Đang tải... (xem toàn văn)
Xác định được ảnh hưởng của các chất đều hòa sinh trưởng thực vật lên quá trình phát sinh hình thái trong quy trình nhân giống cây hoa Huệ Hương bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào, làm cơ sở cho việc hình thành quy trình nhân giống in vitro cây hoa Huệ Hương, góp phần giải quyết những khó khăn của thực tiễn sản xuất hoa.
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC BẢNG i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv LỜI MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 40 4.1. Kết luận 40 4.2. Đề nghị 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ LỤC 46 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của HgCl 2 0,1% ở các mức thời gian khác nhau đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy. 28 Bảng 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của việc kết hợp HgCl 2 0,1% và Ca(OCl) 2 15% đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy. 29 i Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ Bảng 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của kinetin lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy 29 Bảng 2.4. Khảo sát ảnh hưởng của BA đến khả năng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy. 29 Bảng 2.5. Khảo sát ảnh hưởng kết hợp của BA và các auxin khác nhau lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy. 30 Bảng 3.1. Ảnh hưởng HgCl2 0,1% ở các mức thời gian khác nhau đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy sau 4 tuần nuôi cấy 32 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của việc kết hợp HgCl2 0,1% trong 15 phút và Ca(OCl)2 15% đến hiệu quả khử trùng mẫu sau 4 tuần nuôi cấy. 33 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của kinetin lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy sau 8 tuần nuôi cấy 35 Bảng 3.4. Ảnh hưởng ảnh hưởng của BA đến khả năng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy sau 8 tuần nuôi cấy 37 Bảng 3.5. Ảnh hưởng kết hợp của BA và các auxin khác nhau lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy sau 8 tuần nuôi cấy ii Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ 40 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Polianthes tuberose L. 13 Hình 2.1. Hoa Huệ Hương 26 Hình 2.2. Củ hoa Huệ Hương 26 Hình 3.1. Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 9 g/l agar + 2mg/l Kinetin 36 Hình 3.2. Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 9 g/l agar + 4mg/l BA 39 Hình 3.3. Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 9 g/l agar + 0,25mg/l IBA + 4mg/l BA 41 iii Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ Hình 3.4. Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 9 g/l agar + 0,25mg/l 2,4D + 4mg/l BA 41 Hình 3.5. Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 9 g/l agar + 0,25mg/l α-NAA + 4mg/l BA 42 Hình 3.6. Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 9 g/l agar + 0,25mg/l IAA + 4mg/l BA 42 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT MS: Murashige and Skoog, 1962 BA: Benzyl adenin IBA: Indol butyric acid α-NAA: α-naphtyl acetic acid iv Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ 2,4-D: 2,4 diclorophenoxy acetic acid IAA: Indol acetic acid v Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ LỜI MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Cây hoa Huệ Hương (Polianthes tuberose L.) là cây hoa cắt cành thuộc nhóm thân thảo, thích cường độ ánh sáng cao và cho hoa quanh năm. Hoa Huệ Hương được nhập vào nước ta từ rất lâu. Cây hoa Huệ Hương được trồng phổ biến tại vùng Nam Trung Bộ đem lại thu nhập khá cao cho người trồng và chính là cây xóa đói giảm nghèo cho vùng chuyên canh loài cây này. Hiện nay, việc canh tác cây hoa Huệ thường chủ yếu được nhân giống bằng kỹ thuật nhân giống truyền thống, chủ yếu là lấy củ trồng. Với phương pháp nhân giống này dễ lây lan các mầm bệnh có sẵn trong củ, đặc biệt là bệnh virus làm giảm năng suất và phẩm chất hoa, khiến cho giống hoa này ngày càng thoái hóa. Trong những năm gần đây, bệnh hại trên cây hoa Huệ Hương xuất hiện nhiều, đặc biệt trong đó có một bệnh rất khó trị là bệnh chai bông. Tác nhân gây bệnh hiện vẫn chưa xác định được. Bệnh xuất hiện trên diện rộng làm ảnh hưởng đến năng suất và phẩm chất hoa. Bệnh không làm cho cây chết ngay nhưng làm cho chồi, củ, hoa kém phát triển, làm thất thu nguồn thu nhập của nông dân. Các triệu chứng bệnh do virus được mô tả bởi Horner và Person (1988), Chen và Chang (1998) gần giống các biểu hiện ở cây hoa Huệ Hương ở Nam Trung Bộ. Vấn đề đặt ra là làm thế nào để tạo nguồn giống sạch bệnh cung cấp cho nhân dân? Phương pháp nhân giống in vitro với rất nhiều ưu điểm, tạo được cây con trẻ hóa và sạch bệnh nên tiềm năng sinh trưởng, phát triển và năng suất cao, khắc phục được nhược điểm của phương pháp nhân giống truyền thống, khôi phục lại phẩm chất vốn có của giống. Đồng thời hệ số nhân của phương pháp nhân giống này cao đáp ứng được nhu cầu về số lượng giống có chất lượng cao, ổn định đáp ứng được nhu cầu sản xuất trên quy mô rộng. Cho đến nay kĩ thuật nuôi cấy mô đã được nghiên cứu ứng dụng rất có hiệu quả trong việc nhân giống hàng loạt các loại cây 1 Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ trồng tạo ngân hàng cây giống sạch bệnh, khỏe mạnh cho năng suất cao, phẩm chất tốt cung cấp cho sản xuất. 2. Mục đích nghiên cứu Xác định được ảnh hưởng của các chất đều hòa sinh trưởng thực vật lên quá trình phát sinh hình thái trong quy trình nhân giống cây hoa Huệ Hương bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào, làm cơ sở cho việc hình thành quy trình nhân giống in vitro cây hoa Huệ Hương, góp phần giải quyết những khó khăn của thực tiễn sản xuất hoa. 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Cây hoa Huệ Hương là đối tượng mới của sản xuất cây giống bằng phương pháp nuôi cấy mô ở nước ta. Xuất phát từ yêu cầu khó khăn của thực tiễn, nhằm khắc phục hiện tượng chai bông trên cây hoa Huệ Hương, một giống hoa Huệ quý mang lại hiệu quả cao cho nông dân. Trên cơ sở đó, việc nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây hoa Huệ đã được tiến hành thử nghiệm. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Đề tài đã đưa ra được các minh chứng về tác động của phương pháp khử trùng đến tỷ lệ sống của mẫu cây, tác động của chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng phát sinh hình thái. Kết quả nghiên cứu đề tài có thể sử dụng nghiên cứu trong nuôi cấy mô tế bào cây hoa. Góp phần sản xuất cây giống có hiệu quả cao, chất lượng tốt, ứng dụng vào sản xuất sẽ góp phần nâng cao hiệu quả kinh tế của ngành sản xuất cây hoa Huệ. 5. Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến quá trình phát sinh hình thái của mầm ngủ trên củ hoa Huệ Hương. Sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật như: kinetin, BA, IBA, α-NAA, 2,4-D, IAA. 2 Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Nhân giống cây bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào Là phương pháp nuôi cấy mô tế bào trong môi trường dinh dưỡng nhân tạo trong điều kiện vô trùng và tái sinh chúng thành cây con. Nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào là phương pháp mới bổ sung cho các kỹ thuật nhân giống truyền thống nhiều kỹ thuật tiến bộ, có thể khắc phục được những hạn chế của các phương pháp nhân giống truyền thống. 1.2. Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật Năm 1838, trên cơ sở những nghiên cứu độc lập, hai nhà bác học người Đức là Schleiden và Schwamn cùng khởi xướng học thuyết tế bào. Học thuyết này cho rằng tế bào là đơn vị cấu trúc và chức năng của sinh vật, vì vậy có khả năng tồn tại độc lập. Gottlibe Haberlandt là người đầu tiên đề xuất phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật vào năm 1902 để chứng minh học thuyết về tính toàn năng của tế bào. Theo ông mỗi tế bào của bất kỳ cơ thể nào đều mang toàn bộ hệ thống di truyền cần thiết và đầy đủ thông tin của sinh vật đó, khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh. Ông tiến hành thí nghiệm với tế bào khí khổng và các tế bào đã được biệt hóa về chức năng khác nhưng không thành công. Điều đó đã giảm sự tin tưởng của các nhà khoa học đối với phương pháp nuôi cấy mô tế bào trong thời gian dài. Đến năm 1922 học trò của Gottlibe Haberlandt là Kotte và Robbinss đã làm lại thí nghiệm của ông. Họ đã lấy đỉnh sinh trưởng của rễ cây hòa thảo nuôi cấy trong môi trường có khoáng, đường, đầu rễ đã sinh trưởng mạnh và tạo ra hệ rễ nhỏ và cả rễ phụ. Tuy nhiên sự sinh trưởng chỉ tồn tại trong một thời gian mặc dù chuyển sang môi trường mới. Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ 2 trong lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật khi White đã nuôi cấy thành công đầu tiên rễ cà chua trên môi trường lỏng có chứa đường, muối khoáng, dịch chiết nấm men. Các thí nghiệm tiếp theo ông thay thế 3 Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ dịch chiết nấm men bằng hỗn hợp 3 vitamin nhóm B : thiamin (B1), nicotinic acid (B3), pyridioxin (B6). Sau đó ít lâu Went và Thimann tìm ra chất kích thích sinh trưởng đầu tiên là IAA. Năm năm sau Gautheret đã thông báo về sự tái sinh của cây cà rốt, đây cũng là lần đầu tiên sự phát triển của mô sẹo không bị giới hạn. Bằng cách thêm IAA vào môi trường nuôi cấy, ông có thể kích thích sự phát triển của mô đã biệt hóa trên vết cắt của bề mặt mẫu cấy vô trùng. Sau này người ta mới thấy rằng callus có thể trực tiếp nuôi cấy vô thời hạn. Đến năm 1948, Steward xác nhận tác dụng của nước dừa trên mô sẹo cà rốt. Trong thời gian này nhiều chất sinh trưởng thuộc nhóm auxin được tổng hợp như naphthylacetiic acid (NAA), 2,4-Diclophenoxyacetic acid (2,4D). Nhiều tác giả nhận thấy cùng với nước dừa, NAA và 2,4 D đã giúp tạo mô sẹo gây phân chia tế bào thành công ở nhiều đối tượng thực vật trước đó khó nuôi cấy. Năm 1955, Miller và Skoog đã xác định vai trò của chất kích thích sinh trưởng là 6-Furfuryl aminopurin (kinetin). Việc phát hiện ra chất kích thích sinh trưởng, vitamin và nước dừa là những bước tiến quan trọng trong giai đoạn thứ 2. Năm 1957, Miller và Skoog đã công bố các kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của tỷ lệ auxin/kinetin trong môi trường nuôi cấy đối với sự hình thành cơ quan, tỷ lệ auxin/kinetin thấp, mô sẹo có khuynh hướng tạo chồi, ngược lại tỷ lệ auxin/kinetin tăng, mô sẹo có khuynh hướng tạo rễ. Hiện nay, những kết quả này cũng được quan sát thấy trên nhiều loại cây khác nhau và đóng góp nhiều vào việc điều khiển quá trình sinh trưởng, phát triển và phát sinh cơ quan của mô tế bào trong nuôi cấy. Thành công của Miller và Skoog đã mở đầu cho giai đoạn thứ ba của lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật. Những thành công trên là cơ sở bùng nổ ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế báo thực vật trong sản xuất. Morel và Martin đã phát triển kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để tạo giống sạch bệnh ở khoai lang và hoa lan. Chính hai nhà khoa học này đã mở đầu cho một hướng mới của nuôi cấy mô tế bào thực vật, đó là vi nhân giống. 4 Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ Từ những năm 1960, ngoài các hướng trên, nuôi cấy bao phấn và hạt phấn, nuôi cấy tế bào đơn và tế bào trần được phát triển mạnh. Các kỷ thuật lai soma bằng dung hợp tế bào trần và kỷ thuật chuyển gen được phát triển và thu được những thành tựu đáng kể. Chúng ta đang bước vào giai đoạn thứ 4 của nuôi cấy mô tế bào thực vật. Đó là giai đoạn nuôi cấy mô tế bào được ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học và vao nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao. 1.3. Cơ sở lý luận của nuôi cấy mô tế bào thực vật Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào in vitro là học thuyết về tính toàn năng (totipotence) của tế bào. Theo Haberlandt G. (1902), nhà thực vật người Đức, tất cả các tế bào của cây đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của cơ thể, khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có khả năng tái sinh và phát triển thành cá thể hoàn chỉnh. Thực tế đã chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ. Hàng trăm loài cây trồng đã được nhân giống trên qui mô thương mại bằng cách nuôi cấy trong môi trường nhân tạo vô trùng và tái sinh chúng thành cây với hệ số nhân giống vô cùng lớn (Murashige, 1980). Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy in vitro thực vật thực chất là kết quả của các quá trình phân hóa và phản phân hóa. Tất cả các tế bào trong các cơ quan khác nhau của cơ thể thực vật đều bắt nguồn từ tế bào phôi sinh. Sự chuyển tế bào phôi sinh thành các tế bào chuyên hóa để đảm nhiệm các chức năng khác nhau được gọi là sự phân hóa tế bào. Còn quá trình phản phân hóa thì ngược lại với quá trình phân hóa, có nghĩa là tế bào đã phân hóa thành mô chức năng không hoàn toàn mất đi khả năng phân chia mà ở điều kiện thích hợp chúng có thể trở về dạng phôi sinh và tái phân chia. Bản chất của quá trình này là một quá trình hoạt hóa, ức chế các gen. Trong quá trình phát triển cá thể, ở từng thời điểm nhất định đều có một số gen nhất định được hoạt hóa cho ta tính trạng mới, một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều 5 [...]... sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên tới quá trình phát sinh hình thái của mẫu cấy Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, để điều khiển sự phát sinh hình thái thực vật việc bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật có vai trò đặc biệt quan trọng Trong các chất điều tiết sinh trưởng, có hai nhóm chất được sử dụng nhiều trong các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô là cytokynin và auxin... đó, các chất cytokinin: BA, kinetin và các auxin: α-NAA, 2,4D, IAA có hiệu quả kích thích sự phát sinh chồi từ phân sinh mô chồi cây hoa Huệ Hương Trong thí nghiệm này chúng tôi tập trung nghiên cứu ảnh hưởng riêng lẻ BA và kinetin, đồng thời nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp của BA và các auxin đến sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy Thí nghiệm 2.1 Khảo sát ảnh hưởng của kinetin lên khả năng phát sinh. .. với quá trình phát sinh hình thái của mẫu cấy, nên sử dụng BA ở nồng độ này để tiến hành khảo sát ảnh hưởng kết hợp của BA với các auxin khác Thí nghiệm 2.3 Khảo sát ảnh hưởng kết hợp của BA với các auxin khác nhau lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy 26 Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ Bảng 2.5 Khảo sát ảnh hưởng kết hợp của BA với các auxin khác nhau lên khả năng phát sinh hình thái của. .. Khảo sát ảnh hưởng của việc kết hợp HgCl 2 0,1% và Ca(OCl)2 15% đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy Nghiệm thức A0 A1 A2 A3 A4 Ca(OCl)2 15% (phút) 0 10 20 30 40 HgCl2 0,1% (phút) 15 Thí nghiệm 2 Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật tới quá trình phát sinh hình thái của mẫu cấy Thí nghiệm 2.1 Khảo sát ảnh hưởng của kinetin lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy 25 Khóa luận tốt... Bảng 2.3 Khảo sát ảnh hưởng của kinetin lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy Nghiệm thức A0 A1 A2 A3 A4 A5 Nồng độ kinetin (mg/l) 0 1 2 3 4 5 Thí nghiệm 2.2 Khảo sát ảnh hưởng của BA đến khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy Bảng 2.4 Khảo sát ảnh hưởng của BA đến khả năng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy Nghiệm thức A0 A1 A2 A3 A4 A5 Nồng độ BA (mg/l) 0 1 2 3 4 5 Sau khi thực hiện xong... dụng tiến bộ khoa học Công nghệ - Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Bình Định 2.2 Đối tượng nghiên cứu - Phần đỉnh của các mắt ngủ tách từ củ hoa Huệ Hương Hình 2.1 Hoa Huệ Hương Hình 2.2 Củ hoa Huệ Hương 22 Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp khử trùng mẫu cấy Mẫu cấy được chọn là phần đỉnh của các mắt ngủ được lấy từ củ Huệ Hương Các củ Huệ Hương có chứa... Đỉnh sinh trưởng không có hệ mô dẫn, làm cho virus và vi sinh vật không có khả năng thâm nhập 6 Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ - Đỉnh sinh trưởng là nơi sinh tổng hợp của auxin nên hàm lượng auxin khá cao, auxin có tác dụng ức chế sinh sản của virus - Quá trình phân chia của tế bào phôi sinh (ở đỉnh sinh trưởng) không kéo theo sự phân chia của virus Về phương diện hệ số nhân, nhân giống in vitro. .. rễ thứ cấp, củ huệ thực chất chính là thân ngầm của cây huệ 1.8.4 Yêu cầu ngoại cảnh của cây hoa Huệ Hương 1.8.4.1 Nhiệt độ Nhiệt độ là yếu tố vật lý có ảnh hưởng lớn đến thời gian sinh trưởng, phát triển cũng như khả năng phân hóa hoa của cây hoa Huệ Hương Cây hoa Huệ Hương là cây ưa nhiệt độ mát mẻ (20 - 25 oC), nhưng chịu nóng tốt, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và á nhiệt đới, cho hoa tốt vào mùa... Mỹ bào các đỉnh sinh trưởng đang ở trạng thái hoạt động (đỉnh ngọn, chóp rễ) và sau đó là tế bào ở trạng thái ngủ nghỉ (chồi nách) Trong nhân giống in vitro, cây non có thể được tái sinh từ các điểm sinh trưởng có sẵn trong các bộ phận (phôi, đỉnh chồi, chồi nách) hoặc từ những mô có khả năng hình thành điểm sinh trưởng phụ Có hai phương pháp tái sinh cây con: + Tái sinh trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng, ... cytokynin và auxin Tỷ lệ và hàm lượng hai nhóm chất điều hòa sinh trưởng này có vai trò quan trọng đến sự phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy theo hướng phát sinh cơ quan, phát sinh phôi soma hay tạo callus Các chất thuộc nhóm auxin thì tác dụng kích thích tạo rễ và callus mạnh, còn các chất thuộc nhóm cytokynin thì có tác dụng kích thích tạo chồi Cây hoa Huệ Hương là đối tượng mới trong nghiên cứu nuôi