất hiện nay Thủy sản như cá bị nhiễm bệnh thường bỏ ăn, chết rải rác, bụng trương to, thức ăn không tiêu Cá hoạt động kém, bơi chậm chạp, màu sắc cá chuyển từ màu nâu sang xám đen Bệnh xuất hiện nhiều ở cá giống

và giai đoạn nuôi cá thương phẩm mật độ cao, khi nước bị nhiễm bẩn Vì vậy khi nuôi cá ở giai đoạn làm giống, cần phân tích mẫu nước để xác định ra vi khuẩn gây bệnh Vibrio anguillarum.

Amoni không gây độc trực tiếp cho con người, động thực vật nhưng sản phẩm chuyển hoá từ amoni là nitrit và nitrat là yếu tố gây độc Các hợp chất nitrit hình thành do quá trình oxi hoá của vi sinh vật trong quá trình xử

lý, tàng trử và chuyển tải nước đến con người và nhiều loài động thực vật nói chung và làm giảm năng suất nuoi trồng thủy sản nói riêng Vì vậy việc xử lý amoni trong nước là đối tượng rất đáng quan tâm

PHẦN 2: TỔNG QUAN

2.1 Tổng quan về Vibrio

2.1.1 Đặc điểm của vi khuẩn Vibrio

Một số đặc điểm của nhóm vi khuẩn Vibrio spp và khả năng gây bệnh trên

động vật thủy sản:

- Giống : Vibrio

- Họ : Vbrionales

- Lớp: Gammaproteobacteria

- Ngành : Proteobacteria

Đặc điểm chung của các loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio là Gram âm,

hình que thẳng và hơi uốn cong, kích thước 0,3-0,5×1,4-2,6µm, chúng không hình thành bào tử hoặc chuyển động nhờ một tiên mao hoặc nhiều tiên mao mảnh

Tất cả chúng đều yếm khí không bắt buộc ( tùy nghi) và hầu hết là oxy hóa

và lên men trong môi trường O/F Glucose TCBS agar là môi trường chọn lọc

của Vibrio Hầu hết các loài đều phát triển trong môi trường nước biển cơ bản, Na+ kích thích cho sự phát triển của tất cả các loài Vibrio và nhiều loài là nhu

cầu tuyệt đối, chúng không phát triển trong môi trường không muối NaCl, không sinh H2S Cơ bản chúng đều sống trong môi trường nước, đặc biệt là nước biển

và cửa sông, liên quan đến động vật biển và một số loài là tác nhân gây bệnh cho người và động vật biển

Ngoài ra nhóm Vibrio còn có đặc điểm là di động, cho phản ứng dương

tính với catalase và oxydase, là vi khuẩn gram âm, hình que, có khả năng lên men trong cả hai trường hợp hiếu khí và kỵ khí, tạo nitrit từ nitrat, là nhất là nhạy nhất với hợp chất 2,4-diamino-6,7-diisopropyl pteridine(O/129,150µm) là hợp chất

giúp phân biệt vi khuẩn Vibrio và Aeromonas Các vi khuẩn phát sáng đều phát

triển tốt trên môi trường có 3%NaCl, sinh indol và tạo axit từ mannitol và trehalose

2.2.2 Một số loài vi khuẩn Vibrio gây bệnh cho động vật thủy sản và người

Có 4 loài vi khuẩn Vibrio gây bệnh cho người: V.cholerae, V.vulnificus,

V.parahaemolyticusvà V.alginolyticus được phân lập dựa trên các đặc điểm sau:

- V.cholerae có phản ứng oxidase (+), tăng trưởng được trong môi trường

canh Trypton ở 42oC, arginine dehydrolase(-), lysine dehydrolase(+), lên men được sucrose, khử nitrat thành nitrite, có thể tăng trưởng được trong môi trường chứa 6,8,10%

- V.parahaemolyticus có phản ứng oxidase(+), phát triển được trong trypton ở

24oC, phản ứng ADH(-), LDC(+), có khả năng phản ứng nitrate thành nitrite nhưng không lên men sucrose, sử dụng được một số nguồn carbohydrate khác để lên men nhưng không sinh hơi, không tăng trưởng được trong môi trường không

có muối, tăng trưởng tốt trong môi trường có đến 8% muối nhưng bị ức chế trong môi trường chứa 10% muối

- V.vulnificus khác với hai loài trên là không lên men sucrose, không tăng

trưởng được trong môi trường không có muối, bị ức chế trong môi trường có 8-10% muối

- V.alginolyticus có khả năng lên men đường sucrose, không tăng trưởng được

khi trong môi trường không có muối nhưng có thể phát triển trong môi trường chứa đến 10% muối

Vibrio gây bệnh cho động vật thủy sản gồm:

- Vibrio spp thường gây bệnh ở động vật thuỷ sản nước mặn và nước ngọt:

cá, giáp xác, nhuyễn thể Những vi khuẩn này thường là tác nhân cơ hội, khi động vật thuỷ sản sốc do môi trường biến đổi xấu hoặc bị nhiễm các bệnh khác

như virus, nấm, ký sinh trùng Động vật thuỷ sản yếu không có sức đề kháng, các

loài vi khuẩn Vibrio spp cơ hội gây bệnh nặng làm động

vật thuỷ sản chết rải rác tới hàng loạt

- Vibrio alginolyticus: Bệnh đỏ dọc thân ở ấu trùng tôm, bệnh đỏ thân và ăn

mòn vỏ ki tin ở tôm, bệnh xuất huyết ở cá biển

- Vibrio anguillarum: bệnh đỏ thân và ăn mòn vỏ ki tin ở tôm, bệnh xuất

huyết ở cá

- Vibrio harveyi: Bệnh phát sáng, đỏ thân và ăn mòn vỏ kitin ở giáp xác.

- Vibrio parahaemolyticus: Bệnh phát sáng, đỏ thân và ăn mòn vỏ kitin ở

giáp xác

- Vibrio vulnificus: Bệnh đỏ thân và ăn mòn vỏ kitin ở giáp xác, bệnh xuất

huyết ở cá biển

- Vibrio ordalii: Bệnh đỏ thân và ăn mòn vỏ kitin ở giáp xác, bệnh xuất

huyết ở cá biển

- Vibrio salmonicida: Bệnh Hitra ở cá.

2.2 Tổng quan về amoniac

Amoniac tồn tại trong nước ở 2 dạng: NH3 và NH4+ hay còn gọi là tổng amoniac (TAN) Trong đó, amoni ở dạng khí (NH3) có mức gây độc cao hơn so với dạng ion (NH4+) do xâm nhập trực tiếp vào cơ thể qua đường mang và tấn công thẳng vào tế bào của động vật thủy sản Không giống như người và động vật, cá và giáp xác không có khả năng bài tiết cũng như chuyển hóa ammonia thành dạng ít độc Do đó , các động vật thủy sản thường bị ngộ độc amoniac khi

ở nồng độ cao

PHẦN 3: PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VIBRIO VÀ HÀM

LƯỢNG AMONI TRONG MẪU NƯỚC

3.1 Phương pháp xác định vi khuẩn Vibrio trong nước

Xác định Vibrio bằng phương pháp sinh hóa truyền thống

a. Tăng sinh chọn lọc

- Chuẩn bị mẫu nước sau đó cấy mẫu nước vào môi trường tăng sinh là môi trường canh thang tăng sinh chọn lọc( dùng nước pepton kiềm chứa 1% muối

NaCl cho trường hợp V.cholerae, V.vulnificus, V.alginolyticus, canh Colistine cho trường hợp V.parahaemolyticus)

- Sau đó ủ ở 37oC trong 6-8 giờ

b. Phân lập

- Dùng que cấy vòng ria váng trên bề mặt môi trường tăng sinh chọn lọc lên

bề mặt đĩa thạch TCBS để phân lập khuẩn lạc đơn, ủ 37oC trong 18-22 giờ

- Hình dạng khuẩn lạc đặc trưng của các loài Vibrio trên môi trường này là như sau:

Khuẩn lạc V.cholerae và V.alginolyticus lớn đường kính khoảng 2-3mm, láng,

có màu vàng, hơi phẳng, tâm đục và chung quanh khuẩn lạc có quầng trắng đục

Khuẩn lạc V.parahaemolyticus và V.vulnificus lớn, đường kính khoảng

3-4mm, có màu từ xanh đến xanh dương

3.2 Cách tiến hànhxác định vi khuẩn Vibrio trong nước

1. Chuẩn bị mẫu phân tích

a. Lấy mẫu

- Địa điểm lấy mẫu: Đồ Sơn

- Dụng cụ mang lấy mẫu gồm có lọ đựng mẫu nước đã qua khử trùng

- Trước khi lấy mẫu ta chọn bể cá nào có hoạt động cung cấp nước từ ngoài vào, bể nuôi cá có tỉ lệ những con cá phát triển không đông đều về kích thước và

số lượng

b. Chuẩn bị mẫu nước

- Lắc đều chai mẫu nước ta được hệ số pha loãng 100.

- Dùng pipet chuyển 1ml mẫu nước vào ống nghiệm thứ nhất, dùng máy trộn lắc đều ta được hệ số pha loãng 10-1

- Tiếp tục chuyển 1ml mẫu từ ống nghiệm có hệ số pha loãng 10-1, dùng máy trộn lắc đều ta được hệ số pha loãng 10-2

- Tiếp tục chuyển 1ml mẫu từ ống nghiệm có hệ số pha loãng 10-2, dùng máy trộn lắc đều ta được hệ số pha loãng 10-3, rồi pha 10-4

- Mẫu nước còn lại đem bảo quản trong tủ lạnh để giữ mẫu

2. Nuôi cấy vi khuẩn

a. Cấy mẫu

- Dùng pipet hút 0,1ml ở từng nồng độ nhỏ vào giữa đĩa petri sau đó dùng que cấy

đã khử trùng rồi, trang đều mẫu lên mặt thạch Trong quá trình trang lưu ý phải

để cho mặt thạch khô, tránh tình trạng mặt thạch ướt vi khuẩn phát triển tập trung

về một chỗ sẽ không đếm được số lượng khuẩn lạc Sau khi cấy xong ta úp ngược đĩa xuống và ghi trên mặt đĩa ngày tháng cấy, nồng độ, tên mẫu, lượng thể tích lấy để cấy

b. Nuôi vi khuẩn

- Vi khuẩn được nuôi trong tủ nuôi với điều kiện nhiệt độ 37oC trong khoảng thời gian 24h Nếu thấy hiện tượng khuẩn lạc mọc không đồng đều, ta có thể nuôi tiếp vi khuẩn trong thời gian 48h

Các đĩa petri được nuôi trong tủ nuôi ở nhiệt độ 37 o C

c. Giữ mẫu Vibrio

- Nếu trong thời gian ngắn không tiến hành các phản ứng sinh lý,sinh hóa hay nghiên cứu tiếp theo ta tiến hành giữ mẫu vi khuẩn vừa phân lập được trên môi trường trong môi trường Canh thang.

- Môi trường Canh thang:

Peptone 5g

Lactose 5g

K 2 HPO 4 2,75g

KH 2 PO 4 2,75g

Sodium laurly sulfase 0,1g

DW: 1l

- Khi chuẩn bị xong môi trường này ta tiến hành tạo ống thạch nghiêng bằng cách cho 5ml môi trường vào ống nghiệm đã khử trùng sau đó để một thanh gỗ cao khoảng 5cm đặt các ống nghiệm lên rồi để tạo bề mặt nghiêng.

- Sau khi được ống thạch nghiêng môi trường cứng lại tiến hành dùng que cấy vòng cấy một đường ziczac trên bề mặt ống thạch Sau đó ủ mẫu trong tủ nuôi 24h Khi nhìn thấy vi khuẩn phát triển trên môi trường, ta cho mẫu đó vào tủ lạnh ngăn 4 o C để bảo quản mẫu.

3.3 Phương pháp xác định amoniac trong mẫu nước

Dựa trên phản ứng Berthelot, phản ứng tạo màu xanh Indophenol khi amoniac phản ứng với phenol trong môi trường kiềm với sự có mặt của hypoclorit Natri nitroprusit được cho vào nhằm xúc tác cho phản ứng Phương pháp có thể phát hiện chính xác đến hàm lượng 0,1 µgN/l

Sơ đồ phản ứng có thể biểu diễn như sau:

Đầu tiên, p-amino phenol được tạo thành theo phản ứng (1):

Tiếp theo, p- amino phenol phản ứng với natri hypoclorit tạo thành quinocloro imin:

Cuối cùng, quinocloro imin phản ứng với phenol thứ 2 tạo thành Indophenol có màu xanh

Đo mật độ quang của hợp chất sinh ra ở 630nm sẽ xác định được hàm lượng amoni có trong mẫu nước

Phương pháp đã được tiến hành thành công trực tiếp đối với mẫu nước

có tổng độ cứng nhỏ hơn 400mg/l và nồng độ nitơ nitri nhỏ hơn 5mg/l , có thể ứng dụng thành công trong phân tích nước biển ven bờ mà không qua chưng cất ( hệ số tương quan 0,989)

Thuốc thử dùng cho phản ứng thay đổi theo thời gian Do đó, không nên xây dựng đường chuẩn sử dụng các dung dịch chuẩn đã biết nồng độ cho

trước đối với phương pháp này Với mỗi mẫu phân tích, cần song song tiến hành phân tích một chuẩn có nồng độ biết trước

Hàm lượng amoni tổng cộng trong mẫu được xác định theo biểu thức:

C1/C2 = D1/D2

Trong đó; C1,C2 : nồng độ tương ứng của mẫu chuẩn và mẫu phân tích

D1,D2 : mật độ quang đo được của mẫu chuẩn và mẫu phân tích

* Ưu điểm và nhược điểm:

+ Có độ nhạy khá cao, có thể phân tích các đối tượng hàm lượng amoni thấp

+ Phương pháp có thể tiến hành trực tiêp đối với mẫu nước mà không cần qua công đoạn chưng cất vẫn đảm bảo độ chính xác cao Có thể phân tích được đồng loạt các mẫu với số lượng lớn trong thời gian ngắn

+ Đây là phương pháp thích hợp nhất và hiện được sử dụng phổ biến nhất

để phân tích amoni trong nước biển

Tuy nhiên, nhược điểm lưu ý nhất là các thuốc thử rất dễ thay đổi theo thời gian, không thể sử dụng đường chuẩn để xác định theo phương pháp này

3.4 Cách tiên hành xác định amoniac trong mẫu nước

a) Chuẩn bị hóa chất

+ Nước cất khử amoni:

Loại bỏ amoni khỏi nước cát bằng cách cho chúng chạy qua cột nhỏ (30

cm chiều dài và 1-2 cm đường kính trong) có chứa nhựa trao đổi cation dạng H+ trước khi sử dụng và bảo quản trong chai thủy tinh có nút kín

+ Dung dịch phenol:

Hòa tan 20g phenol dạng tinh thể loại tinh khiết phân tích (PA) trong 200

ml cồn 95% (v/v) Bảo quản trong chai thủy tinh màu nâu có nút tốt

+ Dung dịch natri nitroprusit:

Hòa tan 1,0 g natri nitroprusit Na₂Fe(CN) NO.2H₅ ₂O trong 200 ml nước khử ion Bảo quản trong chai màu nâu, dung dịch bền ít nhất 1 tháng

+ Dung dịch đệm kiềm xitrat:

Hòa tan 100 g natri xitrat và 5 g NaOH (loại tinh khiết phân tích) trong 500

ml nước khử ion Dung dịch bền không giới hạn

+ Dung dịch natri hypoclorit:

Sử dụng loại hypoclorit thương mại có nồng độ khoảng 1,5N Dung dịch bị phân hủy chậm theo thời gian và nồng độ của chúng được kiểm tra tường xuyên theo định kỳ Hòa tan 12,5 g natri thiosunphat loại chất lượng tốt trong 500 ml nước Thêm vài tinh thể KI vào khoảng 50 ml nước trong bình tam giác 125 ml

và thêm 1 ml dung dịch NaOCl cần kiểm tra Thêm 5-10 giọt HCl đặc và chuẩn

độ hàm lượng iot giảm phóng ra bằng dung dịch Na2S2O4 đã chuẩn bị trên Loại

bỏ dung dịch NaOCl nếu lượng thiosunphat sử dụng nhỏ hơn 12 ml

+ Dung dịch oxi hóa:

Trộn lẫn các dung dịch đệm xitrat và dung dịch natri hypoclorit đã chuẩn

bị theo tỷ lệ thể tích 4:1 (4 thể tích dung dịch đẹm với 1 thể tích NaOCl) Nút kín dung dịch khi không sử dụng Dung dịch bảo quản trong tủ lạnh Dung dịch sử dụng trong ngày

+ Dung dịch chuẩn amoni gốc:

Amoni clorua NH₄Cl được sấy khô ở 100C đến trọng lượn không đổi Cân 0,3820 g NH₄Cl khô hòa tan vào nước cất trong bình định mức 1 lít và định mức tới vạch Bảo quản dung dịch trong tủ lạnh 1 ml dung dịch này chứa 0.1 µg N

+ Dung dịch amoni chuẩn (1,0 µg N/l):

Lấy chính xác 10,0 ml dung dịch gốc vào bình đinh mức 1 lít, định mức đến vạch bằng nước biển nhân tạo Dung dịch này chuẩn bị trong ngày

+ Nước biển nhân tạo:

Hòa tan 310 g Natri Clorua, 100 g Magie sunfat và 0,5 g Natri bicacbonat trong 10 lít nước cất khử ion

b) Cách làm

Dùng ống đong loại 5ml lấy chính xác 5ml dung dịch mẫu vào một chiếc lọ penicilin 10ml Thêm 200 µl dung dịch phenol, lắc kĩ dung dịch rồi tiếp tục thêm 200µl dung dịch natri nitroprusit và tiếp tục lắc đều Cuối cùng thêm 500µl dung dịch oxi hóa và lắc đều Bịt miệng các bình tam giác bằng giấy nhôm

và để trong bóng tối ở nhiệt độ phòng Sau 1-2 giờ, tiến hành đo mật độ quang học ở bước sóng 630 nm với mẫu đối chứng là nước biển nhân tạo

Song song với quá trình phân tích mẫu, tiến hành tương tự với một mẫu trắng chứa 5ml nước biển nhân tạo và một mẫu dung dịch chuẩn amoni đã biết trước nồng độ

PHẦN 4: KẾT QUẢ THỰC HÀNH

4.1 số lượng khuẩn lạc Vibrio

Bảng kết quả số lượng khuẩn lạc: đơn vị cfu/ml

Vibrio màu

vàng

Trung bình 81,6×10 4

Vibrio màu

xanh

Trung bình 70000

Hình ảnh khuẩn lạc mọc trên môi trường TCBS-agar

4.2 Đối với Amoni

Hàm lượng amoni tổng cộng trong mẫu nước được xác định như sau:

Trong đó:C 1 , C 2 là nồng độ tương ứng của mẫu chuẩn và mẫu phân tích

D 1 , D 2 là mật độ quang đo được của mẫu chuẩn và mẫu phân tích

D 0 là mật độ quang đo được tại mẫu trắng

Phấn tích và xác định hàm lượng trong vòng 3 ngày liên tiếp ta thu được bảng sau :

Falcon 15 ml

Biểu đồ minh họa

Phân tích số liệu:

+ Trong 24h đầu, thì hạm lượng amoni ở 2 mẫu thu tại Đồ Sơn và Tiên Lãng cao như nhau (6,193µgN/l) và thấp nhất là mẫu tại Phù Long (5,832µgN/l)

+ Sau 48h, thì hàm lượng tại amoni ở mẫu tại Đồ Sơn cao nhất ( 3,961µgN/l) , tại Tiên Lãng (2,801µgN/l) , đối với mẫu tại Phù Long thì lượng amoni

đã bị khử hoàn toàn

+ Sau 72h, hàm lượng amoni đối với mẫu tại Đồ Sơn vẫn còn (4,551µgN/l), mẫu tại Tiên Lãng cũng đã hoàn toàn bị khử hết amoni

Qua số liệu trên ta thấy rằng các nhóm vi khuẩn nitrate bản địa tại khu vực Phú Long có tốc độ nitrate hóa và khử nitrate hóa nhanh và mạnh hơn so với hai vùng còn lại Tiếp đến là các nhóm khuẩn ở khu vực Tiên Lãng và cuối cùng là Đồ Sơn