Những năm gần đây các mặt hàng thủy sản của Việt Nam đã bắt đầu mở rộng, thâm nhập vào thị trường các nước Châu Âu Bắc Mỹ như Ý, Bỉ, Canada... Đây là những thị trường mà yêu cầu về các chỉ tiêu vi sinh vật rất cao, luôn đòi hỏi những sản phẩm chất lượng cao. Salmonella là một vi khuẩn đường ruột thuộc họ Enterobacteriaceae, là tác nhân gây bệnh nguy hiểm trong thực phẩm. Hiện nay có khoảng 4% người thường mang mầm bệnh. Tất cả các tiêu chuẩn vệ sinh thực phẩm điều không cho phép có Salmonella trong thành phẩm. Sự hiện diện của chúng được kiểm tra gắt gao bởi các cơ quan chức năng. Tuy vậy, việc phát hiện Salmonella trong thủy sản đông lạnh thường rất thấp, có thể có nguy cơ bỏ sót, bởi các lý do sau: Trong khi xử lý nguyên liệu và chế biến có thể làm cho tế bào vi khuẩn bị tổn thương, nhất là đối với Salmonella, chúng khó phục hồi trong quá trình nuôi cấy phân lập khi xét nghiệm. Khả năng chịu nhiệt của Salmonella cũng kém nên số lượng giảm dần trong quá trình bảo quản đông lạnh. Cũng có thể do hiện diện của các vi khuận thuộc họ Enterebacteriaceae với số lượng nhiều hơn sẽ lấn át sự phát triển của Salmonella. Do đó, vấn đề kiểm soát mức độ vệ sinh an toàn thực phẩm ngày càng được quan tâm nhiều hơn. Với ý nghĩa thực tiễn và tính khoa học nêu trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Qui trình phát hiện Salmonella trong thủy sản đông lạnh” nhằm phát hiện và tìm ra những phương pháp mới phục vụ tốt hơn vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm mà xã hội đang quan tâm. 2. Mục tiêu đề tài Qui trình phát hiện Salmonella trong thủy sản đông lạnh 3. Nội dung đề tài Tiến hành các phương pháp phát hiện Salmonella trong thủy sản đông lạnh. Đề ra giải pháp về vệ sinh an toàn thực phẩm và khuyên cáo cho người tiêu dùng .4. Phạm vi nghiên cứuTiến hành lấy mẫu ở các chợ và các siêu thị. Phân tích sự hiện diện của Salmonella trong các mẫu thủy sản đông lạnh.Đánh giá kết quả dựa vào tần số hiện diện Salmonella trong các mẫu thủy sản đông lạnh.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ VI SINH Sinh viên thực : Trần Lê Đỗ Quyên MSSV: 0811110070 Lớp: 08CSH2 TP Hồ Chí Minh, 2011 MỤC LỤC Nội dung Trang LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC .i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii LỜI MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục đích đề tài Nội dung đề tài Phạm vi nghiên cứu CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về thủy sản và tình hình nhiễm khuẩn của thủy sản 1.1.1 Giới thiệu sơ lược về thủy sản .4 1.1.1.1 Thành phần hóa học của thủy sản 1.1.1.2 Ảnh hưởng thành phần hóa học đến chất lượng thủy sản a) Protein b) Emzyme c) Lipid d) Glucid .7 e) Các loại vitamin và khoáng chất 1.1.2 Tình hình nhiễm khuẩn của thủy sản ở Việt Nam và Thế Giới 1.1.2.1 Tình hình nhiễm khuẩn của thủy sản ở Việt Nam 1.1.2.2 Tình hình nhiễm khuẩn của thủy sản Thế Giới .8 1.2 Giới thiệu sơ lược về vi khuẩn Salmonella 1.2.1 Lịch sử phát hiện 1.2.2 Phân loại 11 1.2.3 Đặc điểm hình thái 13 1.2.4 Cấu trúc .13 1.2.5 Điều kiện sinh trưởng 16 1.2.6 yếu tố độc lực 18 1.2.6.1 Nội độc tố 18 1.2.6.2 Độc tố đường ruột 20 1.2.6.3 Độc tố tế bào 21 1.2.7 Cơ chế gây bệnh 21 1.2.8 Nguồn gốc gây nhiễm 23 1.2.9 Bệnh, triệu chứng, và cách điều trị bệnh vi khuẩn Salmonella gây .24 1.2.10 Tình hình nhiễm Salmonella ở Việt Nam và Thế Giới .26 1.2.10.1 Tình hình nhiễm Salmonellla ở Việt Nam .26 1.2.10.2 Tình hình nhiễm Salmonella Thế Giới 27 1.2.11 Cách phòng ngừa .28 1.3 Phương pháp phát hiện Salmonella 30 1.3.1 Phương Pháp truyền thống 30 1.3.1.1 Nguyên tắc 30 1.3.1.2 Phương pháp thực hiện .31 a) Bước tăng sinh .32 b) Bước tăng sinh chọn lọc 32 c) Bước phân lập và nhận diện 32 d) Khẳng định .33 1.3.1.3 Báo cáo kết quả 35 1.3.2 Phương pháp hiện đại 36 1.3.2.1 Phương pháp PCR 36 1.3.2.2 Phương pháp ELISA 37 1.3.2.3 Phương pháp màng PETRI (petrifilms) .37 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH SALMONELLA .39 2.1 Vật liệu 40 2.1.1 Mẫu 40 2.1.2 Môi trường, hóa chất và dụng cụ .40 2.1.2.1 Môi trường và hóa chấ .40 2.1.2.2 Dụng cụ và thiết bị .41 a) Dụng cụ 41 b) Thiết bị 41 2.2 Phương pháp thực hiện 42 2.2.1 Lấy mẫu và bảo quản mẫu 42 a) Lấy mẫu 42 b) Bảo quản mẫu 42 2.2.2 Chuẩn bị mẫu .42 2.2.3 Phương pháp 43 2.2.4 Qui trình thu thập mẫu tiến hành kiểm nghiệm salmonella…44 2.2.5 Qui trình phân tích .45 2.2.5.1 Thuyết minh qui trình 46 a) Chuẩn bị mẫu 46 b) Cấy mẫu 46 c) Thử nghiệm khẳng định 46 2.2.6 Nhận định tính sinh hóa đặc hiệu 49 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 50 3.1 Kết quả 51 3.1.1 Kết quả cảm quan .51 3.1.2 Kết quả đánh giá mức độ nhiễm Salmonella sản phẩm đông lạnh 51 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 60 4.1 Kết luận 61 4.2 Đề nghị 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………… 62 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT - ATVSTP An toàn vệ sinh thực phẩm BS BPLS BPW CHO CT DCA DPF HE LPS LDC ODC RPF RV SPI_1 TPHCM TCVN TSA TSI TT XLD Bismuth Sulphite Agar Brillian Green Phenol Red Lactose Sucrose Buffered Peptone Water Chnese Hamster Ovary Cell Choleratoxin Like Enterotoxin Deoxycholate Citrate Agar Delayed Permeability Facto Hektoen Entric Agar Lypopolysaccharide Lysine Decarboxylase Ornithine Decarboxy Lase Rapid Permeability Facto Rappaport Vassiliadis Soya Pepton Salmonella Pathogenicity Island Thành Phố Hồ Chí Minh Tiêu chuẩn Việt Nam Tryptone Soya Agar Triple Sugar Iron Agar Tetrethionate Muller – Kauffmanm Xylose Lysine Desoxycholate Agar DANH MỤC BẢNG - Bảng 1.1 Thành phần hố học số lồi thuỷ sản Bảng 1.2 Phân biệt kháng nguyên O, K, Vi 15 Bảng 1.3 Các tính chất sinh hố Salmonella 17 Bảng 1.4 Biểu đặc trưng Salmonella test sinh hoá .35 Bảng 2.1 Phát hay không phát Salmonella 25g mẫu 49 DANH MỤC HÌNH - Hình 1.1 Vi khuẩn Salmonella 10 Hình 1.2 Vi khuẩn Salmonella styphi 11 Hình 1.3 Vi khuẩn Salmonella cholera_suis 12 Hình 1.4 Vi khuẩn Salmonella entertidis 12 Hình 1.5 Các kháng ngyên bề mặt Salmonella 15 Hình 2.1 Qui trình thu thập mẫu tiến hành kiểm nghiệm Salmonella 44 Hình 2.2 Qui trình phân tích phát Salmonella 45 Hình 3.1 Khuẩn lạc đặc trưng Salmonella môi trường XLD 52 Hình 3.2 Khuẩn lạc đặc trưng Salmonella mơi trường HE 53 Hình 3.3 Khuẩn lạc đặc trưng Salmonella môi trường BS 54 Hình 3.4 Thử nghiệm mơi trường thạch TSI .54 Hình 3.5 Thử nghiệm Urea Broth 55 Hình 3.6 Lên men manitol 56 Hình 3.7 Thử nghiệm LDC 57 Hình 3.8 Thử nghiệm Indol 57 Hình 3.9 Thử nghiệm Voges – Proskauer 58 LỜI MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Những năm gần các mặt hàng thủy sản của Việt Nam đã bắt đầu mở rộng, thâm nhập vào thị trường các nước Châu Âu Bắc Mỹ Ý, Bỉ, Canada Đây là những thị trường mà yêu cầu về các chỉ tiêu vi sinh vật rất cao, đòi hỏi những sản phẩm chất lượng cao Salmonella là một vi khuẩn đường ruột thuộc họ Enterobacteriaceae, là tác nhân gây bệnh nguy hiểm thực phẩm Hiện có khoảng 4% người thường mang mầm bệnh Tất cả các tiêu chuẩn vệ sinh thực phẩm điều không cho phép có Salmonella thành phẩm Sự hiện diện của chúng được kiểm tra gắt gao bởi các quan chức Tuy vậy, việc phát hiện Salmonella thủy sản đông lạnh thường rất thấp, có thể có nguy bỏ sót, bởi các lý sau: - Trong xử lý nguyên liệu và chế biến có thể làm cho tế bào vi khuẩn bị tổn thương, nhất là đối với Salmonella, chúng khó phục hồi quá trình nuôi cấy phân lập xét nghiệm - Khả chịu nhiệt của Salmonella cũng kém nên số lượng giảm dần quá trình bảo quản đông lạnh - Cũng có thể hiện diện của các vi khuận thuộc họ Enterebacteriaceae với số lượng nhiều sẽ lấn át sự phát triển của Salmonella Do đó, vấn đề kiểm soát mức độ vệ sinh an toàn thực phẩm ngày càng được quan tâm nhiều Với ý nghĩa thực tiễn và tính khoa học nêu trên, tiến hành thực hiện đề tài “Qui trình phát hiện Salmonella thủy sản đông lạnh” nhằm phát hiện và tìm những phương pháp mới phục vụ tốt vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm mà xã hội quan tâm Mục tiêu đề tài Qui trình phát hiện Salmonella thủy sản đông lạnh Nội dung đề tài Tiến hành các phương pháp phát hiện Salmonella thủy sản đông lạnh Đề giải pháp về vệ sinh an toàn thực phẩm và khuyên cáo cho người tiêu dùng Phạm vi nghiên cứu Tiến hành lấy mẫu ở các chợ và các siêu thị Phân tích sự hiện diện của Salmonella các mẫu thủy sản đông lạnh Đánh giá kết quả dựa vào tần số hiện diện Salmonella các mẫu thủy sản đông lạnh CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về thủy sản và tình hình nhiễm khuẩn của thủy sản 1.1.1 Giới thiệu sơ lược về thủy sản Thủy sản là bất kỳ động vật hoặc thực vật biển được phục vụ thực phẩm và thức ăn của người Thủy sản bao gồm động vật biển, cá và động vật có vỏ (bao gồm cả động vật thân mềm và động vật giáp xác) Vì thế, ở Bắc Mỹ mặc dù không thường ở vương Quốc Anh, các hải sản hạn cũng được áp dụng cho đông vật tương tự từ cá nước ngọt, và tất cả thức ăn thủy sản được gọi chung là thủy sản, nhiên ở số nước New zealand chúng được phân loại là “Game” 1.1.1.1 Thành phần hóa học của thủy sản Thành phần hóa học gồm: nước, protein, lipid, muối vô cơ, vitamin Các thành phần này khác rất nhiều, thay đổi phụ thuộc vào giống, loài, giới tính, điều kiện sinh sống Ngoài ra, các yếu tố thành phần thức ăn, môi trường sống, kích cỡ, và các đặc tính di truyền cũng ảnh hưởng đến thành phần hóa học, đặc biệt là cá nuôi Các yếu tố này có thể kiểm soát được chừng mực nào đó Bảng 1.1 Thành phần hóa học của một số loài thủy sản Thành Protein Lipid Glucid Tro Canxi Phosphat Fe phần % % % % mg% mg% mg% loài Mực 17 - 20 0,8 _ _ 54 _ 1,2 Tôm 19 - 23 0,3 -1,4 1,3 - 1,8 29 - 30 33 - 67 1,2 - 5,1 Hàu Sò Trai Ốc 11 - 13 8,8 4,6 11 - 12 1-2 0,4 1,1 0,3 - _ 2,5 3,9 - 2,2 1,9 - 4,3 0,21 37 668 1310 _ 82 107 51 -1210 _ 1,9 1,5 _ Cua 16 0,7 1,5 8,3 1,5 _ -1660 40 _ 1.1.1.2 Ảnh hưởng thành phần hóa học đến chất lượng thủy sản Yếu tố ảnh hưởng rỏ nhất đến thành phần hóa học là thành phần thức ăn Thông thường cá nuôi thường được cho ăn thức ăn chứa nhiều lipid để cá phát triển nhanh Tuy nhiên, hàm lượng lipid caodư để cung cấp lượng thì lipid dư thừa sẽ được tích lũy ở các mô làm cho cá có hàm lượng lipid rất cao Ngoài ảnh hưởng không tốt đến chất lượng nói chung, nó còn có thể làm giảm suất chế biến Cách thông thường để giảm lipid trước thu hoạch cho cá đói một thời gian a) Protein Được cấu tạo từ các acid amin, các acid amin không thay thế quyết định giá trị dinh dưỡng cảu thực phẩm Protein của cá là nguồn giàu các lysine và các acid amin chứa lưu huỳnh (methinonine, cystrine) Protein cấu trúc Gồm các sợi myosin, actin, actomyosin và tropomyosin, chiếm khoảng 65 75% tổng hàm lượng protein cá và khoảng 77 - 75% tổng hàm lượng mực Các protein cấu trúc này có chức co rút đảm nhận các hoạt động của Myosin và actin là các protein tham gia trục tiếp vào quá trình co duỗi Protein cấu trúc có khả hòa tan dung dịch muối trung tính có nồng độ cồn khá cao (> 0,5M) Protein chất Gồm myoglobin, myoalbumin, globulin, và các enzyme, chiếm khoảng 25 30% hàm lượng protein cá và 12 - 20% mực Các protein này hòa tan nước, dung dịch muối trung tính có nồng độ ion thấp (< 0,15M) hầu hết protein chất bị đông tụ đun nóng nước ở nhiệt độ 50oC Trong quá trình chế biến và bảo quản myoglobin dễ bị oxy hóa thành metmyoglolobin, ảnh hưởng đến màu sắc thực phẩm Protein liên kết Bao gồm các sợi collagen, elastin Hàm lượng collagen ở thịt cá thấp ở động vật có vú, thường khoảng - 10% tổng lượng protein và 0,2 - 2,2% trọng lượng thịt b) Enzyme Là protein, chúng hoạt động xúc tác cho các phản ứng hóa học ở nội tạng và thịt Emzyme tham gia vào quá trình trao đổi chất ở tế bào, quá trình tiêu hóa thức ăn Sau cá chết emzyme vẫn còn hoạt động, vì thế gây nên quá trình tự phân giải của cá, làm ảnh hưởng đến mùi vị, trạng thái cấu trúc, hình dạng bề ngoài của chúng Sản phẩm của quá trình phân giải emzyme là nguồn dinh dưỡng cho hệ vi sinh vật phát triển, làm tăng nhanh tốc độ ươn hỏng a) Lipid Cá sử dụng chất béo là nguồn lượng dự trữ để trì sự sống những tháng mùa đông, nguồn thức ăn khan hiếm Hàm lượng lipid cá dao động nhiều (0,1 - 30%) d) Glucid Hàm lượng glucid có thịt cá rất thấp, thường dưới 0,5%, tồn tại dưới dạng lượng dự trữ glucogen Cá vừa đẻ trứng hàm lượng glucid dự trữ rất thấp.Sau chết, glucogen thịt chuyển thành acid lactic, làm giảm pH của thịt, mất khả giữ nước của thịt sư biến đổi của pH ở thịt sau chết có ý nghĩa công nghệ rất lớn e) Các loại vitamin và khoáng chất Cá là nguồn cung cấp chính vitamin nhóm B, vitamin A,D có chủ yếu các loài cá béo Vitamin A và D tích lũy chủ yếu gan, vitamin nhóm B có chủ yếu thịt Chất khoáng của cá phân bố chủ yếu mô xương, đặc biệt xương sống Hàm lượng sắt thịt các loài thủy sản nhiều động vật cạn Sulfur có phổ biến thịt các loài hải sản, chiếm khoảng 1% chất khô của thịt 1.1.2 Tình hình nhiễm khuẩn của thủy sản ở Việt Nam và Thế Giới 1.1.2.1 Tình hình nhiễm khuẩn của thủy sản ở Việt Nam Gần viện dinh dưỡng quốc gia đã thực hiện đề tài nghiên cứu “Thực trạng ô nhiễm vi sinh vật vào thực phẩm thủy hải sản đông lạnh chế biến một số địa bàn”.Kết quả kiểm tra vi sinh vật tại một số phòng thí nghiệm, rất nhiều mẫu thực phẩm thủy hải sản đông lạnh và chế biến sẵn được lấy ngẫu nhiên ở mợt 2.2.4 Qui trình thu thập mẫu tiến hành kiểm nghiệm Salmonella Sản phẩm thủy sản Thu tại các chợ và siêu thị Đánh giá các chỉ tiêu Cảm quan Vi sinh Test Salmonella Nhận xét, kết luận Hình 2.1 Qui trình thu thập mẫu tiến hành kiểm nghiệm Salmonella 2.2.5 Qui trình phân tích Đồng nhất 25g mẫu 225ml môi trường tăng sinh (BPW), ủ ở 37oC, 18 - 24 giờ Cấy 0,1ml dung dịch tăng sinh sang môi trường tăng sinh chọn lọc (RV), ủ ở 42oC, 18 - 24 giờ Phân lập khuẩn lạc đơn ít nhất môi trường chọn lọc phân biệt (XLD,HE,BS,SS ),ủ ở 37oC, 24 giờ Chọn các khuẩn lạc đặc trưng cho Salmonella, cấy sang BHI hay TSA, ủ qua đêm Thử nghiệm sinh hóa cho kết quả: - Trên KIA/TSI: đỏ/vàng, có/không H2S, sinh hơi/không - Urea:(-), indol: (-), VP: (-), LDC: (+), ODC: (+), Manitol: (+), Sobitol: (+) Thử nghiệm ngưng kết kháng nguyên huyết thanh: Poly: O, Poly: H Kết luận: Salmonella dương tính/ âm tính 25g mẫu Hình 2.2 Qui trình phân tích phát hiện Salmonella 2.2.5.1 Thuyết minh qui trình a) Chuẩn bị mẫu Dùng kéo vô khuẩn cắt 25g mẫu (không lấy mỡ, lấy chất lỏng có), cho vào bao nylon vơ khuẩn Thêm vào 225ml môi trường PBW hấp khử trùng để nguội Tiến hành đồng mẫu độ pha loãng 10-1 Đem ủ nhiệt độ 37oC 24 b) Cấy mẫu Tăng sinh: Cấy 0,1ml dịch mẫu có nồng độ 10 -1 vào ống nghiệm có chứa 10ml mơi trường tăng sinh chọn lọc RV, Ủ 42 ± 0,5 oC 24 Phân lập: Cấy mẫu từ môi trường RV sang môi trường thạch đĩa XLD ủ nhiệt độ 37oC 24 Nhận dạng khuẩn lạc đặc trưng salmonella môi trường XLD: trịn, lồi, suốt , có tâm đen đơi tâm đen lớn bao trùm khuẩn lạc, môi trường xung quanh chuyển sang màu đỏ (hồng)… Chọn khuẩn lạc đặc trưng cấy chuyển sang môi trường thạch đĩa TSA, tăng sinh không chọn lọc ủ 37 ± 0,5oC 24 c) Thử nghiệm khẳng định Lấy khuẩn lạc từ môi trường TSA cấy sang mơi trường thử nghiệm sinh hóa Thực sau: Thử nghiệm môi trường TSI Hấp khử trùng môi trường TSI ở 121 oC 15 phút và phân phối môi trường vào các ống vô trùng để làm ống thạch nghiêng Dùng que cấy vòng cấy sinh khối từ khuẩn lạc của giống thuần sâu vào đáy của ống thạch nghiêng Sau cấy xong thì ủ ở 37oC vòng 24h – 48h Thử nghiệm Urea Broth Cấy vi sinh vật đã được phân lập vào môi trường canh urea có chứa chất chỉ thị là bromocresol purple Ủ ở 37oC khoảng 12h – 18h Thử nghiệm (+): Môi trường chuyển sang màu vàng Thử nghiệm (-): Môi trường không đổi màu Lên men mannitol Môi trường sử dụng là môi trường phenol red broth base có pH 7.4, chỉ thị môi trường này là phenol red có màu đỏ sẽ chuyển thành màu vàng pH < 6.8 Tiến hành cấy vào các ống môi trường các chủng vi sinh vật cần khẳng định Ủ 37oC 18 – 24h Khả lên men chúng đánh giá dựa vào sinh sinh acid Sinh acid (+): Môi trường màu cam chuyển sang vàng Sinh (-): Có bọt khí ống Durnham Thử nghiệm LDC Sử dụng môi trường Falkow Tiến hành cấy vào các ống môi trường các chủng vi sinh vật cần khẳng định Chất chỉ thị màu môi trường là Bromocresol purple - Phản ứng (+): môi trường giữ nguyên màu tím ban đầu, canh khuẩn đục - Phản ứng (-): môi trường từ tím chuyển sang vàng Thử nghiệm khả sinh Indol Cấy VSV thử nghiệm qua môi trường canh trypton ủ khoảng 24 37oC Nhỏ vài giọt ether để kéo indol lên bề mặt môi trường, thêm vài giọt thuốc thử Kovac’s Quan sát sau vài phút - Thử nghiệm (+): bề mặt môi trường xuất hiện vòng màu đỏ cánh sen - Thử nghiệm (-): không xuất hiện vòng đỏ Thử nghiệm Voges – Proskauer Cấy vi sinh vật vào môi trường glucose phosphate (MR-VP Broth) Ủ ở nhiệt độ 37oC vòng từ - ngày Thêm vào canh khuẩn dung dịch thuốc thử anpha- naphtol 5% cồn và dung dịch KOH 40% hay NaOH 40 % với tỷ lệ 3:1 Quan sát phản ứng xảy phút - Thử nghiệm (+):xuất hiện màu đỏ hay hồng sáng mặt môi trường - Thử nghiệm (-): môi trường không đổi màu 2.2.6 Nhận định tính sinh hóa đặc hiệu Bảng 2.1 Phát hay không phát Salmonella 25g mẫu Tính chất sinh hố TSI lactose TSI sucrose TSI glucose TSI glucose sinh TSI hydro-sulfua Phân giải urê Lên men mannitol Phản ứng Indol Phản ứng V.P Dương âm tính + + + + - Tỷ lệ % với vi khuẩn Salmonella 99,2 99,5 100 91,2 91,6 100,0 98,2 100,0 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết Quả 3.1.1 Kết quả cảm quan Về màu sắc của mẫu thì có màu đặc trưng của từng loại Về mùi của mẫu thì cũng có mùi đặc trung của từng loại, không có mùi ôi thiu Tóm lại các mẫu thủy sản được lấy tình trang rất tốt, không biểu hiện gì xấu Tuy nhiên, giá trị cảm quan khơng có mối quan hệ với khả bị nhiễm vi sinh vật gây bệnh thủy sản đông lạnh Do đó, giá trị cảm quan cung cấp thơng tin trạng thái bên ngồi mẫu 3.1.2 Kết quả đánh giá mức độ nhiễm Salmonella sản phẩm thủy sản đông lạnh Chúng tiến hành lấy mẫu thuỷ sản số chợ siêu thị Thực bước test Salmonella cho số kết sau Dùng que cấy vòng thực kỹ thuật cấy phân lập khuẩn lạc đơn với giống từ dịch tăng sinh chọn lọc đĩa môi trường: + Môi trường XLD: Chúng tiến hành cấy đĩa phát có đĩa nhiễm Salmonella Khuẩn lạc có màu hồng suốt, có hay khơng có tâm đen Một số dịng có tâm đen bóng lớn chiếm gần hết khuẩn lạc Hình 3.1 Khuẩn lạc đặc trưng của Salmonella môi trường XLD + Môi trường HE: Tiến hành cấy đĩa phát có đĩa nhiễm Salmonella Khuẩn lạc có màu thay đổi từ xanh dương đến xanh lục, có hay khơng có tâm đen Một số dịng có tâm đen bóng lớn chiếm gần hết khuẩn lạc Hình 3.2 Khuẩn lạc đặc trưng của Salmonella môi trường HE + Môi trường BS: Tiến hành đĩa phát đĩa nhiễm Salmonella Khuẩn lạc có màu nâu xám hay màu đen, có xuất ánh kím tím, mơi trường xung quanh khunẩ lạc chuyển thành màu nâu sau chuyển sang màu đen kéo dài thời gian ủ Hình 3.3 Khuẩn lạc đặc trưng Salmonella môi trường BS Đồng thời tiến hành số thử nghiệm sinh hoá cho số kết sau: + Thử nghiệm môi trường TSI: Hình 3.4 Thử nghiệm môi trường thạch TSI Salmonella lên men đường glucose môi trường TSI phần nghiêng mơi trường TSI có màu đỏ, phần sâu có màu vàng Salmonella có khả sinh H2S vậy xuất hiện các vệt màu đen môi trường TSI Có thể thấy hiện tượng sinh qua hiện tượng làm vỡ thạch môi trường hoặc môi trường bị đẩy lên tạo một khoảng không bên dưới ống nghiệm + Thử nghiệm Urea Broth: Hình 3.5 Thử nghiệm Urea Broth Vì Salmonella không phân giải urea nên không làm thay đổi pH môi trường Sau nuôi cấy mơi trường vẫn giữ ngun màu tím + Lên Men manitol: Hình 3.6 Lên men manitol Môi trường sau nuôi cấy salmonella bị acid hóa và chuyển thành màu vàng + Thử nghiệm LDC: Hình 3.7 Thử nghiệm LDC Sau nuôi cấy Salmonella môi trường chuyển thành kiềm, mơi trường giữ ngun màu tím + Thử nghiệm khả sinh Indol: Hình 3.8 Thử nghiệm Indol Nhỏ vài giọt ether để kéo indol lên bề mặt môi trường, thêm vài giọt thuốc thử Kovac’s Quan sát sau vài phút - Thử nghiệm (+): bề mặt môi trường xuất hiện vòng màu đỏ cánh sen + Thử nghiệm Voges – Proskauer: Hình 3.9 Thử nghiệmVoges – Proskauer Sau cho thêm vào canh khuẩn dung dịch thuốc thử anpha- naphtol 5% cồn và dung dịch KOH 40% hay NaOH 40 % với tỷ lệ 3:1 Quan sát phản ứng xảy phút - Thử nghiệm (-): môi trường không đổi màu Đánh giá theo TCVN 4829:2001 (ISO 6579:1993) với quy đinh mức độ nhiễm Salmonella CFU/25g Nhưng với một số mẫu mà chúng đã lấy và tiến hành phân tích thì có một số mẫu bị nhiễm Salmonella chiếm khoảng 20 - 30%.Việc tạp nhiễm Salmonella có thể là đo nguồn phân phối không hợp vệ sinh, không dùng các dụng cụ bảo hộ lao động Hay cũng có thể nhiễm từ nguồn không khí, và môi trường xung quanh khu vực buôn bán Tình trạng nhiễm Salmonella chứng tỏ mức độ VSATTP còn rất thấp, vì tỉ lệ theo TCVN là CFU/25g Còn lại những mẫu âm tính với Salmonella sử dụng được, phải đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm, khơng có Salmonella gây ca ngộ độc thực phẩm nghiêm trọng, không nhiễm Salmonella khơng có nghĩa khơng nhiễm vi sinh vật khác CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết ḷn Sau q trình nghiên cứu chúng tơi nhận thấy số lượng nhiễm Salmonella chiếm khoảng 20 – 30%, diều chứng tỏ vấn đề VSATTP thấp Bởi Salmonella lồi vi khuẩn nguy hiểm, chúng gây bệnh thương hàn, nhiễm trùng huyết số bệnh khác Đáng nói lồi thường tạp nhiễm vào thực phẩm, điều vô nguy hiểm theo TCVN, mức độ nhiễm Salmonella CFU/25 g Mạng lưới kiểm tra an toàn vệ sinh thực phẩm trải rộng khắp nước, lực kiểm dịch chưa cao địa phương , thành phố lớn 4.2 Đề nghị Tiến hành thử nghiệm với số lượng mẫu lớn Tiến hành thêm thử nghiệm ngưng kết kháng huyết nhuộm Ngoài ra, cần tiến hành nhiều thử nghiệm kiểm tra tiêu samonella loại thực phẩm khác thịt chế biến, thịt đông lạnh, trứng tươi, Lập mạng lưới kiểm tra an toàn vệ sinh thực phẩm dày đặc, lực kiểm tra cao TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt [1] Trần Linh Thước, 2007, Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mĩ phẩm [2] Nguyễn Thị Linh Phương, 2006, đồ án ốt nghiệp, Đánh giá mức độ nhiễm Salmonella quầy thịt chợ Văn Thánh [3] Nguyễn Hữu Liêm, 2006, khố luận tốt nghiệp, Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella [4] Lê Đình Hùng, Vương Thị Việt Hoa, Phạm Vân Ánh, Trần Hồng Kim Sa, Tìm hiểu biện pháp nhằm tăng cường khả phát Salmonella sản phẩm thủy sản đông lạnh, Tạp san Khoa Học Kỹ Thuật Nông Lâm Nghiệp, số 2/2001 [5] Phan Thị Thu Quế, 2005, Công nghệ chế biến thuỷ hải sản đông lạnh [6] PGS.TS Võ Thị Dương Huy, 2007, Vi khuẩn học Tài liệu Internet [7] http://www.thuvientailieu.com.vn [8] http://www.trieufile.com.vn LỜI CAM ĐOAN - Em xin cam đoan khóa luận tốt nghiệp cơng trình nghiên cứu thực cá nhân, thực dựa sở nghiên cứu lý thuyết phần thực nghiệm Các số liệu, kết thí nghiệm báo cáo khố luận trung thực Sinh Viên Thực Hiện Trần Lê Đỗ Quyên