Khóa luận tốt nghiệp ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên quá trình phát sinh hình thái cây hoa huệ hương (polianthes tuberosel) in vitro

Cây hoa Huệ Hương (Polianthes tuberose L.) là cây hoa cắt cành thuộc nhóm thân thảo, thích cường độ ánh sáng cao và cho hoa quanh năm. Hoa Huệ Hương được nhập vào nước ta từ rất lâu. Cây hoa Huệ Hương được trồng phổ biến tại vùng Nam Trung Bộ đem lại thu nhập khá cao cho người trồng và chính là cây xóa đói giảm nghèo cho vùng chuyên canh loài cây này.Hiện nay, việc canh tác cây hoa Huệ thường chủ yếu được nhân giống bằng kỹ thuật nhân giống truyền thống, chủ yếu là lấy củ trồng. Với phương pháp nhân giống này dễ lây lan các mầm bệnh có sẵn trong củ, đặc biệt là bệnh virus làm giảm năng suất và phẩm chất hoa, khiến cho giống hoa này ngày càng thoái hóa.Trong những năm gần đây, bệnh hại trên cây hoa Huệ Hương xuất hiện nhiều, đặc biệt trong đó có một bệnh rất khó trị là bệnh chai bông. Tác nhân gây bệnh hiện vẫn chưa xác định được. Bệnh xuất hiện trên diện rộng làm ảnh hưởng đến năng suất và phẩm chất hoa. Bệnh không làm cho cây chết ngay nhưng làm cho chồi, củ, hoa kém phát triển, làm thất thu nguồn thu nhập của nông dân. Các triệu chứng bệnh do virus được mô tả bởi Horner và Person (1988), Chen và Chang (1998) gần giống các biểu hiện ở cây hoa Huệ Hương ở Nam Trung Bộ. Vấn đề đặt ra là làm thế nào để tạo nguồn giống sạch bệnh cung cấp cho nhân dân?Phương pháp nhân giống in vitro với rất nhiều ưu điểm, tạo được cây con trẻ hóa và sạch bệnh nên tiềm năng sinh trưởng, phát triển và năng suất cao, khắc phục được nhược điểm của phương pháp nhân giống truyền thống, khôi phục lại phẩm chất vốn có của giống. Đồng thời hệ số nhân của phương pháp nhân giống này cao đáp ứng được nhu cầu về số lượng giống có chất lượng cao, ổn định đáp ứng được nhu cầu sản xuất trên quy mô rộng. Cho đến nay kĩ thuật nuôi cấy mô đã được nghiên cứu ứng dụng rất có hiệu quả trong việc nhân giống hàng loạt các loại cây trồng tạo ngân hàng cây giống sạch bệnh, khỏe mạnh cho năng suất cao, phẩm chất tốt cung cấp cho sản xuất.2. Mục đích nghiên cứuXác định được ảnh hưởng của các chất đều hòa sinh trưởng thực vật lên quá trình phát sinh hình thái trong quy trình nhân giống cây hoa Huệ Hương bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào, làm cơ sở cho việc hình thành quy trình nhân giống in vitro cây hoa Huệ Hương, góp phần giải quyết những khó khăn của thực tiễn sản xuất hoa.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ

TP HCM

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT

Giảng viên hướng dẫn: Th.S Trịnh Thị Lan Anh

Sinh viên thực hiện : Lê Ngọc Mỹ MSSV: 0811110049 Lớp: 08CSH2

TP Hồ Chí Minh, 2011

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG iii

DANH MỤC HÌNH iv

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Nhân giống cây bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào 3

1.2 Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật 3

1.3 Cơ sở lý luận của nuôi cấy mô tế bào thực vật 5

1.4 Ưu, nhược điểm của phương pháp nhân giống in vitro 6

1.5 Kỹ thuật nuôi cấy in vitro 8

1.6 Các hướng nhân giống vô tính in vitro 11

1.7 Quy trình nhân giống in vitro 12

1.7.1 Lấy mẫu và xử lý mẫu 12

1.7.2 Tái sinh mẫu nuôi cấy 12

1.7.3 Nhân nhanh chồi 12

1.7.4 Tái sinh rễ 13

1.7.5 Đưa cây in vitro ra vườn ươm 13

1.8 Sơ lược về đối tượng nghiên cứu 13

1.8.1 Nguồn gốc 13

1.8.2 Phân loại 13

1.8.3 Đặc điểm thực vật học 14

1.8.4 Yêu cầu ngoại cảnh của cây hoa Huệ Hương 14

1.8.5 Kỹ thuật trồng và chăm sóc 16

1.8.6 Vấn đề sâu bệnh trên cây hoa Huệ Hương 18

1.8.7 Giá trị kinh tế 19

1.9 Tình hình sản xuất hoa huệ trong nước 20

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 22

2.1 Địa điểm thực hiện đề tài 22

2.2 Đối tượng nghiên cứu 22

2.3 Phương pháp nghiên cứu 23

2.3.1 Phương pháp khử trùng mẫu cấy 23

2.3.2 Phương pháp nuôi cấy khởi động 23

2.3.3 Phương pháp nhân nhanh 23

2.3.4 Phương pháp tạo cây hoàn chỉnh 23

2.3.5 Phương pháp ươm cây 24

2.4 Bố trí thí nghiệm 24

2.5 Các chỉ tiêu theo dõi 27

2.6 Thu thập và xử lý số liệu 27

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

Thí nghiệm 1 Xác định phương pháp khử trùng đối với mẫu nuôi cấy là phần đỉnh của các mắt ngủ tách từ củ hoa Huệ Hương 28

Thí nghiệm 2 Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên tới quá trình phát sinh hình thái của mẫu cấy 31

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 40

4.1 Kết luận 40

4.2 Đề nghị 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

PHỤ LỤC 46

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Khảo sát ảnh hưởng của HgCl2 0,1% ở các mức thời gian khác

nhau đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy 28Bảng 2.2 Khảo sát ảnh hưởng của việc kết hợp HgCl2 0,1% và Ca(OCl)2

15% đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy 29Bảng 2.3 Khảo sát ảnh hưởng của kinetin lên khả năng phát sinh hình

thái của mẫu cấy 29Bảng 2.4 Khảo sát ảnh hưởng của BA đến khả năng phát sinh hình thái

của mẫu nuôi cấy 29Bảng 2.5 Khảo sát ảnh hưởng kết hợp của BA và các auxin khác nhau

lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy 30Bảng 3.1 Ảnh hưởng HgCl2 0,1% ở các mức thời gian khác nhau đến

hiệu quả khử trùng mẫu cấy sau 4 tuần nuôi cấy 32 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của việc kết hợp HgCl2 0,1% trong 15 phút và

Ca(OCl)2 15% đến hiệu quả khử trùng mẫu sau 4 tuần nuôi

cấy 33Bảng 3.3 Ảnh hưởng của kinetin lên khả năng phát sinh hình thái của

mẫu cấy sau 8 tuần nuôi cấy 35 Bảng 3.4 Ảnh hưởng ảnh hưởng của BA đến khả năng phát sinh hình

thái của mẫu nuôi cấy sau 8 tuần nuôi cấy 37Bảng 3.5 Ảnh hưởng kết hợp của BA và các auxin khác nhau lên khả

năng phát sinh hình thái của mẫu cấy sau 8 tuần nuôi cấy 40

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Polianthes tuberose L 13

Hình 2.1 Hoa Huệ Hương 26Hình 2.2 Củ hoa Huệ Hương 26Hình 3.1 Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza

+ 9 g/l agar + 2mg/l Kinetin 36Hình 3.2 Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza

+ 9 g/l agar + 4mg/l BA 39Hình 3.3 Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza

+ 9 g/l agar + 0,25mg/l IBA + 4mg/l BA 41Hình 3.4 Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza

+ 9 g/l agar + 0,25mg/l 2,4D + 4mg/l BA 41 Hình 3.5 Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza

+ 9 g/l agar + 0,25mg/l α-NAA + 4mg/l BANAA + 4mg/l BA 42 Hình 3.6 Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza

+ 9 g/l agar + 0,25mg/l IAA + 4mg/l BA 42

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

MS: Murashige and Skoog, 1962

BA: Benzyl adenin

IBA: Indol butyric acid

α-NAA + 4mg/l BANAA: α-NAA + 4mg/l BAnaphtyl acetic acid

2,4-NAA + 4mg/l BAD: 2,4 diclorophenoxy acetic acid

IAA: Indol acetic acid

LỜI MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Cây hoa Huệ Hương (Polianthes tuberose L.) là cây hoa cắt cành thuộc nhóm thân

thảo, thích cường độ ánh sáng cao và cho hoa quanh năm Hoa Huệ Hương được nhậpvào nước ta từ rất lâu Cây hoa Huệ Hương được trồng phổ biến tại vùng Nam Trung Bộđem lại thu nhập khá cao cho người trồng và chính là cây xóa đói giảm nghèo cho vùngchuyên canh loài cây này

Hiện nay, việc canh tác cây hoa Huệ thường chủ yếu được nhân giống bằng kỹthuật nhân giống truyền thống, chủ yếu là lấy củ trồng Với phương pháp nhân giống này

dễ lây lan các mầm bệnh có sẵn trong củ, đặc biệt là bệnh virus làm giảm năng suất vàphẩm chất hoa, khiến cho giống hoa này ngày càng thoái hóa

Trong những năm gần đây, bệnh hại trên cây hoa Huệ Hương xuất hiện nhiều, đặcbiệt trong đó có một bệnh rất khó trị là bệnh chai bông Tác nhân gây bệnh hiện vẫn chưaxác định được Bệnh xuất hiện trên diện rộng làm ảnh hưởng đến năng suất và phẩm chấthoa Bệnh không làm cho cây chết ngay nhưng làm cho chồi, củ, hoa kém phát triển, làmthất thu nguồn thu nhập của nông dân Các triệu chứng bệnh do virus được mô tả bởiHorner và Person (1988), Chen và Chang (1998) gần giống các biểu hiện ở cây hoa HuệHương ở Nam Trung Bộ Vấn đề đặt ra là làm thế nào để tạo nguồn giống sạch bệnh cungcấp cho nhân dân?

Phương pháp nhân giống in vitro với rất nhiều ưu điểm, tạo được cây con trẻ hóa

và sạch bệnh nên tiềm năng sinh trưởng, phát triển và năng suất cao, khắc phục đượcnhược điểm của phương pháp nhân giống truyền thống, khôi phục lại phẩm chất vốn cócủa giống Đồng thời hệ số nhân của phương pháp nhân giống này cao đáp ứng được nhucầu về số lượng giống có chất lượng cao, ổn định đáp ứng được nhu cầu sản xuất trên quy

mô rộng Cho đến nay kĩ thuật nuôi cấy mô đã được nghiên cứu ứng dụng rất có hiệu quảtrong việc nhân giống hàng loạt các loại cây trồng tạo ngân hàng cây giống sạch bệnh,khỏe mạnh cho năng suất cao, phẩm chất tốt cung cấp cho sản xuất

2 Mục đích nghiên cứu

Xác định được ảnh hưởng của các chất đều hòa sinh trưởng thực vật lên quá trìnhphát sinh hình thái trong quy trình nhân giống cây hoa Huệ Hương bằng kỹ thuật nuôi

cấy mô tế bào, làm cơ sở cho việc hình thành quy trình nhân giống in vitro cây hoa Huệ

Hương, góp phần giải quyết những khó khăn của thực tiễn sản xuất hoa

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Cây hoa Huệ Hương là đối tượng mới của sản xuất cây giống bằng phương phápnuôi cấy mô ở nước ta Xuất phát từ yêu cầu khó khăn của thực tiễn, nhằm khắc phụchiện tượng chai bông trên cây hoa Huệ Hương, một giống hoa Huệ quý mang lại hiệu quả

cao cho nông dân Trên cơ sở đó, việc nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống in vitro

cây hoa Huệ đã được tiến hành thử nghiệm

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Đề tài đã đưa ra được các minh chứng về tác động của phương pháp khử trùng đến

tỷ lệ sống của mẫu cây, tác động của chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng phát sinhhình thái

Kết quả nghiên cứu đề tài có thể sử dụng nghiên cứu trong nuôi cấy mô tế bào câyhoa Góp phần sản xuất cây giống có hiệu quả cao, chất lượng tốt, ứng dụng vào sản xuất

sẽ góp phần nâng cao hiệu quả kinh tế của ngành sản xuất cây hoa Huệ

5 Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến quá trìnhphát sinh hình thái của mầm ngủ trên củ hoa Huệ Hương Sử dụng các chất điều hòa sinhtrưởng thực vật như: kinetin, BA, IBA, α-NAA + 4mg/l BANAA, 2,4-NAA + 4mg/l BAD, IAA

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Nhân giống cây bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào

Là phương pháp nuôi cấy mô tế bào trong môi trường dinh dưỡng nhân tạo trongđiều kiện vô trùng và tái sinh chúng thành cây con

Nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào là phương pháp mới bổ sung chocác kỹ thuật nhân giống truyền thống nhiều kỹ thuật tiến bộ, có thể khắc phục đượcnhững hạn chế của các phương pháp nhân giống truyền thống.

1.2 Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật

Năm 1838, trên cơ sở những nghiên cứu độc lập, hai nhà bác học người Đức làSchleiden và Schwamn cùng khởi xướng học thuyết tế bào Học thuyết này cho rằng tếbào là đơn vị cấu trúc và chức năng của sinh vật, vì vậy có khả năng tồn tại độc lập

Gottlibe Haberlandt là người đầu tiên đề xuất phương pháp nuôi cấy mô tế bàothực vật vào năm 1902 để chứng minh học thuyết về tính toàn năng của tế bào Theo ôngmỗi tế bào của bất kỳ cơ thể nào đều mang toàn bộ hệ thống di truyền cần thiết và đầy đủthông tin của sinh vật đó, khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triểnthành cơ thể hoàn chỉnh Ông tiến hành thí nghiệm với tế bào khí khổng và các tế bào đãđược biệt hóa về chức năng khác nhưng không thành công Điều đó đã giảm sự tin tưởngcủa các nhà khoa học đối với phương pháp nuôi cấy mô tế bào trong thời gian dài

Đến năm 1922 học trò của Gottlibe Haberlandt là Kotte và Robbinss đã làm lại thínghiệm của ông Họ đã lấy đỉnh sinh trưởng của rễ cây hòa thảo nuôi cấy trong môitrường có khoáng, đường, đầu rễ đã sinh trưởng mạnh và tạo ra hệ rễ nhỏ và cả rễ phụ.Tuy nhiên sự sinh trưởng chỉ tồn tại trong một thời gian mặc dù chuyển sang môi trườngmới

Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ 2 trong lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật khiWhite đã nuôi cấy thành công đầu tiên rễ cà chua trên môi trường lỏng có chứa đường,muối khoáng, dịch chiết nấm men Các thí nghiệm tiếp theo ông thay thế dịch chiết nấmmen bằng hỗn hợp 3 vitamin nhóm B : thiamin (B1), nicotinic acid (B3), pyridioxin (B6).Sau đó ít lâu Went và Thimann tìm ra chất kích thích sinh trưởng đầu tiên là IAA

Năm năm sau Gautheret đã thông báo về sự tái sinh của cây cà rốt, đây cũng là lầnđầu tiên sự phát triển của mô sẹo không bị giới hạn Bằng cách thêm IAA vào môi trườngnuôi cấy, ông có thể kích thích sự phát triển của mô đã biệt hóa trên vết cắt của bề mặtmẫu cấy vô trùng Sau này người ta mới thấy rằng callus có thể trực tiếp nuôi cấy vô thờihạn Đến năm 1948, Steward xác nhận tác dụng của nước dừa trên mô sẹo cà rốt Trongthời gian này nhiều chất sinh trưởng thuộc nhóm auxin được tổng hợp nhưnaphthylacetiic acid (NAA), 2,4-NAA + 4mg/l BADiclophenoxyacetic acid (2,4D) Nhiều tác giả nhận thấy

cùng với nước dừa, NAA và 2,4 D đã giúp tạo mô sẹo gây phân chia tế bào thành công ởnhiều đối tượng thực vật trước đó khó nuôi cấy.

Năm 1955, Miller và Skoog đã xác định vai trò của chất kích thích sinh trưởng là6-NAA + 4mg/l BAFurfuryl aminopurin (kinetin) Việc phát hiện ra chất kích thích sinh trưởng, vitamin vànước dừa là những bước tiến quan trọng trong giai đoạn thứ 2

Năm 1957, Miller và Skoog đã công bố các kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của

tỷ lệ auxin/kinetin trong môi trường nuôi cấy đối với sự hình thành cơ quan, tỷ lệauxin/kinetin thấp, mô sẹo có khuynh hướng tạo chồi, ngược lại tỷ lệ auxin/kinetin tăng,

mô sẹo có khuynh hướng tạo rễ Hiện nay, những kết quả này cũng được quan sát thấytrên nhiều loại cây khác nhau và đóng góp nhiều vào việc điều khiển quá trình sinhtrưởng, phát triển và phát sinh cơ quan của mô tế bào trong nuôi cấy Thành công củaMiller và Skoog đã mở đầu cho giai đoạn thứ ba của lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật

Những thành công trên là cơ sở bùng nổ ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế báothực vật trong sản xuất Morel và Martin đã phát triển kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

để tạo giống sạch bệnh ở khoai lang và hoa lan Chính hai nhà khoa học này đã mở đầucho một hướng mới của nuôi cấy mô tế bào thực vật, đó là vi nhân giống

Từ những năm 1960, ngoài các hướng trên, nuôi cấy bao phấn và hạt phấn, nuôicấy tế bào đơn và tế bào trần được phát triển mạnh Các kỷ thuật lai soma bằng dung hợp

tế bào trần và kỷ thuật chuyển gen được phát triển và thu được những thành tựu đáng kể

Chúng ta đang bước vào giai đoạn thứ 4 của nuôi cấy mô tế bào thực vật Đó làgiai đoạn nuôi cấy mô tế bào được ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, sản xuấtcác chất thứ cấp có hoạt tính sinh học và vao nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậccao

1.3 Cơ sở lý luận của nuôi cấy mô tế bào thực vật

Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào in vitro là học thuyết về tính

toàn năng (totipotence) của tế bào Theo Haberlandt G (1902), nhà thực vật người Đức,tất cả các tế bào của cây đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của cơ thể, khi gặpđiều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có khả năng tái sinh và phát triển thành cá thể hoànchỉnh Thực tế đã chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từmột tế bào riêng rẽ Hàng trăm loài cây trồng đã được nhân giống trên qui mô thương mại

bằng cách nuôi cấy trong môi trường nhân tạo vô trùng và tái sinh chúng thành cây với hệ

số nhân giống vô cùng lớn (Murashige, 1980)

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy in vitro thực vật thực chất là kết quả

của các quá trình phân hóa và phản phân hóa Tất cả các tế bào trong các cơ quan khácnhau của cơ thể thực vật đều bắt nguồn từ tế bào phôi sinh Sự chuyển tế bào phôi sinhthành các tế bào chuyên hóa để đảm nhiệm các chức năng khác nhau được gọi là sự phânhóa tế bào Còn quá trình phản phân hóa thì ngược lại với quá trình phân hóa, có nghĩa là

tế bào đã phân hóa thành mô chức năng không hoàn toàn mất đi khả năng phân chia mà ởđiều kiện thích hợp chúng có thể trở về dạng phôi sinh và tái phân chia

Bản chất của quá trình này là một quá trình hoạt hóa, ức chế các gen Trong quátrình phát triển cá thể, ở từng thời điểm nhất định đều có một số gen nhất định được hoạthóa cho ta tính trạng mới, một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động Điều này xảy ra theomột chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc phân tử DNA của mỗi tế bào khiến quátrình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hòa Mặt khác, khi nằmtrong khối mô bình thường, tế bào luôn bị chi phối bởi các tế bào xung quanh Khi tế bàođược tách riêng rẽ, tác dụng ức chế của các tế bào xung quanh không còn nữa thì các genđược hoạt hóa và quá trình phân hóa sẽ xảy ra theo một quá trình định sẵn

1.4 Ưu, nhược điểm của phương pháp nhân giống in vitro

Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng khắc phục được nhiều trở ngại mà

những phương pháp nhân giống khác thường gặp Sau đây là những ưu điểm chính :-NAA + 4mg/l BA Cây con được trẻ hóa và sạch bệnh, vì vậy có tiềm năng sinh trưởng, phát triển và năngsuất cao

-NAA + 4mg/l BA Tạo cây con đồng nhất về mặt di truyền, bảo tồn được các tính trạng đã chọn lọc

-NAA + 4mg/l BA Tạo được dòng thuần của các cây tạp giao

-NAA + 4mg/l BA Tạo được cây có genotip mới (đa bội, đơn bội)

-NAA + 4mg/l BA Bảo quản và lưu giữ tập đoàn gen

-NAA + 4mg/l BA Có khả năng sản xuất quanh năm

-NAA + 4mg/l BA Có thể nhân nhanh nhiều cây không kết hạt trong những điều kiện sinh thái nhất địnhhoặc hạt nảy mầm kém

-NAA + 4mg/l BA Hệ số nhân giống cực kì cao (thường đạt được ở các loài cây khác nhau trong phạm vi

từ 36 -NAA + 4mg/l BA 1012/năm), rút ngắn thời gian đưa một giống mới vào sản xuất đại trà

Trong công tác giống cây trồng, vấn đề được quan tâm hàng đầu là chất lượng và

số lượng giống Bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, người ta đã tạo ra đượcnhững giống cây hoàn toàn sạch virus Limasset và Cornel (1945) đã chứng minh đượcrằng, nồng độ virus trong thực vật giảm dần ở bộ phận gần đỉnh sinh trưởng, riêng đỉnhsinh trưởng thì hoàn toàn sạch virus (Morel và Martin, 1952) Nguyên nhân của hiệntượng này là:

-NAA + 4mg/l BA Đỉnh sinh trưởng không có hệ mô dẫn, làm cho virus và vi sinh vật không có khả năngthâm nhập

-NAA + 4mg/l BA Đỉnh sinh trưởng là nơi sinh tổng hợp của auxin nên hàm lượng auxin khá cao, auxin cótác dụng ức chế sinh sản của virus

-NAA + 4mg/l BA Quá trình phân chia của tế bào phôi sinh (ở đỉnh sinh trưởng) không kéo theo sự phânchia của virus

Về phương diện hệ số nhân, nhân giống in vitro là phương pháp không gì có thể so sánh kịp, kể cả phương pháp nhân giống bằng hạt Nuôi cấy in vitro có thể coi là một

cuộc cách mạng về hệ số nhân

Nhược điểm chính của phương pháp nuôi cấy in vitro là đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền và

kỹ thuật cao nên chỉ có hiệu quả đối với những cây có giá trị cao hoặc khó nhân giốngbằng phương pháp khác (Nickell, 1973) Ngoài ra, phương pháp này còn có những bất lợisau:

-NAA + 4mg/l BA Mặc dù số lượng cây giống thu được có thể rất cao nhưng cây con có kích thước nhỏ,đòi hỏi phải có chế độ chăm sóc đặc biệt ở giai đoạn sau ống nghiệm

-NAA + 4mg/l BA Cây có thể có những đặc tính không mong muốn

-NAA + 4mg/l BA Khả năng tạo đột biến tăng

-NAA + 4mg/l BA Khả năng tái sinh có thể bị mất đi do cấy truyền callus hay huyền phù tế bào nhiều lần.-NAA + 4mg/l BA Cây giống có thể bị nhiễm bệnh đồng loạt

Tuy vậy phương pháp nhân giống in vitro ngày càng được sử dụng rộng rãi để

phục vụ cho những mục đích sau:

-NAA + 4mg/l BA Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các loại cây trồngkhác nhau như cây lương thực có củ, cây rau, cây hoa, cây cảnh và cây dược liệu thuộcnhóm cây than thảo

-NAA + 4mg/l BA Nhân nhanh và kinh tế các kiểu gen quí hiếm của giống cây lâm nghiệp và gốc ghéptrong nghề trồng cây ăn quả, cây cảnh thuộc nhóm than gỗ.

-NAA + 4mg/l BA Nhân nhanh ở điều kiện vô trùng và cách ly tái nhiễm kết hợp với làm sạch virus

-NAA + 4mg/l BA Bảo quản và lưu giữ các tập đoàn giống nhân giống vô tính và các loài giao phấn trongngân hàng gen

1.5 Kỹ thuật nuôi cấy in vitro

Kỹ thuật nuôi cấy in vitro có thể chia thành các bước sau:

-NAA + 4mg/l BA Lựa chọn đối tượng (cây trồng, giống, bộ phận cây) thích hợp

Nguyên liệu sử dụng cho nuôi cấy mô tế bào thực vật có thể là bất cứ bộ phận nàocủa cây: các đoạn của rễ, thân, các phần của lá (cuống lá, phiến lá…), các cấu trúc củaphôi như lá mầm, trụ trên, trụ dưới lá mầm, hạt phấn, noãn… thậm chí cả mẫu thân ngầmhay cơ quan dự trữ dưới mặt đất (củ, căn hành…) cũng được dùng cho nuôi cấy

-NAA + 4mg/l BA Khử trùng mẫu và tiến hành nuôi cấy

Nguyên liệu để nuôi cấy in vitro được chọn từ những cá thể ưu tú của loài, khỏe

và sạch bệnh, nhưng ít nhiều đều có nhiễm vi sinh vật và nấm tùy thuộc vào sự tiếp xúccủa chúng với môi trường xung quanh Có một số bộ phận như phôi trong hạt, mô trongquả, dòng lúa non… ít bị nhiễm vi sinh vật hơn các bộ phận khác, ngược lại các bộ phậnnằm dưới mặt đất như rễ, củ, thân ngầm, có lượng vi khuẩn và nấm rất cao Phương phápthông dụng nhất hiện nay để loại bỏ hệ vi sinh vật khỏi vật liệu nuôi cấy là sử dụng cáchóa chất có hoạt tính diệt khuẩn và nấm

Khả năng tiêu diệt nấm và vi sinh vật của hóa chất khử trùng phụ thuộc vào nồng

độ, thời gian xử lý và mức độ xâm nhập của chúng vào các ngõ ngách trên bề mặt của môcấy Để làm tăng hiệu quả, người ta thường nhúng mẫu vào ethanol 70 -NAA + 4mg/l BA 80% trong 30giây, sau đó mới xử lý bằng dung dịch diệt khuẩn Đối với những mẫu có bề mặt đượcbao phủ lớp sáp, muốn đạt được kết quả tốt nhất cần cho them vào dung dịch khử trùngvài giọt Tween 20, Tween 80 hay teapol…vì các chất này làm tăng tính bám dính của hóachất khử trùng Với các mẫu quá bẩn phải rửa kỹ bằng nước xà phòng và để dưới vòinước chảy từ 20 đến 30 phút sẽ có tác dụng làm giảm đáng kể hệ vi khuẩn khỏi mẫu cấy

Tác nhân khử trùng, ngoài tác dụng diệt vi sinh vật còn ảnh hưởng đến mô cấy vìvậy việc lực chọn loại hóa chất phải căn cứ vào mức độ nhiễm khuẩn và độ mẫn cảm củatừng mẫu Trong số các hóa chất hay được sử dụng để khử trùng thì Calcium hypoclorite

và natri hypoclorite là hay được sử dụng hơn cả vì có tính độc thấp đối với mô được xử

lý, không gây ức chế sinh trưởng và hiệu quả diệt khuẩn tốt Nồng độ của Calciumhypoclorit và natri hypoclorit tương ứng thường là 5 -NAA + 4mg/l BA 15% và 0,5 -NAA + 4mg/l BA 2% trong thời gian 15-NAA + 4mg/l BA 30 phút Tuy nhiên, những chất này không bền nên trong thực tế HgCl2 cũng hay đượcdùng để thay thế

-NAA + 4mg/l BA Xác định điều kiện nuôi cấy (môi trường dinh dưỡng, nhiệt độ, ánh sáng) để điều khiểnquá trình phát triển nuôi cấy theo định hướng

Thành công của phương pháp nuôi cấy in vitro phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện

nuôi cấy Nhu cầu dinh dưỡng cho sự sinh trưởng và phát triển tối ưu của các loài làkhông giống nhau, ngay cả giữa các bộ phận trong cùng một cơ thể cũng ít nhiều khácnhau Sự lựa chọn môi trường nuôi cấy bao gồm cả chất lượng và số lượng hóa chất sửdụng đóng vai trò quyết định đối với bản thân sự phân hóa và chiều hướng phân hóa của

tế bào

Cho đến nay, đã có nhiều loại môi trường dinh dưỡng được tìm ra : môi trườngMurashige và Skoog (1962), môi trường Linsmaer và Skoog (1963), môi trườngGamborg (1968), môi trường Knop (1974)… Đây là những môi trường cơ bản và sẽ đượccải tiến thành nhiều loại môi trường khác nhau phù hợp với mỗi đối tượng nghiên cứu vàmục đích thí nghiệm Trong số đó, môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) đượcđánh giá là phù hợp nhất cho đa số các loài thực vật và chính Murashige (1974) đã dungmôi trường này để nuôi cấy nhiều loài cây trồng

Thành phần chủ yếu của tất cả các loại môi trường gồm những nhóm chất sau :muối khoáng đa lượng và vi lượng (muối chloride, nitrate, sulphate, chất tham gia điềuchỉnh sự phân hóa của rễ, chồi…

Các auxin đều có hiệu quả sinh lý ở nồng độ thấp, thường được sử dụng với nồng

độ từ 10-NAA + 4mg/l BA1 M đến 10-NAA + 4mg/l BA6 M tùy theo từng chất, mục đích và đối tượng nghiên cứu Auxinđược thêm vào môi trường nuôi cấy sẽ kết hợp với auxin nội sinh để điều khiển chiềuhướng và cường độ các quá trình sinh trưởng Hàm lượng auxin thấp sẽ kích thích sựphân hóa rễ, ngược lại ở hàm lượng cao sẽ phát động sự tạo mô sẹo

Các auxin thường được sử dụng trong nuôi cấy mô là IBA (indol butyric acid), α-NAA + 4mg/l BANAA (a-NAA + 4mg/l BAnaphtylacetic acid), 2,4-NAA + 4mg/l BAD (2,4 diclorophenoxy acetic acid), IAA (indool aceticacid)

Cytokinin là nhóm phytohormone dẫn xuất của adenine, có vai trò sinh lý tương tựnhau Cytokinin liên quan chặt chẽ với phân bào, duy trì sự trẻ hóa các cơ quan, làm giảm

ưu thế ngọn, kích thích sự phân hóa chồi từ mô sẹo nuôi cấy… Nồng độ cytokinin caokìm hãm sự hình thành và phát triển của rễ

Các cytokinin thường được sử dụng trong nuôi cấy là kinetin, BAP (benzylaminopurin)với nồng độ 10-NAA + 4mg/l BA4 -NAA + 4mg/l BA 10-NAA + 4mg/l BA7 M

Nhiều tác giả đã tổng kết rằng sự biệt hóa cơ quan thực vật in vitro là kết quả tác

động qua lại giữa hai nhóm auxin và cytokinin Cân bằng tỷ lệ auxin/cytokinin nếunghiêng về phía auxin sẽ kích thích sự hình thành rễ, ngược lại nếu cân bằng này nghiêng

về phía cytokinin sẽ thúc đẩy sự tạo chồi Ở tỷ lệ trung gian, mô sẹo được hình thành.Đây là nguyên tắc chung để điều khiển quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy Các

mô khác nhau có phản ứng không giống nhau Vì vậy, với từng loại mô và từng giai đoạnsinh trưởng khác nhau, việc tìm được tổ hợp nồng độ auxin/cytokinin thích hợp có ýnghĩa quan trọng

-NAA + 4mg/l BA Đưa những cây tái sinh được trở lại điều kiện tự nhiên

Đây là giai đoạn quan trọng bao gồm việc huấn luyện cây in vitro thích nghi với

điều kiện thay đổi nhiệt độ, độ ẩm, sự mất nước, sâu bệnh và chuyển từ trạng thái didưỡng sang tự dưỡng hoàn toàn Quá trình thích nghi ở đây được hiểu là quá trình thay

đổi đặc điểm sinh lý và giải phẫu của cây in vitro Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi là

2 -NAA + 4mg/l BA 3 tuần

1.6 Các hướng nhân giống vô tính in vitro

Khả năng thành công của nuôi cấy mô tế bào phụ thuộc chủ yếu vào trạng thái tuổicủa tế bào Tế bào càng gần trạng thái phôi sinh bao nhiêu, khả năng nuôi cấy thành côngcàng cao Như vậy tế bào phôi thường cò triển vọng nhất rồi đến tế bào các đỉnh sinhtrưởng đang ở trạng thái hoạt động (đỉnh ngọn, chóp rễ) và sau đó là tế bào ở trạng tháingủ nghỉ (chồi nách)

Trong nhân giống in vitro, cây non có thể được tái sinh từ các điểm sinh trưởng có

sẵn trong các bộ phận (phôi, đỉnh chồi, chồi nách) hoặc từ những mô có khả năng hìnhthành điểm sinh trưởng phụ Có hai phương pháp tái sinh cây con:

+ Tái sinh trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng, phôi, ngọn, chồi hay chồi nách

+ Tái sinh cây gián tiếp thông qua giai đoạn hình thành mô sẹo

Tái sinh trực tiếp từ mẫu nuôi cấy là quá trình phát động những điểm sinh trưởng

đã tồn tại sẵn trong mô nuôi cấy phân chia và tái sinh thành cây Các điểm sinh trưởngnày bao gồm các tế bào phôi sinh chứa 2n nhiễm sắc thể đặc trưng cho loài Cây con tạo

ra theo con đường này hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền và duy trì được những tínhtrạng của cây mẹ

Trong hướng tái sinh gián tiếp, mẫu nuôi cấy không tái sinh thành cây ngay màphát triển thành khối mô sẹo (callus) Có thể thấy ngay là hệ số nhân của hướng này vôcùng lớn Từ một khối mô sẹo có thể tạo ra khối lượng lớn cây giống trong một thời gianngắn thong qua kỹ thuật tạo phôi soma hoặc chế ra hạt giống nhân tạo Nhiều cây tái sinh

từ mô sẹo có thể rất khác với cây mẹ về mặt di truyền Nguyên nhân của hiện tượng này

là do trong quá trình phát sinh và phát triển của mô sẹo, thường xuất hiện những tế bàođột biến mang số nhiễm sắc thể không giống với tế bào ban đầu hoặc chứa những độtbiến gen do hiện tượng nội nguyên phân Nội nguyên phân là hiện tượng nhân đôi nhiễmsắc thể không kèm theo sự phân bào trong thực tế và là hiện tượng tự nhiên trong cơ thểthực vật, nhưng tăng lên dưới ảnh hưởng của các thành phần của môi trường dinh dưỡng

và điều kiện cũng như phướng pháp nuôi cấy, nhất là khi cấy chuyển nhiều lần Đột biếntuy không có lợi cho việc duy trì nguyên trạng những đặc tính di truyền trong quá trìnhtạo giống nhưng lại chính là đối tượng tìm kiếm trong quá trình cải tạo giống Ngoài việccung cấp những đột biến tự nhiên, mô sẹo còn là đối tượng lý tưởng để tạo ra những độtbiến nhân tạo bằng các tác nhân gây đột biến hoặc công nghệ gen

Vì vậy, trong nhân giống in vitro, để nhân nhanh những cá thể đã chọn lọc người

ta thường tái sinh cây theo hướng trực tiếp, còn mục tiêu của tái sinh gián tiếp là tạo ranhiều biến dị để phục vụ cho việc chọn lọc và cải tạo giống cây trồng

1.7 Quy trình nhân giống in vitro

Quy trình nhân giống được chia làm 5 giai đoạn:

1.7.1 Lấy mẫu và xử lý mẫu

Đây là giai đoạn quan trọng quyết định vi nhân giống Khả năng nhiễm bệnh củamẫu phụ thuộc vào cách lấy mẫu, xử lý mẫu trong điều kiện khử trùng Mỗi cây đều cóngưỡng nhiệt độ và độ ẩm phù hợp khi bảo quản và xử lý mẫu Với cây nhiệt đới và ánhiệt đới thì nhiệt độ 25oC, độ ẩm 75% là điều kiện giữ mẫu thích hợp, tỷ lệ nhiễm bệnhthấp.

1.7.2 Tái sinh mẫu nuôi cấy

Mục đích của giai đoạn này là tái sinh các cơ quan từ mẫu nuôi cấy Mẫu thường

là chồi đỉnh, chồi nách hay lát cắt đốt thân tùy thuộc đối tượng và mục đích nghiên cứu.Quan trọng nhất là cần chú ý đến trạng thái sinh lý của mẫu Khả năng thành công củanuôi cấy mô, tế bào phụ thuộc chủ yếu vào trạng thái tuổi của tế bào, càng gần trạng tháiphôi sinh bao nhiêu thì nuôi cấy càng có khả năng thành công bấy nhiêu Như vậy, tế bàophôi thường có triển vọng nhất rồi đến tế bào đỉnh sinh trưởng đang hoạt động (đỉnhngọn, đầu rễ), sau đó là tế bào ở trạng thái ngủ (chồi nách)

1.7.3 Nhân nhanh chồi

Đây là giai đoạn đánh giá tính ưu việt của phương pháp vi nhân giống Môi trường

ở giai đoạn này được bổ sung điều hòa sinh trưởng thực vật (cytokinin, auxin) tăng thờigian chiếu sáng lên 16 giờ/ngày, cường độ ánh sáng tối thiểu là 1000 lux Ánh sáng tím làthành phần kích thích phân hóa mạnh, nhiệt độ thích hợp từ 20 -NAA + 4mg/l BA 30oC

1.7.4 Tái sinh rễ

Khi chồi đạt đến một kích thước nhất định, mẫu được chuyển sang môi trường tạo

rễ Môi trường này thường được bổ sung auxin (IBA, α-NAA + 4mg/l BANAA, 2,4-NAA + 4mg/l BAD) ở liều lượng thíchhợp Tuy nhiên, ở một số cây như chuối thì sự hình thành rễ tốt hơn ở môi trường không

có chất điều hòa sinh trưởng

1.7.5 Đưa cây in vitro ra vườn ươm

Ở giai đoạn này, cây được chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng Vì vậycần phải huấn luyện cho cây thích nghi với sự biến đổi của môi trường, đồng thời thayđổi những đặc điểm sinh lý và giải phẫu của cây con

1.8 Sơ lược về đối tượng nghiên cứu

1.8.1 Nguồn gốc

Cây hoa Huệ Hương có tên khoa học là Polianthes tuberose L Đây là loài hoa cắt

cành, thuộc nhóm cây thân thảo, cho hoa quanh năm, nở hoa vào ban đêm, có nguồn gốcchủ yếu từ Mexico và hiện đã có mặt ở nhiều nước trên thế giới

Loài hoa này đã được du nhập vào nước ta từ rất lâu và được trồng phổ biến tạimột số tỉnh thuộc vùng Nam Trung Bộ và Nam Bộ

-NAA + 4mg/l BA Họ: Amarylidaceae (Thủy Tiên)

-NAA + 4mg/l BA Chi: Polianthes

-NAA + 4mg/l BA Loài: Polianthes tuberose L.

Theo kết quả thống kê trên thế giới thì hiệntại ở Mexico có khoảng 12 loài hoa Huệ

1.8.3.2 Lá

Cây hoa huệ có lá đơn mọc quanh gốc, xanh và dài, cuống lá gốc rộng và to thànhhình như cái bao bao lấy củ, giữa phiến lá và bẹ lá không phân biệt rõ ràng Chiều dài lákhoảng 20 -NAA + 4mg/l BA 30cm, bề rộng của lá từ 0,5 -NAA + 4mg/l BA 1cm.

Cây huệ có bộ rễ chùm phát triển mạnh, rễ phân bố chủ yếu ở lớp đất mặt 1-NAA + 4mg/l BA15cm

Có 2 loại rễ: rễ mọc từ củ mẹ ban đầu gọi là rễ sơ cấp và rễ mọc từ củ con gọi là rễ thứcấp, củ huệ thực chất chính là thân ngầm của cây huệ

1.8.4 Yêu cầu ngoại cảnh của cây hoa Huệ Hương

Trước khi phân hóa hoa và lúc cây có 5 -NAA + 4mg/l BA 6 lá cần nhiệt độ mát mẻ (15 -NAA + 4mg/l BA 22oC) nếu không

tỷ lệ nở hoa sẽ rất thấp và chất lượng hoa kém

1.8.4.2 Ánh sáng

Cây hoa Huệ Hương là cây ưa sáng mạnh Giai đoạn đầu sau khi trồng, cây sốngchủ yếu nhờ vào nguồn dinh dưỡng từ củ Khi cây ra lá, cây sử dụng chất dinh dưỡng từquá trình quang hợp Trong thời kỳ phân hóa mầm hoa nếu không cung cấp đủ ánh sángthì tỷ lệ ra hoa thấp, hoa nhỏ

Ngoài ra, nếu thiếu ánh sáng cây hoa Huệ Hương rất dễ bị nhiễm bệnh Trong điềukiện ngày ngắn, ánh sánh yếu thì ảnh hưởng mạnh đến sự sinh trưởng phát triển của cây.Cường độ ánh sánh cũng là yếu tố ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phân hóa mầm hoa

Nếu cường độ chiếu sáng dưới 3500 lux thì cường độ quang hợp và sự thoát hơi nướcgiảm, cây mọc vống, cành lá yếu Do đó khi trồng ở vụ đông cần đảm bảo chế độ chiếusáng phù hợp để tạo điều kiện thuận lợi cho sự phân hóa mầm hoa, hoa tự dài đồng thờităng chất lượng hoa Số giờ chiếu sáng thích hợp cho cây hoa huệ sinh trưởng và pháttriển tốt từ 12 -NAA + 4mg/l BA 16 giờ và cường độ ánh sáng khoảng 6000 lux.

1.8.4.3 Nước

Cây hoa Huệ Hương là cây rễ củ nên khi nảy mầm cũng như quá trình sinh trưởngcần phải có đủ nước Các giai đoạn sinh trưởng khác nhau thì có nhu cầu về nước khácnhau Sau khi trồng vài ngày, rễ mầm nhú ra và phát triển thì yêu cầu đất xung quanh củphải đủ ấm, vì vậy trước khi trồng nên tưới nước Khi cây mọc nếu đất quá khô thì phảitưới nước ngay Trong suốt thời kỳ sinh trưởng, cây hoa Huệ Hương cần rất nhiều nước,đặc biệt là ở giai đoạn có 3 -NAA + 4mg/l BA 7 lá, đây là thời kỳ cây có nhu cầu về nước lớn, nếu thiếunước cây sẽ sinh trưởng chậm ảnh hưởng đến khả năng phân hóa của hoa

1.8.4.4 Đất

Cây hoa Huệ Hương có thể trồng trên bất cứ loại đất nào, tuy vậy cây chỉ sinhtrưởng tốt, cho hoa đẹp trên loại đất hơi kiềm (pH = 6 -NAA + 4mg/l BA 7), có cấu trúc mịn, giữ ẩm tốt.Tuy vậy, cây hoa Huệ Hương không thích hợp ở nơi quá trũng, chua

Cây hoa Huệ Hương có thể trồng trên các loại đất có thành phần cơ giới sau:-NAA + 4mg/l BA Đất cát pha có độ tơi xốp cao, độ hổng lớn, thoáng khí, ngấm nước tốt nhưng có độ phìkém Do đó, khi trồng hoa Huệ Hương trên loại đất này cần phải bón nhiều phân hữu cơ

để bổ sung dinh dưỡng cho cây

-NAA + 4mg/l BA Đất thịt nhẹ, thoát nước tốt, giàu dinh dưỡng là loại đất trồng thích hợp đối với cây hoaHuệ Hương Nếu đất quá ẩm, rễ rất dễ bị thối, vì thế vào mùa mưa cần chống úng, tháonước kịp thời không để ruộng bị ngập úng

Mặc khác hoa Huệ Hương cũng là cây rất mẫn cảm với các loại muối kim loạinặng Đặc biệt là loại đất có hàm lượng chì cao, rễ cây sinh trưởng kém, cây phát triểnchậm và khả năng ra hoa kém Chính vì vậy trước khi trồng hoa huệ cần chú ý đến cácbiện pháp canh tác đất

1.8.5 Kỹ thuật trồng và chăm sóc

1.8.5.1 Chuẩn bị giống

Theo phương pháp canh tác truyền thống, cây huệ trồng bằng củ, vì vậy khi cây cónhiều lá úa vàng thì bới củ, tách nhẹ nhàng từng củ, chọn những củ có kích thước đạt tiêuchuẩn sau đó cắt bỏ lá và rễ tiến hành phơi nắng 2 -NAA + 4mg/l BA 3 ngày cho lá héo rồi đem bảo quảnnơi thoáng mát, cao ráo, sau 2 -NAA + 4mg/l BA 3 tháng có thể đem trồng trở lại Trong thời gian bảoquản nên thường xuyên kiểm tra tránh hiện tượng củ bị thối.

Trong những năm gần đây, xuất hiện bệnh chai bông trên diện rộng, vì vậy đểphòng trừ bệnh chai bông trên cây hoa Huệ Hương cần tiến hành các bước sau:

-NAA + 4mg/l BA Không sử dụng củ bị nhiễm bệnh hoặc lấy củ từ những ruộng đã bị nhiễm bệnh trước đólàm củ giống

-NAA + 4mg/l BA Phơi củ trong vòng 1 -NAA + 4mg/l BA 1,5 tháng trước khi đem ra trồng

-NAA + 4mg/l BA Nên thay đổi chân đất sau mỗi vụ trồng hoặc luân canh cây hoa Huệ Hương với mộtloại cây trồng khác

-NAA + 4mg/l BA Khi phát hiện thấy có triệu chứng bệnh cần loại bỏ cây bệnh ra khỏi ruộng, phơi khô vàđốt bỏ Khi không có củ giống sạch bệnh, có thể chọn củ ở cây không có triệu chứngbệnh và tiến hành phơi nắng kĩ từ 1-NAA + 4mg/l BA1,5 tháng, sau đó xử lý củ với nước nóng khoảng 56 -NAA + 4mg/l BA

57oC

Quy trình xử lý củ Huệ Hương bằng nước nóng để phòng trừ bệnh chai bông gồmcác bước sau:

-NAA + 4mg/l BA Bước 1: Chuẩn bị củ Huệ Hương để xử lý

Sau khi thu hoạch, đem phơi củ trong 1 -NAA + 4mg/l BA 1,5 tháng, chọn những củ có đường kính

từ 3 cm trở lên để xử lý

-NAA + 4mg/l BA Bước 2: Xử lý củ Huệ Hương bằng nước nóng

Đổ nước nóng và nước lạnh vào trong một thùng nhựa với tỷ lệ 6:5, rồi điều chỉnh

để nhiệt độ nước trong thùng khoảng 56 -NAA + 4mg/l BA 57oC thì bắt đầu cho củ vào nước Lượng nước

xử lý cần gấp 6 -NAA + 4mg/l BA 7 lần lượng củ xử lý Sau đó đậy nắp thùng khoảng 15 phút và lại chỉnhcho nước trở lại nhiệt độ 56 -NAA + 4mg/l BA 57oC bằng cách đổ thêm một ít nước sôi từ từ khuấy đều, vàngâm củ trong thùng đậy kín trong 15 phút nữa

-NAA + 4mg/l BA Bước 3: Sau khi xử lý xong, củ được rải đều và phơi khô trong 2 ngày sau rồi đem trồng

ra ruộng

1.8.5.2 Chuẩn bị đất

Nên chọn nơi trảng nắng, luống trồng liên tiếp rộng khoảng 1,2 m và sâu 0,5m để

có thể giữ nước tốt Luống đất nên bố trí dọc theo hướng mặt trời để cây nhận ánh sángtốt và đồng đều Trước khi trồng nên bón phân lót và phun xịt các loại thuốc diệt nấm vàmầm bệnh

1.8.5.3 Chăm sóc

Trong canh tác cây hoa Huệ Hương yếu cầu về nước rất là quan trọng, phảithường xuyên tưới nước đồng thời phải xớt đất và làm cỏ giúp cho bộ rễ phát triển tốt.Phân bón thường sử dụng để bón cho cây là hỗn hợp (Ure, lân và Kali), sau khi trồngđược khoảng 2 -NAA + 4mg/l BA 3 năm cây hoa Huệ Hương bắt đầu bị thoái hóa: sinh trưởng chậm, chohoa ít và chất lượng kém Do đó phải nhổ lên phân loại củ và trồng lại trên một diện tíchkhác

Trong thời gian trồng và thu hoạch cần tiến hành trừ cỏ, xới đất, bón phân, tướinước, phun thuốc…, thường xuyên để tránh lây lam nguồn sâu bệnh hại

Khi trừ cỏ phải tiến hành theo nguyên tắc trừ sớm, trừ khi cỏ còn non và trừ sạch,

có thể trừ cỏ bằng tay hoặc bằng thuốc

Trong quá trình trồng, nên bón phân với số lượng ít và chia thành nhiều đợt nhưbón lót, bón thúc Ngoài cách bón vào đất còn có thể phun lên lá để bổ sung dinh dưỡng,

hỗ trợ cho quá trình ra hoa và chống rụng nụ hoa Trong thời kì phân hóa mầm hoa cầnbón thêm phân đạm, khi ra nụ và sau khi ra hoa cần bón thêm lân và kali

1.8.6 Vấn đề sâu bệnh trên cây hoa Huệ Hương

Trên cây hoa Huệ Hương, sâu thường gặp là rệp sáp, nhện đỏ và nhất là tuyếntrùng

Bệnh gây hại trên cây hoa Huệ Hương được chia thành hai nhóm:

-NAA + 4mg/l BA Nhóm bệnh không truyền nhiễm, do ngoại cảnh không phù hợp thường gặp nhất là thốixám, thối gốc, đốm lá, gỉ sắt… có thể phòng trị bằng các loại thuốc hóa học

-NAA + 4mg/l BA Nhóm bệnh truyền nhiễm chủ yếu là do vi sinh vật ký sinh gây ra bao gồm : vi khuẩn,

xạ khuẩn, nấm, mycoplasma, virus,… thường rất khó trị, nhất là bệnh do virus gây ra rất

dễ lây lan và phát tán thành dịch, gây hại nghiêm trọng và truyền từ đời này sang đờikhác, đặc biệt là ở nhóm cây nhân giống vô sinh (bằng củ) như cây huệ Virus không thểphòng chống hay tiêu diệt bằng hóa chất như vi khuẩn, nấm,, sâu bệnh, cách duy nhất đểloại bỏ virus là phải tách chúng ra khỏi cây bị bệnh, trả lại cho cây cuộc sống bình

thường khỏe mạnh Vì vậy, biện pháp làm sạch virus phải luôn được kết hợp với biệnpháp duy trì tính sạch bệnh.

Sau khi trồng khoảng 1 tháng, ở cây hoa Huệ Hương thường bị nhện đỏ phá hạinặng trên lá, từ 3 -NAA + 4mg/l BA 4 tháng trở đi cây dễ bị rệp sáp phá hại nên có thể phòng trị bằng cácloại thuốc sau : Nissorun, Kelthan 20 EC, Comite, Basudin 10H Khoảng tháng 9 -NAA + 4mg/l BA 10,khi trời mưa kéo dài huệ dễ bị úng thối lá, thối củ thì có thể khắc phục hiện tượng nàybằng các loại thuốc như: Anuil, Topsin, Ridomol…

1.8.7 Giá trị kinh tế

Với đặc điểm sinh thái dễ thích nghi với vùng khí hậu nhiệt đới như ở nước tađồng thời yêu cầu trồng và chăm sóc không quá khắt khe nên Huệ Hương được trồng kháphổ biến và đem lại thu nhập rất cao cho người dân

Trong những năm gần đây, cây hoa Huệ Hương đem lại thu nhập cao cho ngườidân các tỉnh phía Nam như Tiền Giang, Đồng Tháp… Đặc biệt, tại các tỉnh Nam Trung

Bộ như Bình Định, Khánh Hòa, từ khu người dân mở rộng diện tích và nâng cao kỹ thuậtcanh tác, cây hoa huệ đã trở thành cây trồng chính, đem lại thu nhập cao và trở thành câyxóa đói giảm nghèo Hiện nay, thu nhập từ cây hoa Huệ Hương ở đồng bằng song CửuLong bình quân từ 150 -NAA + 4mg/l BA 200 triệu/ha và ở Nam Trung Bộ là 80 -NAA + 4mg/l BA 150 triệu/ha

Ngoài giá trị sử dụng thông thường như trên, gần đây người ta còn sử dụng một số

bộ phận của cây làm thuốc chữa bệnh và chế ra các loại dầu thơm

Hiện nay, một số nghiên cứu về loài hoa này đã tìm ra một số thành phần hóa học có liênquan đến việc sản xuất ra các loại dầu thơm, nước hoa quý… được chiết xuất từ các bộphận như hoa, sáp hoa… trong đó loại tinh dầu tuyệt đối thu được khi chiết xuất từ hoanhư alcol benzil chiếm 0,7%, benzoat metal (4,5%), antranilat metal (8,0%),metilisoeugenol (10%), benzoate benzil (24%) Ngoài ra, n-NAA + 4mg/l BAalkan chiếm tỷ lệ không nhỏtới 42% trong sáp hoa cũng là một thành phần hóa học quan trọng trong việc chế xuất cácloại nước hoa, dầu thơm

Bên cạnh đó, cây hoa Huệ Hương còn có công dụng trong y học, bộ phận được sửdụng là củ Trong tinh dầu củ huệ có chứa thành phần sapogenin, sapogenin bao gồmhecogenin, tigogenin là loại hợp chất được chiết xuất để bào chế ra một số loại thuốc quý

Từ lâu trong nhân gian người dân đã biết sử dụng cây hoa Huệ Hương để làm thuốc chữa

một số bệnh đơn giản Ở Ấn Độ người ta đã dùng củ phơi khô, tán thành bột để làm thuốctrị liệu, hoặc ở Vũng Tàu người dân nơi đây đã dùng củ để chữa bệnh sốt rét.

Ở một số nơi, dân gian còn dùng củ để chữa bệnh hóc xương bằng cách đem giãnát củ, vắt lấy nước rồi nhỏ vào họng của người bị hóc xương sau 1 -NAA + 4mg/l BA 2 phút sẽ khỏi

1.9 Tình hình sản xuất hoa huệ trong nước

Du nhập vào nước ta từ rất lâu và được trồng rộng rãi trong cả nước, nhưng câyhoa Huệ Hương được trồng phổ biến hơn cả ở miền Nam và Nam Trung Bộ Trongnhững năm gần đây, diện tích canh tác cây hoa Huệ Hương ngày càng được mở rộng vàđem lại thu nhập cao cho người trồng

Theo thống kê hiện nay, trên địa bàn các tỉnh Đồng bằng song Cửu Long có diệntích trồng huệ lớn hơn cả Trung bình các tỉnh có khoảng 500 -NAA + 4mg/l BA 1000 ha canh tác cây hoaHuệ Hương, khi thu hoạch có thể thu nhập từ 150 -NAA + 4mg/l BA 200 triệu/ha

Do cây này dễ trồng, chi phí đầu tư thấp, ít bị ảnh hưởng bởi các yếu tố thời tiết vàđặc biệt hơn là hoa huệ cho thu hoạch tới 14 tháng/vụ nên trong điều kiện thuận lợithường cho thu nhập cao

Trong những năm gần đây, trên địa bàn các tỉnh vùng Nam Trung Bộ bắt đầu đẩymạnh canh tác cây hoa Huệ Hương, đặc biệt là ở Bình Định và Khánh Hòa Ở Bình Định,cây hoa Huệ Hương dần trở thành cây trồng chính Theo đánh giá của người dân nơi đây,trong điều kiện thuận lợi mỗi ha bình quân cho thu nhập trên 80 -NAA + 4mg/l BA 120 triệu đồng

Mặc dù vậy, hiện nay việc canh tác cây huệ đang gặp nhiều khó khăn, do bị sâubệnh hại phá hoại nhiều, trong đó có một bệnh rất khó trị là bệnh chai bông Hiện naybệnh phá hoại rất mạnh, có thể làm giảm đến 60% năng suất cây trồng Chính vì vậy,năng suất hoa Huệ Hương trên nhiều vùng có xu hướng không ổn định và chất lượng hoathì giảm đáng kể

Hiện nay, bệnh chai bông đang là nguyên nhân chính làm cho giảm năng suất vàphẩm chất hoa trên các vùng chuyên canh, đặc biệt ở Nam Trung Bộ và Nam Bộ Triệuchứng bệnh thể hiện:

-NAA + 4mg/l BA Trên lá: trước khi ra hoa, trên lá của cây con bị nhiễm bệnh thường xuất hiện các đườnggân sọc màu nâu đỏ kéo dài từ bẹ lá đến chóp lá, lá có thể bị xoắn

-NAA + 4mg/l BA Trên bông: nếu bị nhiễm nặng, bông sẽ bị cai không trỗ được hoặc bông bị đen thui vàkhô, bẹ lá hầu như bị thâm màu nâu đỏ

-NAA + 4mg/l BA Trên thân: khi bị nhiễm bệnh, thân bị lùn, vỏ thân có những chai sần dày đặc.

Theo phương pháp nhân giống truyền thống, đối với hoa Huệ Hương, nguồn vậtliệu ban đầu để sản xuất hoa thương phẩm là củ giống, chất lượng củ giống đóng vai tròquan trọng, nó ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển và chất lượng của hoa sau này

Củ tái sinh theo phương pháp thông thường dựa trên nguyên lý chung là ở phíatrong các nách lá có một chồi ngủ (chồi nách), các chồi này khi gặp điều kiện thuận lợi sẽphát triển thành chồi bên

Nhìn chung, phương pháp này đơn giản, dễ làm và chi phí đầu tư không caonhưng có rất nhiều nhược điểm: hệ số nhân thấp, thường làm thoái hóa giống, gâu bệnhhàng loạt ảnh hưởng lớn đến năng suất và chất lượng hoa

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Địa điểm thực hiện đề tài

-NAA + 4mg/l BA Phòng Công nghệ Sinh học thuộc Trung tâm nghiên cứu ứng dụng tiến bộ khoa họcCông nghệ -NAA + 4mg/l BA Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Bình Định

2.2 Đối tượng nghiên cứu

-NAA + 4mg/l BA Phần đỉnh của các mắt ngủ tách từ củ hoa Huệ Hương

Hình 2.1 Hoa Huệ Hương

Hình 2.2 Củ hoa Huệ Hương

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp khử trùng mẫu cấy

Mẫu cấy được chọn là phần đỉnh của các mắt ngủ được lấy từ củ Huệ Hương Các

củ Huệ Hương có chứa mắt ngủ được thu hoạch, sau đó được làm sạch bề mặt mẫu vậtbằng vòi nước chảy mạnh trong 15 phút để loại bỏ những nơi có bám đất cát Củ HuệHương được ngâm trong bột giặt 30 phút rồi rửa lại dưới vòi nước chảy trong 5 phút Sau

đó tiến hành cắt củ thành lát mỏng có chứa các mắt ngủ Sau đó rửa lại bằng nước cất vàđem vào buồng cấy để khử trùng