Nghiên cứu so sánh một số phương pháp phát hiện tác nhân gây bệnh than bacillus anthracis

Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ VIỆN HÀN LÂM KH&CN VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT -*** - LUẬN VĂN CAO HỌC Mã số chuyên ngành: 60420103 Đề tài: số nhân gây bệnh than Bacillus anthracis Học viên: Lƣu Anh Tú Lớp: CHST _ K15 Hƣớng dẫn: PGS.TS Ngô Đình Bính Hà Nội, 2013 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Lời cảm ơn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Ngô Đình Bính người thầy hướng cho ý tưởng khoa học, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho hoàn thành luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn phòng tập thể phòng Di truyền Vi sinh vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện cho hoàn thành khóa học luận án Tôi xin cảm ơn tất thầy cô giáo Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam chia sẻ, động viên, giúp vượt qua khó khăn để hoàn thành tốt công việc nghiên cứu Cuối cùng, xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình bè bạn, người bên tôi, động viên, góp ý tạo điều kiện tốt cho suốt thời gian học tập nghiên cứu Tác giả Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Lời cam đoan Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu số kết cộng tác với đồng khác Các số liệu kết trình bày luận văn trung thực Hà Nội, ngày tháng Tác giả năm 2013 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ATP Acid Adenozin Triphosphate B anthracis/ Ba Bacillus anthracis bp base pair CA Casamino Acid dH2O deion water DNA Deoxyribonucleic Acid dNTP Deoxyribonucleotide Triphosphate EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid EF Edema Factor FAO Food Agricultural Organisation h kDa Kilo Dalton LB Lauria Betani LF Lethal Factor MPA Meat Pepton Agar MPB Meat Pepton Broth ORF Open Reading Frame PA Protective Antigen PCR Polymerase Chains Reaction SDS Sodium Dodecylsulphate TAE Tris – Acetate EDTA Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ĐẶT VẤN ĐỀ Vi khuẩn Bacillus anthracis gây bệnh than sử dụng vũ khí sinh học nguy hiểm lịch sử chiến tranh Đặc biệt năm gần chủng vi khuẩn gây bệnh than cải biến gen sử dụng khủng bố sinh học gây hoảng loạn cộng đồng dân cư giới Vì việc phát nhanh, xác vi khuẩn gây bệnh than cần thiết cấp bách, giúp cho bác sĩ nhà dịch tễ học có biện pháp ứng phó kịp thời, hạn chế thương vong lây lan dịch bệnh Các phương pháp truyền thống dựa việc phân lập xác định đặc điểm hình thái, tính chất nuôi cấy, đặc tính sinh lý, sinh hóa chủng đòi hỏi tốn thời gian dễ xảy nhầm lẫn dẫn đến tình trạng nhiều thời gian để phát người bệnh bị nhiễm bệnh than Ngoài ra, Việt Nam chưa có biện pháp đánh giá mức độ sản sinh kháng thể kháng bệnh than người động vật Dựa kết nghiên cứu trước việc phát nhanh tác nhân gây bệnh than kĩ thuật sinh học phân tử việc tách dòng biểu gen mã hóa kháng nguyên bảo vệ PA, thực đề tài “ Bacillus anthracis” dựa nguyên lý miễn dịch học Các phương pháp nhằm khắc phục hạn chế phương pháp trước đồng thời cung cấp thêm công cụ việc đánh giá tình trạng nhiễm bệnh than Mục tiêu nghiên cứu ệnh than Bacillus anthracis Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu biểu gen pagA Escherichia coli BL21 Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch protein PA tái tổ hợp động vật thí nghiệm Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Thu nhận huyết thỏ thí nghiệm kiểm tra khả đáp ứng miễn dịch phương pháp Western Blot Nghiên cứu chế tạo kit ELISA phát vi khuẩn Ba tác nhân gây bệnh than Xây dựng Kit ELISA phát tác nhân gây bệnh than vi khuẩn Ba Thử nghiệm Kit ELISA với huyết bệnh nhân Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh than dạng bệnh than Bệnh than thường xuất loài động vật hoang dã động vật nuôi, đặc biệt loại gia súc ăn cỏ trâu, bò, cừu, ngựa, dê… chúng hít phải nhiễm phải bào tử than đất Ở người, nguy mắc bệnh than tiếp xúc với động vật ăn cỏ Các loài khác bò sát, lưỡng cư bị nhiễm bệnh than mức độ khác [24] Bệnh than nhiễm vào thể vật chủ theo ba đường: qua da, qua đường tiêu hoá đường hô hấp Bệnh biến chứng thành thể than màng não hít vào bào tử than Tuỳ theo cách thức lây nhiễm mà người ta chia bệnh than thành thể than khác nhau: than da, than tiêu hoá, than hô hấp, than màng não [32] 1.1.1 Bệnh than thể da Đây hình thức phổ biến chiếm 95 % loại bệnh có khả điều trị Bệnh thường gặp nhóm đối tượng có nguy lây nhiễm cao, thường xuyên tiếp xúc với động vật sản phẩm từ gia súc bị nhiễm VK than, thường người nông dân, bác sĩ thú y, người giết mổ gia súc, người buôn bán gia súc hay thịt, … Từ vết thương hở da, vi khuẩn hay bào tử B anthracis xâm nhập vào (Hình 1.1) Triệu chứng bệnh: Sau - ngày đầu thấy xuất vết sẩn ngứa côn trùng đốt, xuất dấu hiệu hoại tử vùng tâm Sau 2- ngày xuất mụn nhỏ hay nốt nhú vị trí nhiễm, xung quanh xuất mụn nước Vài ngày sau vùng trung tâm vết loét xuất nốt đen, khô bắt đầu bong vẩy Trong khoảng 1-2 tuần kể từ nhiễm bệnh xuất mủ tượng đau nhức, mệt mỏi, sốt, bạch cầu tăng, hạch bạch huyết tăng lên Sau vùng thương tổn chuyển sang dạng tự phát Nếu bệnh nặng thêm vết loét lan rộng ăn sâu làm nhiễm trùng máu dẫn đến Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ chữa khỏi Than da gây tử vong khoảng 20 % trường hợp không điều trị [36] Hình 1.1 Bệnh than thể da 1.1.2 Bệnh than thể tiêu hoá Nguyên nhân bệnh than tiêu hoá ăn phải thịt gia súc bị nhiễm bào tử than mà không nấu chín, chí nấu chín khả gây bệnh cao Người ta tìm thấy vi khuẩn than dịch ruột bệnh nhân mắc bệnh than Đầu tiên vi khuẩn công vào vị Hình 1.2 Manh tràng bệnh nhân trí thương tổn màng nhày ruột nhiễm than đường tiêu hóa dày Từ vị trí xuất vết loét, lan rộng lan vào hệ bạch huyết Bệnh than tiêu hoá thường gặp lại có tỉ lệ tử vong cao Bệnh thường có hai thể lâm sàng [8, 32, 36] (Hình 1.2): Thể bụng: dấu hiệu dễ nhận biết có thương tổn xuất huyết hoại tử manh tràng vùng lân cận Triệu chứng ban đầu không đặc biệt với cảm giác buồn nôn, biếng ăn, sốt Sau triệu chứng đau bụng, tiêu chảy, sốc nhiễm trùng tử vong Bệnh nhân viêm phúc mạc viêm lách vi khuẩn công vào khu hạch bạch huyết Sau 2-5 ngày kể từ xuất dấu hiệu bệnh gây tử vong Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Thể họng, miệng: vùng thương tổn thấy xuất huyết hoại tử vùng vòm họng, cổ họng cứng, sưng amidan Bệnh nhân sốt cao, khó nuốt, hạch vùng cổ sưng to, nhiễm độc máu đa số dẫn đến tử vong Dạng than có tỉ lệ tử vong cao chiếm 50 % có điều trị 1.1.3 Bệnh than hô hấp Nguyên nhân gây than hô hấp hít phải bào tử than Sau vào thể, bào tử than phát triển thành thể hoạt động di chuyển tới phế nang, hạch lympho phổi trung thất gây xuất huyết hoại tử phù thũng, làm trung thất giãn rộng hai bên làm bệnh nhân có cảm giác đau vùng ức, sốt cao Các thương tổn xuất huyết hoại tử lan đến màng phổi gây tràn máu màng phổi Khí quản bị ảnh hưởng với triệu chứng ho khan, co thắt, vùng phổi bị phù Vi khuẩn theo đường máu lan đến phần niêm mạc ống tiêu hoá tạo nên vết loét thành ruột làm bệnh nhân nôn máu, tiêu hoá ta máu hai triệu chứng Một số nang lympho đường tiêu hoá bị phù xung huyết, bệnh nặng biến chứng sang thể màng não gây xuất huyết Đa số bệnh nhân tử vong khoảng - ngày kể từ phát bệnh Tỉ lệ tử vong thể than cao [61,76] (Hình 1.3) Hình 1.3 Phổi (1) trung thất (2) khỉ nhiễm than đường hô hấp 1.1.4 Bệnh than thể màng não Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Bệnh thường biến chứng từ ba thể than Than màng não xuất vi khuẩn B anthracis công vào hệ thống thần kinh trung ương theo đường máu mạch bạch huyết Triệu chứng bệnh thường sốt cao, mệt mỏi, đau cơ, đau đầu, buồn nôn, lên mê sảng phát bệnh dẫn đến hôn mê Đa số bệnh thường dẫn đến tử vong sau 1-2 ngày kể từ mắc bệnh Thể than có tỉ lệ tử vong cao [32, 36] (Hình 1.4) Hình 1.4 Não khỉ nhiễm than thể màng não 1.2 Tác nhân gây bệnh than 1.2.1 Đặc điểm vi khuẩn than (Bacillus anthracis) Vi khuẩn B anthracis thuộc nhóm I, chi Bacillus Nó tồn đất, nước không khí Vi khuẩn B anthracis vi khuẩn gram dương, sinh bào tử (trong điều kiện kị khí hay kị khí bắt buộc), lông roi nên khả di động Kích thước tế bào 3-5 μm, rộng 1-2 μm Tế bào hình que, vuông đầu, xếp với thành chuỗi dài sợi rơm vài tế bào nối với [21, 32] (Hình 1.5) Bào tử B anthracis có hình elip, nằm trung tâm tế bào, nang bào tử không phồng Kích thước khoảng 1-1,5 µm Bào tử hình thành vào thời kì cuối pha sinh trưởng logarit [18] (Hình 1.5) Khuẩn lạc B anthracis có màu trắng sữa trắng xám tới xám, bề mặt sần sùi, dính ướt, đường kính 3-5 mm [4] Điều kiện thích hợp cho B anthracis phát triển điều kiện nhiệt độ 2832oC, pH = 7, thời gian nuôi cấy 3-5 ngày Khi gặp điều kiện bất lợi, tế bào sinh dưỡng hình thành nội bào tử 10 Số hóa Trung tâm Học liệu Hình 3.15 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ , Bme 0,001% ly , sinh enzyme leucithinase môi trường MYP, khả sinh gelatinase, khả kháng 7% NaCl… Dưới bảng tổng hợp kết nghiên cứu sinh lý sinh hóa: Bảng 3.2 Đặc tính sinh lý sinh hóa chủng nhóm Bacillus cereus Tên chủng Đặc điểm A B C D E F G H I Ba VCM1167 - + - + + + + + + Bc + + - + + + + - + Bme + - + + - + - + - Bmi + + - + + + + - + Bt + + - + +/- + + - + ĐC - - - - - - manitol; ; H 0,001% lysozyme , sinh hoá vi khuẩn B Anthracis vi khuẩn khác nhóm Bacillus cereus B anthracis chi Bacillus 3.5.2 Nghiện cứu phát vi khuẩn Ba phƣơng pháp PCR B anthracis B anthracis 57 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ pagA , Bc, Bme, Bmi, Bt Ba 3.15: 61 5 700 596 500 A 3.16 pagA gel % agarose : Ba VCM1167, Bc, Bme, Bmi, Bt, marker 3.16 Ba , vi khuẩn Ba phát phương pháp PCR thông qua phát gen mã hóa kháng nguyên bảo vệ PA sử dụng cặp mồi đặc hiệu PA5 PA8 3.5.3 Phát kháng thể kháng bệnh than huyết bệnh nhân phản ứng Dot blot ELISA Dựa kết nghiên cứu protein tái tổ hợp PA, sử dụng protein để phát kháng thể kháng bệnh than huyết bệnh nhân Dot blot ELISA làm sở cho việc tạo kit chẩn đoán bệnh nhân nghi nhiễm bệnh than 58 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ */ phát tác nhân gây bệnh than huyết bệnh nhân theo phƣơng pháp Dot blot Từ mẫu huyết bệnh nhân nghi nhiễm bệnh than mẫu huyết thỏ đặc hiệu kháng PA phòng Di truyền vi sinh vật – Viện Công nghệ sinh học – Viện hàn lâm KH&CN Việt Nam cung cấp Các mẫu phủ lên màng PVDF thực phản ứng Dot blot Kết thu sau (hình 3.16) Hình 3.17 Phản ứng Dot blot phát kháng thể kháng bệnh than huyết bệnh nhân 1, 2, 4, 5, 6: Các mẫu huyết dương tính 3: Mẫu huyết âm tính 7: Huyết thỏ đặc hiệu kháng PA 8: Huyết nhiên PAvới mẫu huyết bệnh nhân cho Kết phản thỏ ứngtự Dot blot kháng thu thấy có mẫu huyết cho kết dương tính có mẫu huyết bệnh nhân số cho kết âm tính Tuy nhiên, kết dương tính có mức độ đậm nhạt khác Điều cho thấy lượng kháng thể kháng bệnh than tự nhiên huyết bệnh nhân khác */ phát tác nhân gây bệnh than huyết bệnh nhân phƣơng pháp ELISA Tương tự phương pháp Dot blot, sử dụng phương pháp ELISA gắn trực tiếp kháng nguyên PA tái tổ hợp lên sử dựng mẫu huyết bệnh nhân dương tính âm tính phản ứng Dot blot làm kháng thể (KT1) phản ứng ELISA Kết phản ứng ELISA đo bước sóng OD450 thu sau (bảng 3.3, hình 3.18): Bảng 3.3 Kết đo OD450 mẫu nghiên cứu 59 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Mẫu OD450 trung bình Kết ĐC1 ĐC2 0,060 0,065 0,155 0,349 0,113 0,163 0,177 0,152 (-) (-) (+) (+) (-) (+) (+) (+) Hình 3.18 Phản ứng ELISA phát kháng thể kháng bệnh than huyết bệnh nhân A: ĐC1 (KT1(-), KT2(-)) B: ĐC2 (KT1(-), KT2(+)) C-H: Mẫu 1-6 Từ kết nhận thấy xuất phản ứng âm tính mẫu huyết bệnh nhân số Kết hoàn toàn phù hợp với kết phương pháp Dot blot Như vậy, protein tái tổ hợp PA có khả sử dụng làm nguyên liệu cho kit chẩn đoán phát bệnh than 3.6 Chế tạo sinh phẩm (kit) phát nhanh kháng thể kháng bệnh than huyết bệnh nhân kĩ thuật Dot blot Qui trình tạo kit Dot blot Lấy màng PVDF ngâm methanol 100% khoảng phút Rửa màng blotting buffer 1X Loại bỏ dịch để khô 60 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Nhỏ protein tái tổ hợp PA lên màng thành chấm nhỏ (200ng/μl) Để khô nhiệt độ phòng cho màng vào ống chứa ml dung dịch skim milk 5% Giữ màng 4oC Rửa màng lần TTBS 1X Rửa màng lần TBS 1X Làm khô bảo quản màng 4oC Thành phần kit (50 phản ứng) 50 ống đựng màng PVDF nhỏ protein tái tổ hợp PA Skim mik 10%: 30 ml TTBS 10X: 100 ml TBS 10X: 50 ml Dung dịch màu A: 25 ml (25 ml Methanol + 750 mg HRP) Dung dịch màu B: 135 ml (135 ml TBS 1X + 750 μl 30% H2O2 Kháng thể (Kháng thể chuột kháng kháng thể người gắn enzyme HRP: 20 μl 3.7 Chế tạo kit phát tác nhân gây bệnh than Thành phần kit (50 phản ứng) 50 ống đựng màng PVDF xử lý để khô Skim mik 10%: 50 ml TTBS 10X: 100 ml TBS 10X: 50 ml Dung dịch màu A: 25 ml (25 ml Methanol + 750 mg HRP) Dung dịch màu B: 135 ml (135 ml TBS 1X + 750 μl 30% H2O2 Kháng thể ( Kháng thể kháng kháng nguyên bảo vệ tái tổ hợp PA): 4,5 ml Kháng thể (Kháng thể chuột kháng kháng thể người gắn enzyme HRP: 20 μl Qui trình sử dụng kit Nuôi cấy dòng khuẩn lạc nghi Bacillus anthracis 250ml môi trường với thành phần sau (mg/l): L-tryptophan 35; glycine 65; L-cystein 61 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 25; L-tyrosine 144; L-lysine 230; L-valine 173; L-leucine 230; L-isoleucine 170; L-threonine 120; L-methionine 73; L-aspartic 184; L-glutamate Na 612; Lproline 43; L-histidine-hydrochloride 55; L-arginine-hydrochloride 125; Lphenylalanine 125; L-serine 135; thiamine-hydrochloride 1,0; glucose 2500; CaCl2.2H2O 7,4; MgSO4.H2O 9,9; MnSO4.H2O 0,9; K2HPO4 8000; uracil 1,4; adenine sulfate 2,1; pH=8,0 (Chỉnh pH NaOH 5N) Li tâm dịch nuôi cô đặc 20 lần Nhỏ dịch lên màng thành chấm nhỏ có đường kính 0,3-0,5cm Làm khô, bổ sung ml skim milk 5% giữ 4oC 2h Rửa màng PVDF TTBS 1X lần Rửa màng PVDF TBS 1X lần Bổ sung kháng thể pha loãng 1000 lần skim milk 1% (3μl 3ml skim milk) Lắc nhiệt độ phòng 2h Rửa màng PVDF TTBS 1X lần Rửa màng PVDF TBS 1X lần 10 Bổ sung kháng thể pha loãng 10000 lần skim milk 1% 11 Lắc nhiệt độ phòng 2h 12 Rửa màng TTBS 1X lần 13 Rửa màng TTBS 1X lần 14 Bổ sung 3ml dung dịch chất màu (0,5ml chất màu A + 2,5 ml chất màu B) 15 Để nhiệt độ phòng phút sau đọc kết 3.8 Đánh giá hiệu sử dụng kit Dot ELISA phát tác nhân gây bệnh than Bacillus anthracis Các chủng Bacillus anthracis Sterne, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus subtilis, Bacillus mycoides nuôi cấy môi trường với thành phần sau (mg/l): L-tryptophan 35; glycine 65; L-cystein 25; L-tyrosine 144; L-lysine 230; L-valine 173; L-leucine 230; L-isoleucine 170; L-threonine 120; L-methionine 73; L-aspartic 184; L-glutamate Na 612; L-proline 43; L62 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ histidine-hydrochloride 55; L-arginine-hydrochloride 125; L-phenylalanine 125; L-serine 135; thiamine-hydrochloride 1,0; glucose 2500; CaCl2.2H2O 7,4; MgSO4.H2O 9,9; MnSO4.H2O 0,9; K2HPO4 8000; uracil 1,4; adenine sulfate 2,1; pH=8,0 (Chỉnh pH NaOH 5N) Trong môi trường này, Bacillus anthracis sản sinh protein kháng nguyên bảo vệ PA Protein kháng nguyên bảo vệ PA phản ứng với kháng thể đặc hiệu kháng PA tạo phản ứng dương tính Sau 24 h nuôi cấy, đun sôi dịch nuôi 20 phút để phá tế bào, li tâm dịch nuôi cô đặc 20 lần Nhỏ dịch lên màng thành chấm nhỏ có đường kính 0,3-0,5 cm Các bước làm tương tự kĩ thuật Dot blot Kháng thể thu nhận gây miễn dịch cho thỏ kháng nguyên tái tổ hợp PA Kết cho thấy kháng thể kháng PA phát tác nhân gây bệnh than Bacillus anthracis (Hình 3.19) Điều cho thấy ưu điểm phương pháp ELISA hẳn so với phương pháp phát Bacillus anthracis phương pháp truyền thống dựa đặc điểm hình thái, tính chất nuôi cấy đặc tính sinh lý, sinh hóa tốn thời gian không đặc hiệu Kết minh họa hình sau: Hình 3.19 Phản ứng Dot ELISA phát tác nhân gây bệnh than Bacillus anthracis 1-5: Bacillus anthracis Sterne 34F2, Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Bacillus mycoides, Bacillus thuringiensis */So sánh phƣơng pháp nghiên cứu: * phát vi khuẩn Ba dựa đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa Ưu điểm: đơn giản, thực phòng thí nghiệm vi sinh vật thông thường Nhược điểm: nhiều thời gian, độ tin cậy không cao 63 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ * phát vi khuẩn Ba dựa vào sinh học phân tử (từ chủng phân lập phương pháp PCR) , huyết bệnh nhân theo phương pháp Dot blot, Dot ELISA Ưu điểm: Thời gian tiến hành nhanh, kết tương đối xác, độ đặc hiệu cao Nhược điểm: Kỹ thuật phải thực phòng thí nghiệm trang bị tốt, phải đầu tư nhân lực kỹ thuật KẾT LUẬN Đã biểu gen pagA mã hóa protein kháng nguyên bảo vệ PA E coli BL21 64 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Đã thu nhận kháng thể đặc hiệu kháng kháng nguyên bảo vệ PA tái tổ hợp thỏ Hiệu giá kháng thể thu 1/9600 Đã kiểm tra khả phản ứng protein tái tổ hợp PA kháng thể tự nhiên kháng bệnh than phản ứng Western blot Protein tái tổ hợp có phản ứng đặc hiệu kháng nguyên vi khuẩn tự nhiên Đã chế tạo sinh phẩm (kit) phát nhanh kháng thể kháng bệnh than huyết bệnh nhân kĩ thuật Dot blot đưa qui trình sử dụng kit Đã sử dụng protein tái tổ hợp PA phát kháng thể kháng bệnh than từ mẫu huyết bệnh nhân Dot blot ELISA Kết cho thấy mẫu cho kết dương tính, độ đặc hiệu đạt 100% Đã chế tạo kit phát tác nhân gây bệnh than Bacillus anthracis đưa qui trình sử dụng kit Đã so sánh hiệu phương pháp phát tác nhân gây bệnh than theo phương pháp sinh lý, sinh hóa, PCR phát gen pagA, Dot blot ELISA TÀI LIỆU THAM KHẢO Ngô Đình Bính, Nguyễn Xuân Cảnh, Nguyễn Thị Ánh Nguyệt, Hoàng Ngọc Hiển, Nguyễn Thái Sơn, Lê Thu Hồng (2004), “Phân lập phân loại vi 65 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ khuẩn Bacillus anthracis từ bệnh nhân mắc bệnh than Việt Nam”, Kỷ yếu hội nghị vấn đề khoa học sống, định hướng sinh-y học, NXB KHKT, Hà Nội, 42-45 Ngô Đình Bính, Nguyễn Thị Ánh Nguyệt, Nguyễn Quang Huy, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Xuân Cảnh, Phạm Minh Hƣơng, Trịnh Thị Ngọt, Hoàng Đạo Phấn, Nguyễn Thị Ngọc Dao, Đỗ Ngọc Khuê (2003), “Phát vi khuẩn gây bệnh than Bacillus anthracis phương pháp sinh học phân tử, Kỷ yếu hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc lần thứ 2, NXB KHKT, Hà Nội, 150-154 Phạm Kiều Thúy, Nguyễn Thị Ánh Nguyệt, Nguyễn Đình Tuấn, Nguyễn Đăng Tôn, Nông Văn Hải, Ngô Đình Bính (2006), “Tách dòng đọc trình tự gen pagA mã hóa kháng nguyên bảo vệ PA từ chủng Bacillus anthracis VCM1167”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 4(4), 447-454 Ash C, Farrow JA, Dorsch M, Stackebrandt E, Collin MD (1999), “Comparative analysis of Bacillus anthracis, Bacillus cereus, and relate species on the basic of reverse transcriptase sequencing of 16S rRNA”, Int J Syst Bacteriol, 41(3), 343 –346 Bartkus JM, Leppla SH (1989), “Transcriptional regulation of the protective antigen gene of Bacillus anthracis”, Infect Immun, 57(8), 2295-2300 Beveridge TJ, Graham LL (1991), “Surface layers of bacteria”, Microbiol Rev, 55(4), 684-705 Brossier F, Weber-Levy M, Mock M, Sirard JC (2000), “Role of toxin functional domains in anthrax pathogenesis”, Infect Immun 68(4), 1781-1786 Escuyer V, Collier RJ (1991), “Anthrax protective antigen interacts with a specific receptor on the surface of CHO-K1 cells”, Infect Immun, 59(10), 33813386 Ezzell J, Abshire T (1998), “Immunological analysis of cell-mediated antigens of Bacillus anthracis”, Infect Immun, 56, 349-356 10 Foster SJ, Johnstone K (1990), “Pulling the trigger: the mechanism of bacterial spore germination”, Mol Microbiol, 4(1), 137-141 66 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Fouet A, Mock M (1996), “Differential influence of the two Bacillus 11 anthracis plasmids on regulation of virulence gene expression”, Infect Immun, 64(12), 4928-4932 12 Green BD, Battisti L, Koehler TM, Thorne CB, Ivins BE (1985), “Demonstration of a capsule plasmid in Bacillus anthracis”, Infect immun, 49(2), 291-297 13 Greenberg S, El Khoury J, Di Virgilio F, Kaplan EM, Silverstein SC (1991), “Ca2+ independent F-actin assembly and disassembly during Fc receptormediated phagocytosis in mouse macrophages”, J Cell Biol, 113(4), 757-767 14 Grunow R, Porsch-Ozcürümez M, Splettstoesser W, Buckendahl A, Hahn U, Beyer W, Böhm R, Huber M, vd Esche U, Bessler W, Frangoulidis D, Finke EJ (2007), “Monitoring of ELISA-reactive antibodies against anthrax protective antigen (PA), lethal factor (LF), and toxin-neutralising antibodies in serum of individuals vaccinated against anthrax with the PA-based UK anthrax vaccine”, Vaccine, 25(18), 3679-3683 Guidi RC, Weber LM, Labruyere E, Mock M (1999), “Germination of 15 Bacillus anthracis spore within alveolar macrophages”, Mol Microbiol, 31(1), 917 16 Gupta P, Waheed SM, Bhatnagar R (1999), “Expression of the protective antigen of Bacillus anthracis”, Pro Expr Purif 16(3), 369-376 17 Halvorson HO (1997), “Two generations of spore research: from father to son”, Microbiologia, 13(2), 131-48 18 Hoffmaster AR, Koehler TM (1999), “Autogenous regulation of the Bacillus anthracis pag operon”, J Bacteriol, 181[15], 4485-4492 19 Hoffmaster AR, Koehler TM (1997), “The anthrax toxin activator gene atxA is associated with CO2-enhanced non-toxin gene expression in Bacillus anthracis”, Infect Immun, 65(8), 3091-3099 20 Iacono LCC, Schmaljohn CS, Dalrymple JM (1990), “Expression of the Bacillus anthracis protective antigen gene by Baculovirus and Vaccinia virus recombinants”, Infect and Immun, 58(2), 366-372 67 Số hóa Trung tâm Học liệu 21 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Kathryn BG (1999), “Anthrax (Bacillus anthracis), Molecular Biology of, Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, 308-327 22 Klimpel KR, Molloy SS, Thomas G, Leppla SH (1992), “Anthrax toxin protective antigen activated by a cell surface protease with the sequence specificity and catalytic properties of furin”, Proc Natl Acad Sci USA, 89(21), 10277-10281 23 Kobiler D, Gozes Y, Rosenberg H, Marcus D, Reuveny S, Altboum Z (2002), “Efficiency of protection of guinea pigs against infection with Bacillus anthracis spores by passive immunization”, Infect Immun, 70(2), 544-560 24 Koehler TM (2002), “Anthrax”, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany 25 Koehler TM, Dai Z, Kaufman-Yarbray M (1994), “Regulation of the Bacillus anthracis protective antigen gene: CO2 and a trans-acting element activate transcription from one of two promoters”, J Bacteriol, 176(3), 586-955 26 Labruyere E, Mock M, Surewicz WK, Mantsch HH, Rose T, Munier H, Sarfati RS, Barzu O (1991), “Structural and ligand-binding properties of a truncated form of Bacillus anthracis adenylate cyclase and of a catalytically inactive variant in which glutamine substitutes for lysine-346”, Biochem, 30(10), 2619-2624 27 Labruyère E, Mock M, Ladant D, Michelson S, Gilles AM, Laoide B, Bârzu O (1990), “Characterization of ATP and calmodulin-binding properties of a truncated form of Bacillus anthracis adenylate cyclase”, Biochemistry, 29[20], 4922-4928 28 Leppla S, Moss J, Iglewski B, Vaughan M, Tu AT (1995), “Anthrax toxin In Bacterial toxins and virulence factors in diease”, New York/ Hong Kong: Basel, 8, 543-572 29 Leppla SH (1982), “Anthrax toxin edema factor: a bacterial adenylate cyclase that increases cyclic AMP concentrations of eukaryotic cells”, Proc Natl Acad Sci USA, 79(10), 3162 - 3166 68 Số hóa Trung tâm Học liệu 30 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Lindeque PM, Turnbull PC (1994), “Ecology and epidemiology of anthrax in Estosha National park, Namibia”, Onderstepoort J Vet Res, 61, 71-83 31 Milne JC, Furlong D, Hanna PC, Wall JS, Collier RJ (1994), “Anthrax protective antigen forms oligomers during intoxication of mammalian cells”, J Biol Chem, 269(32), 20607-20612 32 Mock M, Fouet A (2001), “Anthrax”, Annu Rev Microbiol, 55: 647-671 33 Mogridge J, Mourez M, Collier RJ (2000), “Involvement of domain in oligomerization by the protective antigen moiety of anthrax toxin”, J Bacteriol 183(6), 2111-2116 34 Munier H, Blanco FJ, Prêcheur B, Diesis E, Nieto JL, Craescu CT, Bârzu O (1993), “Characterization of a synthetic calmodulin-binding peptide derived from Bacillus anthracis adenylate cyclase”, J Biol Chem, 268(3), 16951701 35 Noskov AN, Kravchenko TB, Noskova VP (1996), “Detection of the functionally active domains in the molecule of protective antigen of the anthrax exotoxin”, Mol Gen Mikrobiol Virusol, 3, 16-20 36 OIE (2000) Chapter 2.21 Anthrax In Manual of Standards Diagnostic Test and Vaccines, Office International des epizooties, Paris 37 Okinaka RT, Cloud K, Hampton O, Hoffmaster AR, Hill KK, Keim P, Koehler TM, Lamke G, Kumano S, Mahillon J, Manter D, Martinez Y, Ricke D, Svensson R, Jackson PJ (1999), “Sequence and organization of pXO1, the large Bacillus anthracis plasmid harboring the anthrax toxin genes”, J Bacteriol, 181[20], 6509-6515 38 Petosa C, Collier RJ, Klimpel KR, Leppla SH, Liddington RC (1997), “Crystal structure of the anthrax toxin protective antigen”, Nature, 385(6619), 833-838 39 Price LB, Jones MH, Jackson PJ, Keimp (1999), “Genetic diversity in gene of Bacillus anthacis”, 181(8), 2358-2362 40 Quinn CP, Dull PM, Semenova V, Li H, Crotty S, Taylor TH, StewardClark E, Stamey KL, Schmidt DS, Stinson KW, Freeman AE, Elie CM, 69 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Martin SK, Greene C, Aubert RD, Glidewell J, Perkins BA, Ahmed R, Stephens DS (2004), “Immune responses to Bacillus anthracis protective antigen in patients with bioterrorism-related cutaneous or inhalation anthrax”, J Infect Dis 190(7), 1228-1236 41 Quinn CP et al., (2002), “Speicific, sensitive, and quantative enzyme-linked immunosorbent assay for Human immunoglobulin G antibodies to anthrax toxin protective antigen”, Emer Infect Dise, 8(10), 1103-1110 42 Quinn CP, Singh Y, Klimpel KR, Leppla SH (1991), “Functional mapping of anthrax toxin lethal factor by in-frame insertion mutagenesis”, J Biol Chem, 266(30), 29124-20130 43 Russell AD (1990) “Bacterial spores and chemical sporicidal agents”, Clin Microbiol Rev, 3(2), 99-119 44 Shen Y, Guo Q, Zhukovskaya NL, Drum CL, Bohm A, Tang WJ (2004), “Structure of anthrax edema factor-calmodulin-adenosine 5'-(alpha,betamethylene)-triphosphate complex reveals an alternative mode of ATP binding to the catalytic site”, Biochem Biophys Res Commun, 317(2), 309-314 45 Sirard JC, Mock M Fouet A (1994), “The three Bacillus anthracis toxin genes are coordinately regulated by bicarbonate and temperature”, J Bacteriol, 196, 5188-5192 46 Stephen J (1986), “Anthrax toxin”, In: Dorner F Drews J (eds) Pharmaclogy of bacterial toxins, Pergamon Press, Oxford, 501-513 47 Stephen J (1981), “Anthrax toxin”, In: Dorner F Drews J (eds) Anthrax toxin Pergamon Press, Oxford, 501-513 48 Turnbull P (1991), “Anthrax vaccines: past, present and future” Vaccine, 9(8), 533-539 49 Uchida I, Makino S, Sekizaki T, Terakado N (1997), “Cross-talk to the genes for Bacillus anthracis capsule synthesis by atxA, the gene encoding the trans-activator of anthrax toxin synthesis”, Mol Microbiol, 23(6), 1229-1240 70 Số hóa Trung tâm Học liệu 50 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Vietri NJ, Marrero R, Hoover TA, Welkos SL (1995), “Identification and characterization of a trans-activator involved in the regulation of encapsulation by Bacillus anthracis”, Gene, 152(1), 1-9 51 Welkos SL, Lowe JR, Eden-McCutchan F, Vodkin M, Leppla SH, Schmidt JJ (1988), “Sequence and analysis of DNA encoding protective antigen of Bacillus anthracis”, Gene, 69(2), 287-300 71 [...]... phát hiện gen mã hóa kháng nguyên bảo vệ PA của vi khuẩn B anthracis [1,2] Trên cơ sở những nghiên cứu này và những nghiên cứu về tách dòng [3] và biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bảo vệ PA của vi khuẩn B anthracis (Đề tài cấp cơ sở 2006), chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài này nhằm hoàn thiện phương pháp chẩn đoán bệnh than và tác nhân gây bệnh than B anthracis tại Việt Nam trong tương lai 29 Số. .. hoàn thiện phương pháp ELISA để phát hiện kháng thể kháng bệnh than trong huyết thanh bệnh nhân với nguyên liệu là protein tái tổ hợp PA Các nghiên cứu có thể sử dụng mô hình ELISA khác nhau song lại sử dụng nguồn nguyên liệu là protein tái tổ hợp PA và nguyên tắc phản ứng là sự liên kết kháng nguyên, kháng thể Phản ứng ELISA đã được sử dụng để phát hiện kháng thể kháng bệnh than của các bệnh nhân nghi... tố, chống bệnh than Chính nhờ đặc tính này nên cho đến nay, protein PA đã và đang được sử dụng để tạo kit phát hiện kháng thể kháng bệnh than và các nghiên cứu tạo vaccine phòng bệnh than [14,23] 27 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Từ năm 1986, đã có những nghiên cứu đầu tiên về việc sử dụng protein PA làm nguyên liệu cho phản ứng ELISA phát hiện kháng thể kháng bệnh than trong... thông qua phát hiện kháng thể kháng bệnh than Không chỉ dừng lại ở việc nghiên cứu tạo kit phát hiện kháng thể kháng bệnh than, protein PA còn được sử dụng để tạo miễn dịch chống bệnh than Điều này đã được chứng minh qua nhiều mô hình động vật thí nghiệm, như chuột lang, khỉ Huyết thanh kháng PA từ thỏ đã được sử dụng để tạo miễn dịch chủ động cho chuột, bảo vệ 90 % chuột lang khỏi nhiễm bào tử B anthracis. .. vòng heptam tổ hợp với nhân tố LF sẽ gây chết và tổ hợp với nhân tố EF sẽ gây phù thũng cho tế bào vật chủ Vì vậy, kháng nguyên bảo vệ PA được coi là tác nhân gián tiếp gây ra hiệu quả độc tố của nhân tố gây chết và phù thũng [32,38] Bên cạnh đó, PA còn có vai trò chính trong miễn dịch bệnh than Người ta đã nghiên cứu khả năng kích thích miễn dịch của nhiều kháng nguyên vi khuẩn B anthracis như vỏ capsule,... các bệnh nhân nghi nhiễm than, đặc biệt là than da và than hô hấp Quinn và cộng sự (2002) đã đánh giá ELISA có độ nhạy chẩn đoán là 97,8 % còn độ đặc hiệu chẩn đoán là 97,6 % [41] Phương pháp này có khả năng phát hiện kháng thể kháng bệnh than sau 11 ngày có triệu chứng đầu tiên và 8-16 tháng sau triệu chứng đầu tiên [40] Đến năm 2007, nhóm nghiên cứu người Đức đã sử dụng phương pháp ELISA đánh giá hiệu... giá kháng thể đặc hiệu và phát hiện kháng thể kháng thể trung hòa độc tố ở 11 người tính nguyện tiêm vaccine bệnh than của Anh Phương pháp này được đánh giá là đơn giản, tốn ít thời gian và thích hợp để đánh giá hiệu quả tiêm vaccine bệnh than [14] Hiện nay, trên thế giới, kit ELISA đã được thương mại hóa Kit được sử dụng để đánh giá tình trạng phơi nhiễm với bệnh than của bệnh nhân và đánh giá hiệu quả... định được hai nhân tố chính điều hòa sự dịch mã và biểu hiện của gen là atxA và acpA Gen atxA mã hóa nhân tố hoạt hóa độc tố than nằm trên pXO1 Đây là nhân tố điều hòa toàn bộ sự biểu hiện của gen độc tố của B anthracis Các chủng B anthracis đột biến mất atxA không sản sinh được EF, LF, và PA hoặc sản sinh lượng ngoài giới hạn phát hiện và khả năng tổng hợp capsule giảm Gen atxA đã được phát hiện thuộc... [23] 28 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Đồng thời, protein PA có khả năng kích thích cơ thể khỉ sản sinh đáp ứng miễn dịch bảo vệ đại thực bào khỏi hiệu quả gây độc của LF Đây là những nghiên cứu tiền đề cho việc tạo vaccine tái tổ hợp phòng bệnh than trong tương lai Tại Việt Nam, từ năm 2003 đã có những công bố đầu tiên về việc xây dựng các phương pháp phát hiện bệnh than thông... theo sau bởi một trình tự lặp lại, nó như một tín hiệu kết thúc quá trình dịch mã [51] 1.7 Tình hình nghiên cứu biểu hiện và ứng dụng protein tái tổ hợp kháng nguyên bảo vệ PA Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu tập trung vào việc biểu hiện, tinh chế và sản xuất protein kháng nguyên bảo vệ PA tái tổ hợp trên nhiều hệ biểu hiện khác nhau như E coli, Bacillus subtilis, Baculovirus Các nghiên cứu đầu tiên ... than Tu theo cỏch thc lõy nhim m ngi ta chia bnh than thnh th than khỏc nhau: than da, than tiờu hoỏ, than hụ hp, than mng nóo [32] 1.1.1 Bnh than th da õy l hỡnh thc ph bin nht chim hn 95 %... mc bnh Th than ny cú t l t vong rt cao [32, 36] (Hỡnh 1.4) Hỡnh 1.4 Nóo ca kh nhim than th mng nóo 1.2 Tỏc nhõn gõy bnh than 1.2.1 c im ca vi khun than (Bacillus anthracis) Vi khun B anthracis. .. v a s u dn n t vong Dng than ny cú t l t vong cao chim 50 % mc dự cú c iu tr 1.1.3 Bnh than hụ hp Nguyờn nhõn gõy than hụ hp l hớt phi bo t than Sau vo c th, cỏc bo t than s phỏt trin thnh th