thực vật lên tới quá trình phát sinh hình thái của mẫu cấy.
Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, để điều khiển sự phát sinh hình thái thực vật việc bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật có vai trò đặc biệt quan trọng. Trong các chất điều tiết sinh trưởng, có hai nhóm chất được sử dụng nhiều trong các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô là cytokynin và auxin. Tỷ lệ và hàm lượng hai nhóm chất điều hòa sinh trưởng này có vai trò quan trọng đến sự phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy theo hướng phát sinh cơ quan, phát sinh phôi soma hay tạo callus. Các chất thuộc nhóm auxin thì tác dụng kích thích tạo rễ và callus mạnh, còn các chất thuộc nhóm cytokynin thì có tác dụng kích thích tạo chồi. Cây hoa Huệ Hương là đối tượng mới trong nghiên cứu nuôi cấy mô ở nước ta. Hiện nay chỉ có một vài nghiên cứu bước đầu trên đối tượng này. Theo đó, các chất cytokinin: BA, kinetin... và các auxin: α-NAA, 2,4D, IAA... có hiệu quả kích thích sự phát sinh chồi từ phân sinh mô chồi cây hoa Huệ Hương.
Trong thí nghiệm này chúng tôi tập trung nghiên cứu ảnh hưởng riêng lẻ BA và kinetin, đồng thời nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp của BA và các auxin đến sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy.
Thí nghiệm 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của kinetin lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy.
Kinetin là một cytokinin tổng hợp được sử dụng chủ yếu trong kỹ thuật nuôi cấy mô. Ngoài tác dụng kích thích sự hình thành chồi, kinetin còn có tác dụng cải thiện chất lượng chồi trong quá trình nuôi cấy. Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ của kinetin đến khả năng kích thích mẫu phát sinh hình thái. Sau 8 tuần theo dõi, kết quả được thể hiện ở bảng 3.3 dưới đây.
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ kinetin lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy sau 8 tuần nuôi cấy.
Nghiệm thức Nồng độ kinetin (mg/l) Tỷ lệ mẫu cảm ứng (%) Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) Tỷ lệ mẫu tạo protocorm (%) Hình thái mẫu tái sinh A0 0 0,00 0,00 0,00 - A1 1 30,83 25,83 5,00 Phần lớn chồi tạo thành xanh, có chiều cao thấp. Protocorm nhỏ, màu xanh, hơi vàng A2 2 63,33 55,83 7,50 A3 3 54,17 46,67 7,50 A4 4 51,67 45,00 6,67 A5 5 47,50 39,17 8,33 Ghi chú : (-) không có
Qua bảng số liệu 3.3 trên chúng tôi nhận thấy:
Ở nghiệm thức A0 (nghiệm thức đối chứng) tất cả mẫu nuôi cấy đều không phát sinh hình thái, sau 8 tuần theo dõi, các mẫu đều chết. Khi bổ sung kinetin vào môi trường nuôi cấy, có tác dụng kích thích mẫu phát sinh hình thái. Tất cả các nghiệm thức bổ sung kinetin vào môi trường nuôi cấy đều có tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái.
Khi bổ sung vào môi trường từ 1 - 5 mg/l kinetin, kết quả cho thấy tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái khi cho 1 - 2 mg/l kinetin tăng lên từ 30,83 - 63,33% và khi cho 3 - 5 mg/l kinetin thì tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái giảm dần. Trong đó, nghiệm thức A2 (bổ sung 2mg/l kinetin) cho tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái cao nhất là 63,33%.
Quan sát sự phát sinh hình thái của mẫu cấy, chúng tôi nhận thấy mẫu phát sinh hình thái theo hướng tạo chồi và tạo protocorm. Tất cả các mẫu tạo chồi đều có protocorm, một số ít mẫu chỉ có protocorm. Khi quan sát tỷ lệ mẫu vừa tạo chồi vừa tạo protocorm, chúng tôi nhận thấy kinetin có hiệu quả tốt trong việc kích thích mẫu tạo chồi khi bổ sung ở nồng độ thấp. Tỷ lệ tạo chồi cao nhất khi bổ sung kinetin 2
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ
mg/l, đạt 55,83%. Khi lần lượt tăng nồng độ kinetin lên 5 mg/l, tỷ lệ mẫu tạo chồi càng giảm, chỉ còn 39,17% ở nghiệm thức A5. Các chồi tạo thành hầu hết xanh, mập, chiều cao thấp. Cùng với hướng vừa tạo chồi và protocorm, có một số mẫu phát sinh theo hướng chỉ tạo protocorm.
Các nghiệm thức bổ sung kinetin, tỷ lệ mẫu phát sinh tạo protocorm dao động từ 5 - 8,33%. Protocorm tạo thành có màu xanh vàng, nhỏ, đường kính từ 1 - 1,5mm. Với mục tiêu nhân giống in vitro, chúng tôi chỉ quan tâm đến mục tiêu phát sinh tạo chồi của mô cấy. Trong thí nghiệm này, nghiệm thức A2 với nồng độ kinetin bổ sung 2 mg/l là công thức tối ưu nhất, với tỷ lệ mẫu tạo chồi cao nhất (55,83%).
Hình 3.1. Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 9g/l agar + 2mg/l kinetin
Thí nghiệm 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của BA lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy.
Sau khi tiến hành thí nghiệm 2.1, chúng tôi nhận thấy kinetin có khả năng kích thích mẫu phát sinh hình thái. Vì vậy, chúng tôi tiếp tục tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của một cytokinin khác đến khả năng phát sinh hình thái của mắt ngủ
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ
cây hoa Huệ Hương. BA là một cytokinin tổng hợp có tác dụng kích thích sự hình thành, sinh trưởng và phát triển của chồi.
Trong nuôi cấy mô tế bào, BA được sử dụng khá phổ biến và trong một số trường hợp BA còn là một chất không thể thay thế. Kết quả thí nghiệm sau 8 tuần được thể hiện ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ BA lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy sau 8 tuần nuôi cấy.
Nghiệm thức BA (mg/l)Nồng độ Tỷ lệ mẫu cảm ứng (%) Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) Tỷ lệ mẫu tạo protocorm (%) Hình thái mẫu tái sinh A0 0 0,00 0,00 0,00 - A1 1 38,33 18,33 20,00 Phần lớn chồi tạo thành mập, xanh, phát triển tốt. Protocorm có đường kính 1 - 2 mm, màu xanh. A2 2 55,83 32,50 23,33 A3 3 65,00 48,33 16,67 A4 4 73,33 66,67 6,67 A5 5 69,17 54,17 15,00 Ghi chú : (-) không có
Qua bảng số liệu 3.4 chúng tôi nhận thấy:
Bổ sung BA vào môi trường nuôi cấy có tác dụng kích thích mẫu phát sinh hình thái. Nghiệm thức A0 (không bổ sung BA), tất cả mẫu nuôi cấy đều không phát sinh hình thái, sau 8 tuần nuôi cấy thì mẫu chết. Khi bổ sung BA vào môi trường nuôi cấy, tất cả các nghiệm thức đều có mẫu phát sinh hình thái. Nồng độ BA bổ sung từ 1 - 5mg/l, trong đó, nghiệm thức có tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái cao nhất là 77,33% ở nghiệm thức A4 (bổ sung BA với nồng độ 4mg/l) và nghiệm thức có tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái thấp nhất là 38,33% ở nghiệm thức A1 (với nồng độ BA bổ sung là 1mg/l).
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ
Khi bổ sung BA vào môi trường, mẫu phát sinh hình thái theo hướng tạo protocorm và tạo chồi. Tất cả các nghiệm thức có bổ sung BA mẫu đều tạo protocorm và tạo chồi. Trong đó, phần lớn mẫu vừa tạo chồi đồng thời tạo protocorm, một số ít mẫu chỉ tạo protocorm. Ở tỷ lệ mẫu chỉ tạo protocorm riêng biệt, chúng tôi nhận thấy các protocorm tạo thành có màu xanh, hơi vàng, đường kính khoảng 1 - 2 mm.
Ở các nghiệm thức bổ sung BA, khi nồng độ BA tăng từ 1 - 4 mg/l, tỷ lệ mẫu tạo chồi tăng và đạt cao nhất 66,67% ở nghiệm thức A4 (bổ sung BA 4mg/l). Đây cũng là nghiệm thức có tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái cao nhất. Tuy nhiên khi tăng nồng độ BA lên 5mg/l thì tỷ lệ mẫu tạo chồi lại giảm xuống 54,17%, tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái cũng giảm còn 69,17%. Qua quan sát, chúng tôi nhận thấy chồi tạo thành phần lớn mập, xanh và phát triển tốt.
Như vậy, với mục đích tạo chồi là hướng chủ đạo. Chính vì vậy, trong thí nghiệm này tỷ lệ mẫu tạo chồi là chỉ tiêu quyết định để lựa chọn môi trường cho mẫu phát sinh hình thái phù hợp.
Từ những nhận định trên, chúng tôi nhận thấy rằng khi bổ sung nồng độ BA 4mg/l vào môi trường đem lại hiệu quả tốt, kích thích mẫu phát sinh theo hướng tạo chồi tốt hơn kinetin. Mặc dù ở nồng độ thấp, kinetin có hiệu quả cao nhưng nghiệm thức tối ưu khi bổ sung kinetin (2mg/l kinetin) thì tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái và mẫu tạo chồi thấp hơn hẳn so với nghiệm thức tối ưu khi bổ sung BA (4mg/l) vào môi trường nuôi cấy.
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.2. Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 9g/l agar + 4mg/l BA
Thí nghiệm 2.3. Khảo sát ảnh hưởng kết hợp của BA và các auxin khác nhau lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy.
Tùy vào tỷ lệ auxin/cytokinin khác nhau mà mẫu có những hướng phát sinh hình thái khác nhau. Vì vậy, tùy mục đích nghiên cứu có thể điều khiển sự phát sinh hình thái thông qua tỷ lệ giữa chất điều hòa sinh trưởng thuộc 2 nhóm auxin/cytokinin.
Từ các thí nghiệm trên, chúng tôi nhận thấy rằng khả năng kích thích mẫu phát sinh hình thái và tạo chồi trực tiếp của các cytokinin chưa thật sự cao. Chính vì thế, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp của cytokinin và các auxin đến khả năng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy. Thí nghiệm được tiến hành với 4 loại auxin kết hợp với BA nồng độ 4mg/l (là nghiệm thức tốt nhất ở thí nghiệm 2.2). Sau 8 tuần nuôi cấy, kết quả thí nghiệm được thể hiện ở bảng 3.5 dưới đây.
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ
Bảng 3.5. Ảnh hưởng kết hợp của BA và các auxin khác nhau lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy sau 8 tuần nuôi cấy.
Nghiệm thức Nồng độ BA (mg/l) Nồng độ auxin (mg/l) Tỷ lệ mẫu cảm ứng (%) Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) Tỷ lệ mẫu tạo protocorm (%) Hình thái mẫu tái sinh A0 4 0 68,33 65,83 2,50 Chồi mập, xanh, phát triển tốt. Protocorm màu xanh, có đường kính 2 - 2,5 mm. A1 4 0,25 α-NAA 88,33 80,83 7,50 A2 4 0,25 IAA 87,50 76,67 10,83 A3 4 0,25 IBA 76,67 59,17 17,50 A4 4 2,4D0,25 80,00 71,67 8,33
Từ kết quả bảng 3.5, chúng tôi nhận thấy:
Khi bổ sung các auxin vào môi trường nuôi cấy, sự kết hợp của auxin và cytokinin BA (nghiệm thức A1 đến A4) có tác động tích cực đến sự phát sinh hình thái của mẫu so với trường hợp chỉ có BA (nghiệm thức A0). Các nghiệm thức bổ sung auxin α-NAA, IAA, IBA, 2,4D đều có tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái, tỷ lệ mẫu tạo protocorm và tỷ lệ mẫu tạo chồi cao hơn nghiệm thức đối chứng (nghiệm thức A0).
Như vậy, việc bổ sung các loại auxin này vào môi trường làm tăng hiệu quả kích thích mẫu phát sinh hình thái. Tuy vậy, nghiệm thức bổ sung IBA mặc dù có tỷ lệ phát sinh hình thái cao hơn nghiệm thức A0 nhưng lại có tỷ lệ mẫu tạo chồi thấp hơn.
Trên môi trường MS cơ bản có 4mg/l BA, các nghiệm thức bổ sung các loại auxin khác nhau cho kết quả khác nhau. Điều đó chứng tỏ hiệu quả của các auxin khác nhau đối với việc kích thích mẫu phát sinh hình thái là khác nhau. Tất cả các nghiệm thức bổ sung auxin đều có tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái cao hơn nghiệm thức A0 (không bổ sung auxin). Trong các loại auxin bổ sung vào môi trường nuôi
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ
cấy thì nghiệm thức bổ sung 0,25mg/l α-NAA có tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái cao nhất 88,33%, trong khi đó, bổ sung 0,25mg/l IBA lại cho kết quả thấp, tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái ở nghiệm thức này chỉ đạt 76,67%.
Các nghiệm thức bổ sung auxin đều có một số ít mẫu phát sinh theo hướng tạo rễ tuy vậy, rễ tạo thành rất ít, ngắn và yếu.
Qua quan sát, chúng tôi nhận thấy các chồi tái sinh ở các nghiệm thức này có hình thái tốt, xanh mập, cao chồi đều cao hơn so với chồi ở nghiệm thức đối chứng. Trong khi đó, bổ sung thêm 0,25mg/l IBA (nghiệm thức A3) mặc dù có tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái cao hơn nghiệm thức đối chứng (nghiệm thức A0) nhưng tỷ lệ mẫu tạo chồi lại thấp hơn (59,17%).
38
Hình 3.3. Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 9g/l
agar + 0,25mg/l IBA + 4mg/l BA
Hình 3.4. Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 9g/l
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ
Qua thí nghiệm này, với mục tiêu của nhân giống in vitro, chúng tôi nhận định rằng: việc kết hợp 4mg/l BA + 0,25mg/l α-NAA (nghiệm thức A1) có ảnh hưởng tốt đến sự phát sinh hình thái của mẫu cấy với tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái là 83,33%, tỷ lệ mẫu tạo protocorm là 7,5%, tỷ lệ mẫu tạo chồi đồng thời tạo protocorm là 80,83%.
39
Hình 3.6. Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza
+ 9g/l agar + 0,25mg/l IAA + 4mg/l BA
Hình 3.5. Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 9g/l
agar + 0,25mg/l α-NAA + 4mg/l BA
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});