Luận văn công nghệ sinh học ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên quá trình phát sinh hình thái cây hoa huệ hương (Polianthes Tuberosel) in vitro

Xác định được ảnh hưởng của các chất đều hòa sinh trưởng thực vật lên quá trình phát sinh hình thái trong quy trình nhân giống cây hoa Huệ Hương bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào, làm cơ sở cho việc hình thành quy trình nhân giống in vitro cây hoa Huệ Hương, góp phần giải quyết những khó khăn của thực tiễn sản xuất hoa.

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v

1.1 Nhân giống cây bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào 3

1.2 Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật 3

1.3 Cơ sở lý luận của nuôi cấy mô tế bào thực vật 5

1.4 Ưu, nhược điểm của phương pháp nhân giống in vitro 6

1.5 Kỹ thuật nuôi cấy in vitro 8

1.6 Các hướng nhân giống vô tính in vitro 11

1.7 Quy trình nhân giống in vitro 12

1.7.1 Lấy mẫu và xử lý mẫu 12

1.7.2 Tái sinh mẫu nuôi cấy 12

1.7.3 Nhân nhanh chồi 12

1.7.4 Tái sinh rễ 13

1.7.5 Đưa cây in vitro ra vườn ươm 13

1.8 Sơ lược về đối tượng nghiên cứu 13 1.8.1 Nguồn gốc 13

1.8.2 Phân loại 13

1.8.3 Đặc điểm thực vật học 14

1.8.4 Yêu cầu ngoại cảnh của cây hoa Huệ Hương 14

1.8.5 Kỹ thuật trồng và chăm sóc 16

1.8.6 Vấn đề sâu bệnh trên cây hoa Huệ Hương 18

1.8.7 Giá trị kinh tế 19

1.9 Tình hình sản xuất hoa huệ trong nước 20

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 22

2.1 Địa điểm thực hiện đề tài 22

2.2 Đối tượng nghiên cứu 22

2.3 Phương pháp nghiên cứu 23

2.3.1 Phương pháp khử trùng mẫu cấy 23

2.3.2 Phương pháp nuôi cấy khởi động 23

2.3.3 Phương pháp nhân nhanh 23

2.3.4 Phương pháp tạo cây hoàn chỉnh 23

2.3.5 Phương pháp ươm cây 24

2.4 Bố trí thí nghiệm 24

2.5 Các chỉ tiêu theo dõi 27

2.6 Thu thập và xử lý số liệu 27

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

Thí nghiệm 1 Xác định phương pháp khử trùng đối với mẫu nuôi cấy

là phần đỉnh của các mắt ngủ tách từ củ hoa Huệ Hương 28

Thí nghiệm 2 Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên tới quá trình phát sinh hình thái của mẫu cấy 31

4.1 Kết luận 40

4.2 Đề nghị 41

PHỤ LỤC 46

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Khảo sát ảnh hưởng của HgCl2 0,1% ở các mức thời gian khác

nhau đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy 28Bảng 2.2 Khảo sát ảnh hưởng của việc kết hợp HgCl2 0,1% và Ca(OCl)2

15% đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy 29Bảng 2.3 Khảo sát ảnh hưởng của kinetin lên khả năng phát sinh hình

thái của mẫu cấy 29Bảng 2.4 Khảo sát ảnh hưởng của BA đến khả năng phát sinh hình thái

của mẫu nuôi cấy 29Bảng 2.5 Khảo sát ảnh hưởng kết hợp của BA và các auxin khác nhau

lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy 30Bảng 3.1 Ảnh hưởng HgCl2 0,1% ở các mức thời gian khác nhau đến

hiệu quả khử trùng mẫu cấy sau 4 tuần nuôi cấy 32 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của việc kết hợp HgCl2 0,1% trong 15 phút và

Ca(OCl)2 15% đến hiệu quả khử trùng mẫu sau 4 tuần nuôi

cấy 33Bảng 3.3 Ảnh hưởng của kinetin lên khả năng phát sinh hình thái của

mẫu cấy sau 8 tuần nuôi cấy 35 Bảng 3.4 Ảnh hưởng ảnh hưởng của BA đến khả năng phát sinh hình

thái của mẫu nuôi cấy sau 8 tuần nuôi cấy 37Bảng 3.5 Ảnh hưởng kết hợp của BA và các auxin khác nhau lên khả

năng phát sinh hình thái của mẫu cấy sau 8 tuần nuôi cấy 40

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Polianthes tuberose L 13

Hình 2.1 Hoa Huệ Hương 26Hình 2.2 Củ hoa Huệ Hương 26Hình 3.1 Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza

+ 9 g/l agar + 2mg/l Kinetin 36Hình 3.2 Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza

+ 9 g/l agar + 4mg/l BA 39Hình 3.3 Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza

+ 9 g/l agar + 0,25mg/l IBA + 4mg/l BA 41Hình 3.4 Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza

+ 9 g/l agar + 0,25mg/l 2,4D + 4mg/l BA 41 Hình 3.5 Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza

+ 9 g/l agar + 0,25mg/l α-NAA + 4mg/l BANAA + 4mg/l BA 42 Hình 3.6 Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza

+ 9 g/l agar + 0,25mg/l IAA + 4mg/l BA 42

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

α-NAA + 4mg/l BANAA: α-NAA + 4mg/l BAnaphtyl acetic acid

2,4-NAA + 4mg/l BAD: 2,4 diclorophenoxy acetic acid

LỜI MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Cây hoa Huệ Hương (Polianthes tuberose L.) là cây hoa cắt cành thuộc

nhóm thân thảo, thích cường độ ánh sáng cao và cho hoa quanh năm Hoa HuệHương được nhập vào nước ta từ rất lâu Cây hoa Huệ Hương được trồng phổ biếntại vùng Nam Trung Bộ đem lại thu nhập khá cao cho người trồng và chính là câyxóa đói giảm nghèo cho vùng chuyên canh loài cây này

Hiện nay, việc canh tác cây hoa Huệ thường chủ yếu được nhân giống bằng

kỹ thuật nhân giống truyền thống, chủ yếu là lấy củ trồng Với phương pháp nhângiống này dễ lây lan các mầm bệnh có sẵn trong củ, đặc biệt là bệnh virus làm giảmnăng suất và phẩm chất hoa, khiến cho giống hoa này ngày càng thoái hóa

Trong những năm gần đây, bệnh hại trên cây hoa Huệ Hương xuất hiệnnhiều, đặc biệt trong đó có một bệnh rất khó trị là bệnh chai bông Tác nhân gâybệnh hiện vẫn chưa xác định được Bệnh xuất hiện trên diện rộng làm ảnh hưởngđến năng suất và phẩm chất hoa Bệnh không làm cho cây chết ngay nhưng làm chochồi, củ, hoa kém phát triển, làm thất thu nguồn thu nhập của nông dân Các triệuchứng bệnh do virus được mô tả bởi Horner và Person (1988), Chen và Chang(1998) gần giống các biểu hiện ở cây hoa Huệ Hương ở Nam Trung Bộ Vấn đề đặt

ra là làm thế nào để tạo nguồn giống sạch bệnh cung cấp cho nhân dân?

Phương pháp nhân giống in vitro với rất nhiều ưu điểm, tạo được cây con trẻ

hóa và sạch bệnh nên tiềm năng sinh trưởng, phát triển và năng suất cao, khắc phụcđược nhược điểm của phương pháp nhân giống truyền thống, khôi phục lại phẩmchất vốn có của giống Đồng thời hệ số nhân của phương pháp nhân giống này caođáp ứng được nhu cầu về số lượng giống có chất lượng cao, ổn định đáp ứng đượcnhu cầu sản xuất trên quy mô rộng Cho đến nay kĩ thuật nuôi cấy mô đã đượcnghiên cứu ứng dụng rất có hiệu quả trong việc nhân giống hàng loạt các loại cây

trồng tạo ngân hàng cây giống sạch bệnh, khỏe mạnh cho năng suất cao, phẩm chấttốt cung cấp cho sản xuất.

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Cây hoa Huệ Hương là đối tượng mới của sản xuất cây giống bằng phươngpháp nuôi cấy mô ở nước ta Xuất phát từ yêu cầu khó khăn của thực tiễn, nhằmkhắc phục hiện tượng chai bông trên cây hoa Huệ Hương, một giống hoa Huệ quýmang lại hiệu quả cao cho nông dân Trên cơ sở đó, việc nghiên cứu xây dựng quy

trình nhân giống in vitro cây hoa Huệ đã được tiến hành thử nghiệm.

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Đề tài đã đưa ra được các minh chứng về tác động của phương pháp khửtrùng đến tỷ lệ sống của mẫu cây, tác động của chất điều tiết sinh trưởng đến khảnăng phát sinh hình thái

Kết quả nghiên cứu đề tài có thể sử dụng nghiên cứu trong nuôi cấy mô tếbào cây hoa Góp phần sản xuất cây giống có hiệu quả cao, chất lượng tốt, ứng dụngvào sản xuất sẽ góp phần nâng cao hiệu quả kinh tế của ngành sản xuất cây hoaHuệ

5 Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến quátrình phát sinh hình thái của mầm ngủ trên củ hoa Huệ Hương Sử dụng các chấtđiều hòa sinh trưởng thực vật như: kinetin, BA, IBA, α-NAA + 4mg/l BANAA, 2,4-NAA + 4mg/l BAD, IAA

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Nhân giống cây bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào

Là phương pháp nuôi cấy mô tế bào trong môi trường dinh dưỡng nhân tạotrong điều kiện vô trùng và tái sinh chúng thành cây con

Nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào là phương pháp mới bổ sungcho các kỹ thuật nhân giống truyền thống nhiều kỹ thuật tiến bộ, có thể khắc phụcđược những hạn chế của các phương pháp nhân giống truyền thống

1.2 Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật

Năm 1838, trên cơ sở những nghiên cứu độc lập, hai nhà bác học người Đức

là Schleiden và Schwamn cùng khởi xướng học thuyết tế bào Học thuyết này chorằng tế bào là đơn vị cấu trúc và chức năng của sinh vật, vì vậy có khả năng tồn tạiđộc lập

Gottlibe Haberlandt là người đầu tiên đề xuất phương pháp nuôi cấy mô tếbào thực vật vào năm 1902 để chứng minh học thuyết về tính toàn năng của tế bào.Theo ông mỗi tế bào của bất kỳ cơ thể nào đều mang toàn bộ hệ thống di truyền cầnthiết và đầy đủ thông tin của sinh vật đó, khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bàođều có thể phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh Ông tiến hành thí nghiệm với tế bàokhí khổng và các tế bào đã được biệt hóa về chức năng khác nhưng không thànhcông Điều đó đã giảm sự tin tưởng của các nhà khoa học đối với phương pháp nuôicấy mô tế bào trong thời gian dài

Đến năm 1922 học trò của Gottlibe Haberlandt là Kotte và Robbinss đã làmlại thí nghiệm của ông Họ đã lấy đỉnh sinh trưởng của rễ cây hòa thảo nuôi cấytrong môi trường có khoáng, đường, đầu rễ đã sinh trưởng mạnh và tạo ra hệ rễ nhỏ

và cả rễ phụ Tuy nhiên sự sinh trưởng chỉ tồn tại trong một thời gian mặc dùchuyển sang môi trường mới

Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ 2 trong lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vậtkhi White đã nuôi cấy thành công đầu tiên rễ cà chua trên môi trường lỏng có chứađường, muối khoáng, dịch chiết nấm men Các thí nghiệm tiếp theo ông thay thế

dịch chiết nấm men bằng hỗn hợp 3 vitamin nhóm B : thiamin (B1), nicotinic acid(B3), pyridioxin (B6) Sau đó ít lâu Went và Thimann tìm ra chất kích thích sinhtrưởng đầu tiên là IAA.

Năm năm sau Gautheret đã thông báo về sự tái sinh của cây cà rốt, đây cũng

là lần đầu tiên sự phát triển của mô sẹo không bị giới hạn Bằng cách thêm IAA vàomôi trường nuôi cấy, ông có thể kích thích sự phát triển của mô đã biệt hóa trên vếtcắt của bề mặt mẫu cấy vô trùng Sau này người ta mới thấy rằng callus có thể trựctiếp nuôi cấy vô thời hạn Đến năm 1948, Steward xác nhận tác dụng của nước dừatrên mô sẹo cà rốt Trong thời gian này nhiều chất sinh trưởng thuộc nhóm auxinđược tổng hợp như naphthylacetiic acid (NAA), 2,4-NAA + 4mg/l BADiclophenoxyacetic acid(2,4D) Nhiều tác giả nhận thấy cùng với nước dừa, NAA và 2,4 D đã giúp tạo môsẹo gây phân chia tế bào thành công ở nhiều đối tượng thực vật trước đó khó nuôicấy

Năm 1955, Miller và Skoog đã xác định vai trò của chất kích thích sinhtrưởng là 6-NAA + 4mg/l BAFurfuryl aminopurin (kinetin) Việc phát hiện ra chất kích thích sinhtrưởng, vitamin và nước dừa là những bước tiến quan trọng trong giai đoạn thứ 2

Năm 1957, Miller và Skoog đã công bố các kết quả nghiên cứu về ảnh hưởngcủa tỷ lệ auxin/kinetin trong môi trường nuôi cấy đối với sự hình thành cơ quan, tỷ

lệ auxin/kinetin thấp, mô sẹo có khuynh hướng tạo chồi, ngược lại tỷ lệauxin/kinetin tăng, mô sẹo có khuynh hướng tạo rễ Hiện nay, những kết quả nàycũng được quan sát thấy trên nhiều loại cây khác nhau và đóng góp nhiều vào việcđiều khiển quá trình sinh trưởng, phát triển và phát sinh cơ quan của mô tế bàotrong nuôi cấy Thành công của Miller và Skoog đã mở đầu cho giai đoạn thứ bacủa lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật

Những thành công trên là cơ sở bùng nổ ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tếbáo thực vật trong sản xuất Morel và Martin đã phát triển kỹ thuật nuôi cấy đỉnhsinh trưởng để tạo giống sạch bệnh ở khoai lang và hoa lan Chính hai nhà khoa họcnày đã mở đầu cho một hướng mới của nuôi cấy mô tế bào thực vật, đó là vi nhângiống

Từ những năm 1960, ngoài các hướng trên, nuôi cấy bao phấn và hạt phấn,nuôi cấy tế bào đơn và tế bào trần được phát triển mạnh Các kỷ thuật lai soma bằngdung hợp tế bào trần và kỷ thuật chuyển gen được phát triển và thu được nhữngthành tựu đáng kể.

Chúng ta đang bước vào giai đoạn thứ 4 của nuôi cấy mô tế bào thực vật Đó

là giai đoạn nuôi cấy mô tế bào được ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống,sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học và vao nghiên cứu lý luận di truyềnthực vật bậc cao

1.3 Cơ sở lý luận của nuôi cấy mô tế bào thực vật

Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào in vitro là học thuyết về

tính toàn năng (totipotence) của tế bào Theo Haberlandt G (1902), nhà thực vậtngười Đức, tất cả các tế bào của cây đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của

cơ thể, khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có khả năng tái sinh và phát triểnthành cá thể hoàn chỉnh Thực tế đã chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thểthực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ Hàng trăm loài cây trồng đã được nhângiống trên qui mô thương mại bằng cách nuôi cấy trong môi trường nhân tạo vôtrùng và tái sinh chúng thành cây với hệ số nhân giống vô cùng lớn (Murashige,1980)

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy in vitro thực vật thực chất là kết

quả của các quá trình phân hóa và phản phân hóa Tất cả các tế bào trong các cơquan khác nhau của cơ thể thực vật đều bắt nguồn từ tế bào phôi sinh Sự chuyển tếbào phôi sinh thành các tế bào chuyên hóa để đảm nhiệm các chức năng khác nhauđược gọi là sự phân hóa tế bào Còn quá trình phản phân hóa thì ngược lại với quátrình phân hóa, có nghĩa là tế bào đã phân hóa thành mô chức năng không hoàn toànmất đi khả năng phân chia mà ở điều kiện thích hợp chúng có thể trở về dạng phôisinh và tái phân chia

Bản chất của quá trình này là một quá trình hoạt hóa, ức chế các gen Trongquá trình phát triển cá thể, ở từng thời điểm nhất định đều có một số gen nhất địnhđược hoạt hóa cho ta tính trạng mới, một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động Điều

này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc phân tử DNA củamỗi tế bào khiến quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được hàihòa Mặt khác, khi nằm trong khối mô bình thường, tế bào luôn bị chi phối bởi các

tế bào xung quanh Khi tế bào được tách riêng rẽ, tác dụng ức chế của các tế bàoxung quanh không còn nữa thì các gen được hoạt hóa và quá trình phân hóa sẽ xảy

ra theo một quá trình định sẵn

1.4 Ưu, nhược điểm của phương pháp nhân giống in vitro

Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng khắc phục được nhiều trở ngại

mà những phương pháp nhân giống khác thường gặp Sau đây là những ưu điểmchính :

-NAA + 4mg/l BA Cây con được trẻ hóa và sạch bệnh, vì vậy có tiềm năng sinh trưởng, phát triển vànăng suất cao

-NAA + 4mg/l BA Tạo cây con đồng nhất về mặt di truyền, bảo tồn được các tính trạng đã chọn lọc.-NAA + 4mg/l BA Tạo được dòng thuần của các cây tạp giao

-NAA + 4mg/l BA Tạo được cây có genotip mới (đa bội, đơn bội)

-NAA + 4mg/l BA Bảo quản và lưu giữ tập đoàn gen

-NAA + 4mg/l BA Có khả năng sản xuất quanh năm

-NAA + 4mg/l BA Có thể nhân nhanh nhiều cây không kết hạt trong những điều kiện sinh thái nhấtđịnh hoặc hạt nảy mầm kém

-NAA + 4mg/l BA Hệ số nhân giống cực kì cao (thường đạt được ở các loài cây khác nhau trongphạm vi từ 36 -NAA + 4mg/l BA 1012/năm), rút ngắn thời gian đưa một giống mới vào sản xuất đại trà

Trong công tác giống cây trồng, vấn đề được quan tâm hàng đầu là chấtlượng và số lượng giống Bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, người ta đãtạo ra được những giống cây hoàn toàn sạch virus Limasset và Cornel (1945) đãchứng minh được rằng, nồng độ virus trong thực vật giảm dần ở bộ phận gần đỉnhsinh trưởng, riêng đỉnh sinh trưởng thì hoàn toàn sạch virus (Morel và Martin,1952) Nguyên nhân của hiện tượng này là:

-NAA + 4mg/l BA Đỉnh sinh trưởng không có hệ mô dẫn, làm cho virus và vi sinh vật không có khảnăng thâm nhập

-NAA + 4mg/l BA Đỉnh sinh trưởng là nơi sinh tổng hợp của auxin nên hàm lượng auxin khá cao,auxin có tác dụng ức chế sinh sản của virus.

-NAA + 4mg/l BA Quá trình phân chia của tế bào phôi sinh (ở đỉnh sinh trưởng) không kéo theo sựphân chia của virus

Về phương diện hệ số nhân, nhân giống in vitro là phương pháp không gì có thể so sánh kịp, kể cả phương pháp nhân giống bằng hạt Nuôi cấy in vitro có thể

coi là một cuộc cách mạng về hệ số nhân

Nhược điểm chính của phương pháp nuôi cấy in vitro là đòi hỏi trang thiết bị đắt

tiền và kỹ thuật cao nên chỉ có hiệu quả đối với những cây có giá trị cao hoặc khónhân giống bằng phương pháp khác (Nickell, 1973) Ngoài ra, phương pháp này còn

có những bất lợi sau:

-NAA + 4mg/l BA Mặc dù số lượng cây giống thu được có thể rất cao nhưng cây con có kích thướcnhỏ, đòi hỏi phải có chế độ chăm sóc đặc biệt ở giai đoạn sau ống nghiệm

-NAA + 4mg/l BA Cây có thể có những đặc tính không mong muốn

-NAA + 4mg/l BA Khả năng tạo đột biến tăng

-NAA + 4mg/l BA Khả năng tái sinh có thể bị mất đi do cấy truyền callus hay huyền phù tế bào nhiềulần

-NAA + 4mg/l BA Cây giống có thể bị nhiễm bệnh đồng loạt

Tuy vậy phương pháp nhân giống in vitro ngày càng được sử dụng rộng rãi

để phục vụ cho những mục đích sau:

-NAA + 4mg/l BA Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các loại câytrồng khác nhau như cây lương thực có củ, cây rau, cây hoa, cây cảnh và cây dượcliệu thuộc nhóm cây than thảo

-NAA + 4mg/l BA Nhân nhanh và kinh tế các kiểu gen quí hiếm của giống cây lâm nghiệp và gốcghép trong nghề trồng cây ăn quả, cây cảnh thuộc nhóm than gỗ

-NAA + 4mg/l BA Nhân nhanh ở điều kiện vô trùng và cách ly tái nhiễm kết hợp với làm sạch virus.-NAA + 4mg/l BA Bảo quản và lưu giữ các tập đoàn giống nhân giống vô tính và các loài giao phấntrong ngân hàng gen

1.5 Kỹ thuật nuôi cấy in vitro

Kỹ thuật nuôi cấy in vitro có thể chia thành các bước sau:

-NAA + 4mg/l BA Lựa chọn đối tượng (cây trồng, giống, bộ phận cây) thích hợp

Nguyên liệu sử dụng cho nuôi cấy mô tế bào thực vật có thể là bất cứ bộphận nào của cây: các đoạn của rễ, thân, các phần của lá (cuống lá, phiến lá…), cáccấu trúc của phôi như lá mầm, trụ trên, trụ dưới lá mầm, hạt phấn, noãn… thậm chí

cả mẫu thân ngầm hay cơ quan dự trữ dưới mặt đất (củ, căn hành…) cũng đượcdùng cho nuôi cấy

-NAA + 4mg/l BA Khử trùng mẫu và tiến hành nuôi cấy

Nguyên liệu để nuôi cấy in vitro được chọn từ những cá thể ưu tú của loài,

khỏe và sạch bệnh, nhưng ít nhiều đều có nhiễm vi sinh vật và nấm tùy thuộc vào sựtiếp xúc của chúng với môi trường xung quanh Có một số bộ phận như phôi tronghạt, mô trong quả, dòng lúa non… ít bị nhiễm vi sinh vật hơn các bộ phận khác,ngược lại các bộ phận nằm dưới mặt đất như rễ, củ, thân ngầm, có lượng vi khuẩn

và nấm rất cao Phương pháp thông dụng nhất hiện nay để loại bỏ hệ vi sinh vậtkhỏi vật liệu nuôi cấy là sử dụng các hóa chất có hoạt tính diệt khuẩn và nấm

Khả năng tiêu diệt nấm và vi sinh vật của hóa chất khử trùng phụ thuộc vàonồng độ, thời gian xử lý và mức độ xâm nhập của chúng vào các ngõ ngách trên bềmặt của mô cấy Để làm tăng hiệu quả, người ta thường nhúng mẫu vào ethanol 70 -NAA + 4mg/l BA80% trong 30 giây, sau đó mới xử lý bằng dung dịch diệt khuẩn Đối với nhữngmẫu có bề mặt được bao phủ lớp sáp, muốn đạt được kết quả tốt nhất cần cho themvào dung dịch khử trùng vài giọt Tween 20, Tween 80 hay teapol…vì các chất nàylàm tăng tính bám dính của hóa chất khử trùng Với các mẫu quá bẩn phải rửa kỹbằng nước xà phòng và để dưới vòi nước chảy từ 20 đến 30 phút sẽ có tác dụng làmgiảm đáng kể hệ vi khuẩn khỏi mẫu cấy

Tác nhân khử trùng, ngoài tác dụng diệt vi sinh vật còn ảnh hưởng đến môcấy vì vậy việc lực chọn loại hóa chất phải căn cứ vào mức độ nhiễm khuẩn và độmẫn cảm của từng mẫu Trong số các hóa chất hay được sử dụng để khử trùng thìCalcium hypoclorite và natri hypoclorite là hay được sử dụng hơn cả vì có tính độcthấp đối với mô được xử lý, không gây ức chế sinh trưởng và hiệu quả diệt khuẩn

tốt Nồng độ của Calcium hypoclorit và natri hypoclorit tương ứng thường là 5 -NAA + 4mg/l BA15% và 0,5 -NAA + 4mg/l BA 2% trong thời gian 15 -NAA + 4mg/l BA 30 phút Tuy nhiên, những chất này không bềnnên trong thực tế HgCl2 cũng hay được dùng để thay thế.

-NAA + 4mg/l BA Xác định điều kiện nuôi cấy (môi trường dinh dưỡng, nhiệt độ, ánh sáng) để điềukhiển quá trình phát triển nuôi cấy theo định hướng

Thành công của phương pháp nuôi cấy in vitro phụ thuộc rất nhiều vào điều

kiện nuôi cấy Nhu cầu dinh dưỡng cho sự sinh trưởng và phát triển tối ưu của cácloài là không giống nhau, ngay cả giữa các bộ phận trong cùng một cơ thể cũng ítnhiều khác nhau Sự lựa chọn môi trường nuôi cấy bao gồm cả chất lượng và sốlượng hóa chất sử dụng đóng vai trò quyết định đối với bản thân sự phân hóa vàchiều hướng phân hóa của tế bào

Cho đến nay, đã có nhiều loại môi trường dinh dưỡng được tìm ra : môitrường Murashige và Skoog (1962), môi trường Linsmaer và Skoog (1963), môitrường Gamborg (1968), môi trường Knop (1974)… Đây là những môi trường cơbản và sẽ được cải tiến thành nhiều loại môi trường khác nhau phù hợp với mỗi đốitượng nghiên cứu và mục đích thí nghiệm Trong số đó, môi trường MS (Murashige

và Skoog, 1962) được đánh giá là phù hợp nhất cho đa số các loài thực vật và chínhMurashige (1974) đã dung môi trường này để nuôi cấy nhiều loài cây trồng

Thành phần chủ yếu của tất cả các loại môi trường gồm những nhóm chấtsau : muối khoáng đa lượng và vi lượng (muối chloride, nitrate, sulphate, chất thamgia điều chỉnh sự phân hóa của rễ, chồi…

Các auxin đều có hiệu quả sinh lý ở nồng độ thấp, thường được sử dụng vớinồng độ từ 10-NAA + 4mg/l BA1 M đến 10-NAA + 4mg/l BA6 M tùy theo từng chất, mục đích và đối tượng nghiên cứu.Auxin được thêm vào môi trường nuôi cấy sẽ kết hợp với auxin nội sinh để điềukhiển chiều hướng và cường độ các quá trình sinh trưởng Hàm lượng auxin thấp sẽkích thích sự phân hóa rễ, ngược lại ở hàm lượng cao sẽ phát động sự tạo mô sẹo

Các auxin thường được sử dụng trong nuôi cấy mô là IBA (indol butyricacid), α-NAA + 4mg/l BANAA (a-NAA + 4mg/l BAnaphtylacetic acid), 2,4-NAA + 4mg/l BAD (2,4 diclorophenoxy acetic acid), IAA(indool acetic acid)

Cytokinin là nhóm phytohormone dẫn xuất của adenine, có vai trò sinh lýtương tự nhau Cytokinin liên quan chặt chẽ với phân bào, duy trì sự trẻ hóa các cơquan, làm giảm ưu thế ngọn, kích thích sự phân hóa chồi từ mô sẹo nuôi cấy…Nồng độ cytokinin cao kìm hãm sự hình thành và phát triển của rễ.

Các cytokinin thường được sử dụng trong nuôi cấy là kinetin, BAP(benzylaminopurin) với nồng độ 10-NAA + 4mg/l BA4 -NAA + 4mg/l BA 10-NAA + 4mg/l BA7 M

Nhiều tác giả đã tổng kết rằng sự biệt hóa cơ quan thực vật in vitro là kết quả

tác động qua lại giữa hai nhóm auxin và cytokinin Cân bằng tỷ lệ auxin/cytokininnếu nghiêng về phía auxin sẽ kích thích sự hình thành rễ, ngược lại nếu cân bằngnày nghiêng về phía cytokinin sẽ thúc đẩy sự tạo chồi Ở tỷ lệ trung gian, mô sẹođược hình thành Đây là nguyên tắc chung để điều khiển quá trình phát sinh hìnhthái của mô nuôi cấy Các mô khác nhau có phản ứng không giống nhau Vì vậy,với từng loại mô và từng giai đoạn sinh trưởng khác nhau, việc tìm được tổ hợpnồng độ auxin/cytokinin thích hợp có ý nghĩa quan trọng

-NAA + 4mg/l BA Đưa những cây tái sinh được trở lại điều kiện tự nhiên

Đây là giai đoạn quan trọng bao gồm việc huấn luyện cây in vitro thích nghi

với điều kiện thay đổi nhiệt độ, độ ẩm, sự mất nước, sâu bệnh và chuyển từ trạngthái di dưỡng sang tự dưỡng hoàn toàn Quá trình thích nghi ở đây được hiểu là quá

trình thay đổi đặc điểm sinh lý và giải phẫu của cây in vitro Thời gian tối thiểu cho

sự thích nghi là 2 -NAA + 4mg/l BA 3 tuần

1.6 Các hướng nhân giống vô tính in vitro

Khả năng thành công của nuôi cấy mô tế bào phụ thuộc chủ yếu vào trạngthái tuổi của tế bào Tế bào càng gần trạng thái phôi sinh bao nhiêu, khả năng nuôicấy thành công càng cao Như vậy tế bào phôi thường cò triển vọng nhất rồi đến tế

bào các đỉnh sinh trưởng đang ở trạng thái hoạt động (đỉnh ngọn, chóp rễ) và sau đó

là tế bào ở trạng thái ngủ nghỉ (chồi nách)

Trong nhân giống in vitro, cây non có thể được tái sinh từ các điểm sinh

trưởng có sẵn trong các bộ phận (phôi, đỉnh chồi, chồi nách) hoặc từ những mô cókhả năng hình thành điểm sinh trưởng phụ Có hai phương pháp tái sinh cây con:+ Tái sinh trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng, phôi, ngọn, chồi hay chồi nách

+ Tái sinh cây gián tiếp thông qua giai đoạn hình thành mô sẹo

Tái sinh trực tiếp từ mẫu nuôi cấy là quá trình phát động những điểm sinhtrưởng đã tồn tại sẵn trong mô nuôi cấy phân chia và tái sinh thành cây Các điểmsinh trưởng này bao gồm các tế bào phôi sinh chứa 2n nhiễm sắc thể đặc trưng choloài Cây con tạo ra theo con đường này hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền vàduy trì được những tính trạng của cây mẹ

Trong hướng tái sinh gián tiếp, mẫu nuôi cấy không tái sinh thành cây ngay

mà phát triển thành khối mô sẹo (callus) Có thể thấy ngay là hệ số nhân của hướngnày vô cùng lớn Từ một khối mô sẹo có thể tạo ra khối lượng lớn cây giống trongmột thời gian ngắn thong qua kỹ thuật tạo phôi soma hoặc chế ra hạt giống nhântạo Nhiều cây tái sinh từ mô sẹo có thể rất khác với cây mẹ về mặt di truyền.Nguyên nhân của hiện tượng này là do trong quá trình phát sinh và phát triển của

mô sẹo, thường xuất hiện những tế bào đột biến mang số nhiễm sắc thể không giốngvới tế bào ban đầu hoặc chứa những đột biến gen do hiện tượng nội nguyên phân.Nội nguyên phân là hiện tượng nhân đôi nhiễm sắc thể không kèm theo sự phân bàotrong thực tế và là hiện tượng tự nhiên trong cơ thể thực vật, nhưng tăng lên dướiảnh hưởng của các thành phần của môi trường dinh dưỡng và điều kiện cũng nhưphướng pháp nuôi cấy, nhất là khi cấy chuyển nhiều lần Đột biến tuy không có lợicho việc duy trì nguyên trạng những đặc tính di truyền trong quá trình tạo giốngnhưng lại chính là đối tượng tìm kiếm trong quá trình cải tạo giống Ngoài việccung cấp những đột biến tự nhiên, mô sẹo còn là đối tượng lý tưởng để tạo ra nhữngđột biến nhân tạo bằng các tác nhân gây đột biến hoặc công nghệ gen

Vì vậy, trong nhân giống in vitro, để nhân nhanh những cá thể đã chọn lọc

người ta thường tái sinh cây theo hướng trực tiếp, còn mục tiêu của tái sinh gián tiếp

là tạo ra nhiều biến dị để phục vụ cho việc chọn lọc và cải tạo giống cây trồng

1.7 Quy trình nhân giống in vitro

Quy trình nhân giống được chia làm 5 giai đoạn:

1.7.1 Lấy mẫu và xử lý mẫu

Đây là giai đoạn quan trọng quyết định vi nhân giống Khả năng nhiễm bệnhcủa mẫu phụ thuộc vào cách lấy mẫu, xử lý mẫu trong điều kiện khử trùng Mỗi câyđều có ngưỡng nhiệt độ và độ ẩm phù hợp khi bảo quản và xử lý mẫu Với cây nhiệtđới và á nhiệt đới thì nhiệt độ 25oC, độ ẩm 75% là điều kiện giữ mẫu thích hợp, tỷ lệnhiễm bệnh thấp

1.7.2 Tái sinh mẫu nuôi cấy

Mục đích của giai đoạn này là tái sinh các cơ quan từ mẫu nuôi cấy Mẫuthường là chồi đỉnh, chồi nách hay lát cắt đốt thân tùy thuộc đối tượng và mục đíchnghiên cứu Quan trọng nhất là cần chú ý đến trạng thái sinh lý của mẫu Khả năngthành công của nuôi cấy mô, tế bào phụ thuộc chủ yếu vào trạng thái tuổi của tếbào, càng gần trạng thái phôi sinh bao nhiêu thì nuôi cấy càng có khả năng thànhcông bấy nhiêu Như vậy, tế bào phôi thường có triển vọng nhất rồi đến tế bào đỉnhsinh trưởng đang hoạt động (đỉnh ngọn, đầu rễ), sau đó là tế bào ở trạng thái ngủ(chồi nách)

1.7.3 Nhân nhanh chồi

Đây là giai đoạn đánh giá tính ưu việt của phương pháp vi nhân giống Môitrường ở giai đoạn này được bổ sung điều hòa sinh trưởng thực vật (cytokinin,auxin) tăng thời gian chiếu sáng lên 16 giờ/ngày, cường độ ánh sáng tối thiểu là

1000 lux Ánh sáng tím là thành phần kích thích phân hóa mạnh, nhiệt độ thích hợp

từ 20 -NAA + 4mg/l BA 30oC

1.7.4 Tái sinh rễ

Khi chồi đạt đến một kích thước nhất định, mẫu được chuyển sang môitrường tạo rễ Môi trường này thường được bổ sung auxin (IBA, α-NAA + 4mg/l BANAA, 2,4-NAA + 4mg/l BAD) ở

liều lượng thích hợp Tuy nhiên, ở một số cây như chuối thì sự hình thành rễ tốt hơn

ở môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng

1.7.5 Đưa cây in vitro ra vườn ươm

Ở giai đoạn này, cây được chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng Vìvậy cần phải huấn luyện cho cây thích nghi với sự biến đổi của môi trường, đồngthời thay đổi những đặc điểm sinh lý và giải phẫu của cây con

1.8 Sơ lược về đối tượng nghiên cứu

1.8.1 Nguồn gốc

Cây hoa Huệ Hương có tên khoa học là Polianthes tuberose L Đây là loài

hoa cắt cành, thuộc nhóm cây thân thảo, cho hoa quanh năm, nở hoa vào ban đêm,

có nguồn gốc chủ yếu từ Mexico và hiện đã có mặt ở nhiều nước trên thế giới

Loài hoa này đã được du nhập vào nước ta từ rất lâu và được trồng phổ biếntại một số tỉnh thuộc vùng Nam Trung Bộ và Nam Bộ

1.8.2 Phân loại

Trong hệ thống phân loại thực vật học, cây

hoa Huệ Hương là cây thuộc:

-NAA + 4mg/l BA Ngành: Plantae (Thực vật)

-NAA + 4mg/l BA Lớp: Monocotyledonae (Một lá mầm)

-NAA + 4mg/l BA Bộ: Liliales (Hành)

-NAA + 4mg/l BA Họ: Amarylidaceae (Thủy Tiên)

-NAA + 4mg/l BA Chi: Polianthes

-NAA + 4mg/l BA Loài: Polianthes tuberose L.

Theo kết quả thống kê trên thế giới thì

hiện tại ở Mexico có khoảng 12 loài hoa Huệ

Hương

Hình 1.1 Polianthes tuberose L.

Riêng ở Việt Nam hiện nay, dựa vào đặc điểm của hoa thì chia thành 2giống, chủ yếu là huệ đơn và huệ kép

-NAA + 4mg/l BA Huệ đơn hay còn gọi là huệ xẻ: cây thấp, mảnh khảnh, cách hoa nhỏ, bông chỉ cómột lớp cánh nhưng hương thơm rất đậm.

-NAA + 4mg/l BA Huệ kép hay còn gọi là huệ tứ diện: cây cao, hoa dày và bông dài hơn huệ đơnnhưng hương thơm kém hơn

1.8.3 Đặc điểm thực vật học

1.8.3.1 Thân

Huệ thuộc cây thân thảo, thân hành hay còn gọi là thân giả được kết bởi các

bẹ lá xếp chồng lên nhau, bẹ lá trước xếp phủ lên bẹ lá sau Thân thẳng đứng khôngphân nhánh vươn lên thành ngồng hoa cao khoảng 0,8 -NAA + 4mg/l BA 1m

1.8.3.2 Lá

Cây hoa huệ có lá đơn mọc quanh gốc, xanh và dài, cuống lá gốc rộng và tothành hình như cái bao bao lấy củ, giữa phiến lá và bẹ lá không phân biệt rõ ràng.Chiều dài lá khoảng 20 -NAA + 4mg/l BA 30cm, bề rộng của lá từ 0,5 -NAA + 4mg/l BA 1cm

1.8.3.3 Hoa

Cây hoa huệ là cây cho hoa quanh năm, nhưng hoa nở chủ yếu vào mùa hècòn mùa đông tỷ lệ ra hoa ít, hoa nhỏ và bông nắng hơn

Hoa huệ có màu trắng, bao hoa hình phễu, thường tỏa hương vào ban đêm Hoa có

vị ngọt, hơi chát, thơm, không độc Cành hoa thường dài, ở nách mỗi lá có 2 hoamàu trắng, có tràng đơn hay tràng kép, nhị gắn giữa ống, bầu dưới 3 ô

1.8.3.4 Củ và rễ

Cây huệ có bộ rễ chùm phát triển mạnh, rễ phân bố chủ yếu ở lớp đất mặt 1-NAA + 4mg/l BA15cm Có 2 loại rễ: rễ mọc từ củ mẹ ban đầu gọi là rễ sơ cấp và rễ mọc từ củ congọi là rễ thứ cấp, củ huệ thực chất chính là thân ngầm của cây huệ

1.8.4 Yêu cầu ngoại cảnh của cây hoa Huệ Hương

vậy, khi nhiệt độ mùa hè quá cao kéo dài sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng tới khả năngsinh trưởng của cây, chất lượng hoa và nhất là sâu bệnh phá hại mạnh.

Trước khi phân hóa hoa và lúc cây có 5 -NAA + 4mg/l BA 6 lá cần nhiệt độ mát mẻ (15 -NAA + 4mg/l BA 22oC) nếukhông tỷ lệ nở hoa sẽ rất thấp và chất lượng hoa kém

1.8.4.2 Ánh sáng

Cây hoa Huệ Hương là cây ưa sáng mạnh Giai đoạn đầu sau khi trồng, câysống chủ yếu nhờ vào nguồn dinh dưỡng từ củ Khi cây ra lá, cây sử dụng chất dinhdưỡng từ quá trình quang hợp Trong thời kỳ phân hóa mầm hoa nếu không cungcấp đủ ánh sáng thì tỷ lệ ra hoa thấp, hoa nhỏ

Ngoài ra, nếu thiếu ánh sáng cây hoa Huệ Hương rất dễ bị nhiễm bệnh.Trong điều kiện ngày ngắn, ánh sánh yếu thì ảnh hưởng mạnh đến sự sinh trưởngphát triển của cây Cường độ ánh sánh cũng là yếu tố ảnh hưởng tới sự sinh trưởng

và phân hóa mầm hoa Nếu cường độ chiếu sáng dưới 3500 lux thì cường độ quanghợp và sự thoát hơi nước giảm, cây mọc vống, cành lá yếu Do đó khi trồng ở vụđông cần đảm bảo chế độ chiếu sáng phù hợp để tạo điều kiện thuận lợi cho sự phânhóa mầm hoa, hoa tự dài đồng thời tăng chất lượng hoa Số giờ chiếu sáng thích hợpcho cây hoa huệ sinh trưởng và phát triển tốt từ 12 -NAA + 4mg/l BA 16 giờ và cường độ ánh sángkhoảng 6000 lux

1.8.4.3 Nước

Cây hoa Huệ Hương là cây rễ củ nên khi nảy mầm cũng như quá trình sinhtrưởng cần phải có đủ nước Các giai đoạn sinh trưởng khác nhau thì có nhu cầu vềnước khác nhau Sau khi trồng vài ngày, rễ mầm nhú ra và phát triển thì yêu cầu đấtxung quanh củ phải đủ ấm, vì vậy trước khi trồng nên tưới nước Khi cây mọc nếuđất quá khô thì phải tưới nước ngay Trong suốt thời kỳ sinh trưởng, cây hoa HuệHương cần rất nhiều nước, đặc biệt là ở giai đoạn có 3 -NAA + 4mg/l BA 7 lá, đây là thời kỳ cây cónhu cầu về nước lớn, nếu thiếu nước cây sẽ sinh trưởng chậm ảnh hưởng đến khảnăng phân hóa của hoa

1.8.4.4 Đất

Cây hoa Huệ Hương có thể trồng trên bất cứ loại đất nào, tuy vậy cây chỉsinh trưởng tốt, cho hoa đẹp trên loại đất hơi kiềm (pH = 6 -NAA + 4mg/l BA 7), có cấu trúc mịn, giữ

ẩm tốt Tuy vậy, cây hoa Huệ Hương không thích hợp ở nơi quá trũng, chua

Cây hoa Huệ Hương có thể trồng trên các loại đất có thành phần cơ giới sau:-NAA + 4mg/l BA Đất cát pha có độ tơi xốp cao, độ hổng lớn, thoáng khí, ngấm nước tốt nhưng có

độ phì kém Do đó, khi trồng hoa Huệ Hương trên loại đất này cần phải bón nhiềuphân hữu cơ để bổ sung dinh dưỡng cho cây

-NAA + 4mg/l BA Đất thịt nhẹ, thoát nước tốt, giàu dinh dưỡng là loại đất trồng thích hợp đối với câyhoa Huệ Hương Nếu đất quá ẩm, rễ rất dễ bị thối, vì thế vào mùa mưa cần chốngúng, tháo nước kịp thời không để ruộng bị ngập úng

Mặc khác hoa Huệ Hương cũng là cây rất mẫn cảm với các loại muối kimloại nặng Đặc biệt là loại đất có hàm lượng chì cao, rễ cây sinh trưởng kém, câyphát triển chậm và khả năng ra hoa kém Chính vì vậy trước khi trồng hoa huệ cầnchú ý đến các biện pháp canh tác đất

1.8.5 Kỹ thuật trồng và chăm sóc

1.8.5.1 Chuẩn bị giống

Theo phương pháp canh tác truyền thống, cây huệ trồng bằng củ, vì vậy khicây có nhiều lá úa vàng thì bới củ, tách nhẹ nhàng từng củ, chọn những củ có kíchthước đạt tiêu chuẩn sau đó cắt bỏ lá và rễ tiến hành phơi nắng 2 -NAA + 4mg/l BA 3 ngày cho lá héorồi đem bảo quản nơi thoáng mát, cao ráo, sau 2 -NAA + 4mg/l BA 3 tháng có thể đem trồng trở lại.Trong thời gian bảo quản nên thường xuyên kiểm tra tránh hiện tượng củ bị thối

Trong những năm gần đây, xuất hiện bệnh chai bông trên diện rộng, vì vậy

để phòng trừ bệnh chai bông trên cây hoa Huệ Hương cần tiến hành các bước sau:-NAA + 4mg/l BA Không sử dụng củ bị nhiễm bệnh hoặc lấy củ từ những ruộng đã bị nhiễm bệnhtrước đó làm củ giống

-NAA + 4mg/l BA Phơi củ trong vòng 1 -NAA + 4mg/l BA 1,5 tháng trước khi đem ra trồng

-NAA + 4mg/l BA Nên thay đổi chân đất sau mỗi vụ trồng hoặc luân canh cây hoa Huệ Hương vớimột loại cây trồng khác

-NAA + 4mg/l BA Khi phát hiện thấy có triệu chứng bệnh cần loại bỏ cây bệnh ra khỏi ruộng, phơikhô và đốt bỏ Khi không có củ giống sạch bệnh, có thể chọn củ ở cây không cótriệu chứng bệnh và tiến hành phơi nắng kĩ từ 1-NAA + 4mg/l BA1,5 tháng, sau đó xử lý củ với nướcnóng khoảng 56 -NAA + 4mg/l BA 57oC.

Quy trình xử lý củ Huệ Hương bằng nước nóng để phòng trừ bệnh chai bônggồm các bước sau:

-NAA + 4mg/l BA Bước 1: Chuẩn bị củ Huệ Hương để xử lý

Sau khi thu hoạch, đem phơi củ trong 1 -NAA + 4mg/l BA 1,5 tháng, chọn những củ có đườngkính từ 3 cm trở lên để xử lý

-NAA + 4mg/l BA Bước 2: Xử lý củ Huệ Hương bằng nước nóng

Đổ nước nóng và nước lạnh vào trong một thùng nhựa với tỷ lệ 6:5, rồi điềuchỉnh để nhiệt độ nước trong thùng khoảng 56 -NAA + 4mg/l BA 57oC thì bắt đầu cho củ vào nước.Lượng nước xử lý cần gấp 6 -NAA + 4mg/l BA 7 lần lượng củ xử lý Sau đó đậy nắp thùng khoảng

15 phút và lại chỉnh cho nước trở lại nhiệt độ 56 -NAA + 4mg/l BA 57oC bằng cách đổ thêm một ítnước sôi từ từ khuấy đều, và ngâm củ trong thùng đậy kín trong 15 phút nữa

-NAA + 4mg/l BA Bước 3: Sau khi xử lý xong, củ được rải đều và phơi khô trong 2 ngày sau rồi đemtrồng ra ruộng

1.8.5.2 Chuẩn bị đất

Nên chọn nơi trảng nắng, luống trồng liên tiếp rộng khoảng 1,2 m và sâu0,5m để có thể giữ nước tốt Luống đất nên bố trí dọc theo hướng mặt trời để câynhận ánh sáng tốt và đồng đều Trước khi trồng nên bón phân lót và phun xịt cácloại thuốc diệt nấm và mầm bệnh

1.8.5.3 Chăm sóc

Trong canh tác cây hoa Huệ Hương yếu cầu về nước rất là quan trọng, phảithường xuyên tưới nước đồng thời phải xớt đất và làm cỏ giúp cho bộ rễ phát triểntốt Phân bón thường sử dụng để bón cho cây là hỗn hợp (Ure, lân và Kali), sau khitrồng được khoảng 2 -NAA + 4mg/l BA 3 năm cây hoa Huệ Hương bắt đầu bị thoái hóa: sinh trưởngchậm, cho hoa ít và chất lượng kém Do đó phải nhổ lên phân loại củ và trồng lạitrên một diện tích khác

Trong thời gian trồng và thu hoạch cần tiến hành trừ cỏ, xới đất, bón phân,tưới nước, phun thuốc…, thường xuyên để tránh lây lam nguồn sâu bệnh hại.

Khi trừ cỏ phải tiến hành theo nguyên tắc trừ sớm, trừ khi cỏ còn non và trừsạch, có thể trừ cỏ bằng tay hoặc bằng thuốc

Trong quá trình trồng, nên bón phân với số lượng ít và chia thành nhiều đợtnhư bón lót, bón thúc Ngoài cách bón vào đất còn có thể phun lên lá để bổ sungdinh dưỡng, hỗ trợ cho quá trình ra hoa và chống rụng nụ hoa Trong thời kì phânhóa mầm hoa cần bón thêm phân đạm, khi ra nụ và sau khi ra hoa cần bón thêm lân

và kali

1.8.6 Vấn đề sâu bệnh trên cây hoa Huệ Hương

Trên cây hoa Huệ Hương, sâu thường gặp là rệp sáp, nhện đỏ và nhất làtuyến trùng

Bệnh gây hại trên cây hoa Huệ Hương được chia thành hai nhóm:

-NAA + 4mg/l BA Nhóm bệnh không truyền nhiễm, do ngoại cảnh không phù hợp thường gặp nhất làthối xám, thối gốc, đốm lá, gỉ sắt… có thể phòng trị bằng các loại thuốc hóa học.-NAA + 4mg/l BA Nhóm bệnh truyền nhiễm chủ yếu là do vi sinh vật ký sinh gây ra bao gồm : vikhuẩn, xạ khuẩn, nấm, mycoplasma, virus,… thường rất khó trị, nhất là bệnh dovirus gây ra rất dễ lây lan và phát tán thành dịch, gây hại nghiêm trọng và truyền từđời này sang đời khác, đặc biệt là ở nhóm cây nhân giống vô sinh (bằng củ) như câyhuệ Virus không thể phòng chống hay tiêu diệt bằng hóa chất như vi khuẩn, nấm,,sâu bệnh, cách duy nhất để loại bỏ virus là phải tách chúng ra khỏi cây bị bệnh, trảlại cho cây cuộc sống bình thường khỏe mạnh Vì vậy, biện pháp làm sạch virusphải luôn được kết hợp với biện pháp duy trì tính sạch bệnh

Sau khi trồng khoảng 1 tháng, ở cây hoa Huệ Hương thường bị nhện đỏ pháhại nặng trên lá, từ 3 -NAA + 4mg/l BA 4 tháng trở đi cây dễ bị rệp sáp phá hại nên có thể phòng trịbằng các loại thuốc sau : Nissorun, Kelthan 20 EC, Comite, Basudin 10H Khoảngtháng 9 -NAA + 4mg/l BA 10, khi trời mưa kéo dài huệ dễ bị úng thối lá, thối củ thì có thể khắc phụchiện tượng này bằng các loại thuốc như: Anuil, Topsin, Ridomol…

1.8.7 Giá trị kinh tế

Với đặc điểm sinh thái dễ thích nghi với vùng khí hậu nhiệt đới như ở nước

ta đồng thời yêu cầu trồng và chăm sóc không quá khắt khe nên Huệ Hương đượctrồng khá phổ biến và đem lại thu nhập rất cao cho người dân

Trong những năm gần đây, cây hoa Huệ Hương đem lại thu nhập cao chongười dân các tỉnh phía Nam như Tiền Giang, Đồng Tháp… Đặc biệt, tại các tỉnhNam Trung Bộ như Bình Định, Khánh Hòa, từ khu người dân mở rộng diện tích vànâng cao kỹ thuật canh tác, cây hoa huệ đã trở thành cây trồng chính, đem lại thunhập cao và trở thành cây xóa đói giảm nghèo Hiện nay, thu nhập từ cây hoa HuệHương ở đồng bằng song Cửu Long bình quân từ 150 -NAA + 4mg/l BA 200 triệu/ha và ở NamTrung Bộ là 80 -NAA + 4mg/l BA 150 triệu/ha

Ngoài giá trị sử dụng thông thường như trên, gần đây người ta còn sử dụngmột số bộ phận của cây làm thuốc chữa bệnh và chế ra các loại dầu thơm

Hiện nay, một số nghiên cứu về loài hoa này đã tìm ra một số thành phần hóa học

có liên quan đến việc sản xuất ra các loại dầu thơm, nước hoa quý… được chiếtxuất từ các bộ phận như hoa, sáp hoa… trong đó loại tinh dầu tuyệt đối thu được khichiết xuất từ hoa như alcol benzil chiếm 0,7%, benzoat metal (4,5%), antranilatmetal (8,0%), metilisoeugenol (10%), benzoate benzil (24%) Ngoài ra, n-NAA + 4mg/l BAalkanchiếm tỷ lệ không nhỏ tới 42% trong sáp hoa cũng là một thành phần hóa học quantrọng trong việc chế xuất các loại nước hoa, dầu thơm

Bên cạnh đó, cây hoa Huệ Hương còn có công dụng trong y học, bộ phậnđược sử dụng là củ Trong tinh dầu củ huệ có chứa thành phần sapogenin,sapogenin bao gồm hecogenin, tigogenin là loại hợp chất được chiết xuất để bào chế

ra một số loại thuốc quý Từ lâu trong nhân gian người dân đã biết sử dụng cây hoaHuệ Hương để làm thuốc chữa một số bệnh đơn giản Ở Ấn Độ người ta đã dùng củphơi khô, tán thành bột để làm thuốc trị liệu, hoặc ở Vũng Tàu người dân nơi đây đãdùng củ để chữa bệnh sốt rét

Ở một số nơi, dân gian còn dùng củ để chữa bệnh hóc xương bằng cách đemgiã nát củ, vắt lấy nước rồi nhỏ vào họng của người bị hóc xương sau 1 -NAA + 4mg/l BA 2 phút sẽkhỏi.

1.9 Tình hình sản xuất hoa huệ trong nước

Du nhập vào nước ta từ rất lâu và được trồng rộng rãi trong cả nước, nhưngcây hoa Huệ Hương được trồng phổ biến hơn cả ở miền Nam và Nam Trung Bộ.Trong những năm gần đây, diện tích canh tác cây hoa Huệ Hương ngày càng được

mở rộng và đem lại thu nhập cao cho người trồng

Theo thống kê hiện nay, trên địa bàn các tỉnh Đồng bằng song Cửu Long códiện tích trồng huệ lớn hơn cả Trung bình các tỉnh có khoảng 500 -NAA + 4mg/l BA 1000 ha canhtác cây hoa Huệ Hương, khi thu hoạch có thể thu nhập từ 150 -NAA + 4mg/l BA 200 triệu/ha

Do cây này dễ trồng, chi phí đầu tư thấp, ít bị ảnh hưởng bởi các yếu tố thờitiết và đặc biệt hơn là hoa huệ cho thu hoạch tới 14 tháng/vụ nên trong điều kiệnthuận lợi thường cho thu nhập cao

Trong những năm gần đây, trên địa bàn các tỉnh vùng Nam Trung Bộ bắt đầuđẩy mạnh canh tác cây hoa Huệ Hương, đặc biệt là ở Bình Định và Khánh Hòa ỞBình Định, cây hoa Huệ Hương dần trở thành cây trồng chính Theo đánh giá củangười dân nơi đây, trong điều kiện thuận lợi mỗi ha bình quân cho thu nhập trên 80-NAA + 4mg/l BA 120 triệu đồng

Mặc dù vậy, hiện nay việc canh tác cây huệ đang gặp nhiều khó khăn, do bịsâu bệnh hại phá hoại nhiều, trong đó có một bệnh rất khó trị là bệnh chai bông.Hiện nay bệnh phá hoại rất mạnh, có thể làm giảm đến 60% năng suất cây trồng.Chính vì vậy, năng suất hoa Huệ Hương trên nhiều vùng có xu hướng không ổnđịnh và chất lượng hoa thì giảm đáng kể

Hiện nay, bệnh chai bông đang là nguyên nhân chính làm cho giảm năng suất

và phẩm chất hoa trên các vùng chuyên canh, đặc biệt ở Nam Trung Bộ và Nam Bộ.Triệu chứng bệnh thể hiện:

-NAA + 4mg/l BA Trên lá: trước khi ra hoa, trên lá của cây con bị nhiễm bệnh thường xuất hiện cácđường gân sọc màu nâu đỏ kéo dài từ bẹ lá đến chóp lá, lá có thể bị xoắn

-NAA + 4mg/l BA Trên bông: nếu bị nhiễm nặng, bông sẽ bị cai không trỗ được hoặc bông bị đenthui và khô, bẹ lá hầu như bị thâm màu nâu đỏ.

-NAA + 4mg/l BA Trên thân: khi bị nhiễm bệnh, thân bị lùn, vỏ thân có những chai sần dày đặc

Theo phương pháp nhân giống truyền thống, đối với hoa Huệ Hương, nguồnvật liệu ban đầu để sản xuất hoa thương phẩm là củ giống, chất lượng củ giống đóngvai trò quan trọng, nó ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển và chất lượng củahoa sau này

Củ tái sinh theo phương pháp thông thường dựa trên nguyên lý chung là ởphía trong các nách lá có một chồi ngủ (chồi nách), các chồi này khi gặp điều kiệnthuận lợi sẽ phát triển thành chồi bên

Nhìn chung, phương pháp này đơn giản, dễ làm và chi phí đầu tư không caonhưng có rất nhiều nhược điểm: hệ số nhân thấp, thường làm thoái hóa giống, gâubệnh hàng loạt ảnh hưởng lớn đến năng suất và chất lượng hoa

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Địa điểm thực hiện đề tài

-NAA + 4mg/l BA Phòng Công nghệ Sinh học thuộc Trung tâm nghiên cứu ứng dụng tiến bộ khoahọc Công nghệ -NAA + 4mg/l BA Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Bình Định

2.2 Đối tượng nghiên cứu

-NAA + 4mg/l BA Phần đỉnh của các mắt ngủ tách từ củ hoa Huệ Hương

Hình 2.1 Hoa Huệ Hương

Hình 2.2 Củ hoa Huệ Hương

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp khử trùng mẫu cấy

Mẫu cấy được chọn là phần đỉnh của các mắt ngủ được lấy từ củ HuệHương Các củ Huệ Hương có chứa mắt ngủ được thu hoạch, sau đó được làm sạch

bề mặt mẫu vật bằng vòi nước chảy mạnh trong 15 phút để loại bỏ những nơi cóbám đất cát Củ Huệ Hương được ngâm trong bột giặt 30 phút rồi rửa lại dưới vòinước chảy trong 5 phút Sau đó tiến hành cắt củ thành lát mỏng có chứa các mắtngủ Sau đó rửa lại bằng nước cất và đem vào buồng cấy để khử trùng

Khử trùng mẫu trong buồng cấy bằng nước cất vô trùng 3 lần rồi rửa lại bằngcồn 70% trong 15 -NAA + 4mg/l BA 20 giây rồi tráng lại bằng nước cất vô trùng lần 1 Sau đó tiếnhành khử trùng mẫu theo các thí nghiệm để tìm ra chế độ khử trùng tốt

2.3.2 Phương pháp nuôi cấy khởi động

Các mẫu sau khi khử trùng được cắt bằng dao chỉ lấy phần đỉnh mắt ngủ cókích thước từ 1 -NAA + 4mg/l BA 2mm Sau đó được cấy vào môi trường MS có bổ sung các chấtđiều tiết sinh trưởng tùy từng thí nghiệm

2.3.3 Phương pháp nhân nhanh

Chồi bất định hình thành có chiều cao khoảng 2 -NAA + 4mg/l BA 3cm cấy vào môi trườngnhân nhanh MS có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng

Các protocorm hình thành trong quá trình nuôi cấy khởi động mẫu và nhânnhanh chồi được tách ra rồi cấy vào môi trường nhân nhanh MS có bổ sung các chấtđiều tiết sinh trưởng

2.3.4 Phương pháp tạo cây hoàn chỉnh

Sau giai đoạn nhân nhanh, các chồi có chiều cao 4 -NAA + 4mg/l BA 5cm, có trạng thái sinhtrưởng và phát triển bình thường được cấy vào môi trường ra rễ để tạo thành câyhoàn chỉnh Môi trường ra rễ là môi trường MS có bổ sung các chất thuộc nhómauxin và than hoạt tính