Tiến hành thẩm định phương pháp trên mẫu tự tạo chứa các kháng sinh nghiên cứu với các chỉ tiêu:
Độ thích hợp của hệ thống: Đánh giá độ ổn định của hệ thống về thời gian
lưu và diện tích pic khi tiêm lặp lại 1 mẫu chuẩn 6 lần liên tiếp, ghi lại sắc ký đồ và diện tích pic.
Tính đặc hiệu/ tính chọn lọc của phương pháp.
- Tính đặc hiệu/ tính chọn lọc của phương pháp được đánh giá thông qua phân tích các dung dịch chuẩn, mẫu trắng và mẫu thêm chuẩn.
- Tiến hành xử lý và sắc ký các dung dịch chuẩn nồng độ 500 ng/ml, mẫu trắng và mẫu tự tạo theo các điều kiện đã chọn. Trên sắc kí đồ của mẫu trắng tại các thời điểm trùng với thời gian lưu của kháng sinh phải không xuất hiện các píc có các mảnh khối phổ tương ứng với số khối của chất phân tích trong mẫu chuẩn, mẫu thêm chuẩn phải có tín hiệu chất phân tích ở thời gian lưu tương ứng thời gian lưu trên mẫu chuẩn. Nếu có đáp ứng phải nhỏ hơn 1% so với nồng độ giữa của khoảng tuyến tính.
Độ tuyến tính và khoảng xác định: Xây dựng phương trình hồi quy tuyến
tính và tính hệ số tương quan r giữa nồng độ và tỷ lệ giữa diện tích píc của chất phân tích và diện tích píc của chuẩn nội
Yêu cầu: r > 0,995.
Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được. Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ chụm mong muốn.
Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng được tính dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N)
Phân tích mẫu thêm chuẩn ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích. Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = Signal to noise)
LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 3 lần nhiễu đường nền, thông thường S/N =3.
LOQ được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 lần nhiễu đường nền, thông thường S/N = 10.
Độ đúng, độ chính xác của phương pháp:
- Độ chính xác là sự thống nhất (mức độ phân tán) kết quả giữa một loạt phép
đo từ nhiều lần tiến hành phân tích trên cùng một mẫu thử đồng nhất dưới những điều kiện mô tả.
- Độ đúng của phương pháp được tiến hành theo quy trình phân tích trên mẫu tự tạo chứa lượng hoạt chất đã biết trước hàm lượng. Phân tích 6 mẫu độc lập có cùng nồng độ. Tính RSD để xác định độ lặp lại của phương pháp. Tính tỉ lệ chuẩn thu hồi lại được và lượng chuẩn thêm vào để có được độ đúng của phương pháp.
- Độ đúng của phương pháp được tiến hành theo quy trình phân tích trên mẫu tự tạo chứa lượng hoạt chất đã biết trước hàm lượng. Tính tỉ lệ chuẩn thu hồi lại được và lượng chuẩn thêm vào để có được độ đúng của phương pháp.
- Công thức tính độ thu hồi: + Đối với mẫu thử:
+ Đối với mẫu trắng:
Trong đó: R%: Độ thu hồi
Cm+c: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn Cm: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử
Cc: Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết)
Ctt: Nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn Sau đó tính độ thu hồi chung là trung bình của độ thu hồi các lần làm lặp lại.
