Nghiên cứu phương pháp phát hiện virut HAdV gây bệnh đau mắt đỏ ở việt nam bằng kỹ thuật PCR kết hợp với giải trình tự

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Quang Hƣng NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VIRUT HAdV GÂY BỆNH ĐAU MẮT ĐỎ Ở VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT PCR KẾT HỢP GIẢI TRÌNH TỰ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ** Học viên : Nguyễn Quang Hƣng NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VIRUT HAdV GÂY BỆNH ĐAU MẮT ĐỎ Ở VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT PCR KẾT HỢP GIẢI TRÌNH TỰ Chuyên ngành : Di truyền học Mã số: 60420121 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Cán hƣớng dẫn: Ts Nguyễn Văn Sáng Ts.Bs Hoàng Anh Tuấn Hà Nội, 2017 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Quang Hưng LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến tới TS Nguyễn Văn Sáng – giảng viên Bộ môn Di truyền, Trường đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học quốc gia Hà Nội, người Thầy ln tận tình hướng dẫn, bảo trực tiếp giúp em tiếp thu nhiều kiến thức kỹ thuật chuyên môn tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ em suốt q trình thực khóa luận Những dẫn Thầy định hướng quan trọng cho em q trình thực khóa luận Tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS BS Hoàng Anh Tuấn – Trưởng khoa Xét nghiệm tổng hợp – Bệnh viện Mắt TW, người tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi suốt q trình nghiên cứu hoàn thành luận văn Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới thầy cô Bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học nói riêng thầy Trường Đại học Khoa học Tự nhiên nói chung Em xin cảm ơn thầy hết lịng giảng dạy kiến thức giúp đỡ em suốt bốn năm học vừa qua Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới em Nguyễn Tiến Đạt Nguyễn Thu Huyền làm việc phịng thí nghiệm mơn di truyền người giúp đỡ em nhiều trình em thực đề tài Tơi xin chân thành cảm ơn Đại học Quốc gia Hà Nội hỗ trợ nghiên cứu đề tài mã số QG.17.19 Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đồng nghiệp anh chị Phòng Vi sinh - Khoa Xét nghiệm tổng hợp - Bệnh viện Mắt Trung ương, gia đình, người thân – người ln bên cạnh, tạo điều kiện động viên cho em động lực để phấn đấu trình học tập q trình thực khóa luận Hà Nội, tháng năm 2017 Nguyễn Quang Hưng QH.2014.T.CH - 60420121 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Quang Hưng MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh đau mắt đỏ 1.1.1 Tình hình bệnh đau mắt đỏ giới 1.1.2 Tình hình bệnh đau mắt đỏ Việt Nam 1.1.3.Triệu chứng đau mắt đỏ HAdV 1.1.3 1.2 Con đường lây lan bệnh đau mắt đỏ HAdVs TỔNG quan HAdv HAdv gây bệnh đau mắt đỏ 1.2.1 Human Adenovirus (HAdV) .5 1.2.2 HAdV gây bệnh đau mắt đỏ 10 1.3 Phương pháp phát nhanh chủng HAdV 10 1.3.1 Phương pháp phân lập virut .10 1.3.2 Phương pháp khuếch đại gen thị .11 1.4 Kỹ thuật PCR .11 1.4.1 Nguyên lý 11 1.4.2 Vùng gen đích ý nghĩa 12 1.5 Kĩ Thuật Giải trình tự 13 1.6 XÂY DỰNG CÂY CHỦNG LOẠI PHÁT SINH 14 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP 17 2.1 ĐỐI tượng nghiên cứu, hóa chất thiết bị 17 QH.2014.T.CH - 60420121 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Quang Hưng 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 17 2.1.3 Hóa chất 17 2.2 phương pháp nghiên cứu .18 2.2.1 Tách chiết ADN hệ gen human adenovirus 19 2.2.2 Thiết kế mồi 20 2.2.3 PCR khuếch đại đoạn gen hexon, penton fiber .21 2.2.4 Tinh sạch, giải trình tự đoạn gen hexon, penton fiber .23 2.2.5 Phân tích trình tự xây dựng mơ hình quan hệ di truyền 24 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 3.1 Kết thu thập mẫu bệnh phẩm 26 3.2 KẾT QUẢ KHUẾCH ĐẠI ĐOẠN GEN thị 26 3.2.1 Kết khuếch đại đoạn gen hexon (600 bp) 26 3.2.2 Kết khuếch đại đoạn gen penton (1118 bp) 27 3.2.3 Kết khuếch đại đoạn gen fiber (1264 bp) 28 3.3 KẾT QUẢ GIẢI so sánh trình tự 29 3.3.1 Kết phân tích trình tự gen hexon 30 3.3.2 Kết phân tích trình tự gen peton 32 3.3.3 Kết phân tích trình tự gen fiber .34 3.4 kết phân tích quan hệ di truyền 39 3.4.1 Phân loại chủng HAdV dựa trêntrình tự gen hexon .39 3.4.2 Phân loại chủng HAdV dựa trêntrình tự gen penton 41 3.4.3 Phân loại chủng HAdV dựa trêntrình tự gen fiber .43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 KẾT LUẬN .45 QH.2014.T.CH - 60420121 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Quang Hưng KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 QH.2014.T.CH - 60420121 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Quang Hưng DANH MụC BảNG Bảng 1.Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 18 Bảng 2.2 Tên trình tự cặp mồi thiết kế 21 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR .21 Bảng 1Phân tích kết giải trình tự gen hexon .30 Bảng Phân tích kết giải trình tự gen penton 32 Bảng 3 Phân tích kết giải trình tự gen fiber 34 Bảng 4Số lượng chủng HAdV phát dựa ba đoạn gen hexon, peton fiber 29 QH.2014.T.CH - 60420121 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Quang Hưng DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Bệnh đau mắt đỏ hình ảnh mơ tả Hình 1.2 Hình ảnh hạt Adenovirus kính hiển vi điện tử Hình 1.3 Mơ hình cấu trúc vỏ capsid HAdV Hình 1.4 Cấu trúc tổ chức gen hệ gen HAdV Hình 1.5 Cơ chế xâm nhiễm HAdV Hình 2.1 Sơ đồ tổng quát quy trình nghiên cứu .19 Hình 2.2 Một phần trình tự đoạn gen Hexon sau so sánh phần mềm MEGA7 24 Hình 3.1.Kết điện di sản phảm PCR khuếch đại đoạn gen hexon từ mẫu bệnh phẩm chứa hệ gen ADN HAdVs 27 Hình 3.2 Kết điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen penton từ mẫu bệnh phẩm chứa hệ gen ADN HAdVs 28 Hình 3.3.Kết điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen fiber 29 Hình 3.4 So sánh trình tự gen hexon mẫu giải trình tự 31 Hình 3.5 So sánh trình tự gen penton mẫu giải trình tự 33 Hình 3.6 So sánh trình tự gen fiber mẫu giải trình tự 37 Hình 3.7 Cây phát sinh chủng loại dựa vào gen hexon 40 Hình 3.8 Cây phát sinh chủng loại dựa vào gen penton 42 Hình 3.9 Cây phát sinh chủng loại dựa vào gen fiber 43 QH.2014.T.CH - 60420121 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Quang Hưng DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT UV Ultra violet TAE Tris base - Acetic acid - Ethylenediaminetetraacetic acid RNA/ARN Ribonucleic Acid mRNA Messenger Ribonucleic Acid mM Millimol Mm Millimeter ml Milliliter MEGA Molecular Evolutionary Genetics Analysis HVR Hypervariable region dNTPs Deoxyribonucleotide Triphosphate DNA/ADN Deoxyribonucleic Acid DDW Deionized distill water ddNTP Dideoxiribonucleoside triphosphate bp Kilobase pairs BLAST Basic Local Alignment Search Tool µl Microliter PCR Polymerase chain reaction QH.2014.T.CH - 60420121 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Quang Hưng MỞ ĐẦU Đau mắt đỏ từ dùng để bệnh viêm kết mạc cấp Bệnh đau mắt đỏ bệnh lý nhãn khoa phổ biến giới Đau mắt đỏ tiềm ẩn nguy to lớn sức khỏe người bệnh, nhiều trường hợp, không điều trị cách, đau mắt đỏ gây biến chứng nguy hiểm, để lại di chứng sau, gây giảm thị lực chí mù Đau mắt đỏ nhiều nguyên nhân gây nhiễm trùng, dị ứng, hoá chất tác nhân vật lý Một tác nhân gây bệnh đau mắt đỏ người Human Adenovirus (HAdV) Bệnh đau mắt đỏ gây HAdV có tốc độ lây lan nhanh phát triển thành dịch, đe dọa trực tiếp đến sức khỏe cộng đồng Ở Việt Nam, bệnh đau mắt đỏ HAdV hoành hành liên tục suốt 10 năm qua với số lượng người bị nhiễm cao, có năm lên tới 80.000 người Hàng năm, vào khoảng tháng đến tháng 10, thời tiết thuận lợi, dịch đau mắt đỏ HAdV lại bùng phát Khi bệnh xuất hiện, số lượng bệnh nhân tăng nhanh, đặc biệt nơi có mật độ dân cư cao trường học, bệnh viện, nhà máy thành phố lớn Adenovirus (AdV) nhóm virut thuộc họ Adenoviriae, gồm bốn giống khác nhau; có giống Mastedenovirus chuyên gây bệnh người, gọi Human Adenovirus, viết tắt HAdV Hiện có 50 chủng adenovirus khác nhau, khả phát triển loại vaccine điều trị thấp Do chưa có vaccine phòng bệnh, việc phát sớm tác nhân gây đau mắt đỏ để có phác đồ điều trị phù hợp quan trọng Trước kia, phương pháp định danh chủng HAdV thường thực cách phân lập virut, sau xác định nhóm huyết virut phản ứng ngưng kết kháng nguyên tách chiết ADN hệ gen cắt enzyme giới hạn để định loại Những phương pháp có nhược điểm phức tạp, tốn thời gian có độ xác cịn hạn chế Do vậy, chúng tơi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu phƣơng pháp phát virut HAdV gây bệnh đau mắt đỏ Việt Nam kỹ thuật PCR kết hợp giải trình tự” với mục tiêu cụ thể sau: Thiết kế cặp mồi đặc hiệu phục vụ cho việc nhân gen hexon, penton, fiber chủng HAdV gây bệnh đau mắt đỏ QH.2014.T.CH - 60420121 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Quang Hưng Kết phân tích so sánh 64 trình tự gen fiber mẫu HAdV dựa vào thể hình 3.6 Kết số 57 trình tự mẫu chủng HAdV-8 có 45 trình tự giống giống 100% so với trình tự chủng đối chứng lấy ngân hàng gen; 12 trình tự cịn lại giống có sai khác 1% so với trình tự chủng đối chứng lấy ngân hàng gen (sai khác từ 1-3 nucleotide) Cịn lại trình tự bao gồm3 trình tự thuộc chủng HAdV-3; trình tự thuộc chủng HAdV-7; trình tự thuộc chủng HAdV-4; trình tự thuộc chủng HAdV-37, khơng có sai khác so với trình tự đối chứng ngân hàng gen Các chủng so sánh với có tỷ lệ biến đổi cao, khác 50% tổng số nucleotide đoạn gen so sánh Sau so sánh mẫu phát dựa vào trình tự đoạn gen penton fiber với mẫu phát trình tự đoạn gen hexon, khơng có tái tổ hợp chủng HAdV phát Kết hợp trình tự gen, số 66 mẫu chứa HAdV có mẫu chủng HAdV-3; mẫu chủng HAdV-4; mẫu chủng HAdV-7; 59 mẫu chủng HAdV-8 mẫu chủng HAdV-37 Các trình tự gen tương ứng sử dụng làm liệu phân tích mơ hình quan hệ di truyền chủng HAdVs phần sau QH.2014.T.CH - 60420121 38 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Quang Hưng 3.4 KếT QUả PHÂN TÍCH CÂY QUAN Hệ DI TRUYềN 3.4.1 Phân loại chủng HAdV dựa trêntrình tự gen hexon 99 99 86 78 KL3 KL14 H11 KL9 O3 HAdV 8_Trim HAdV 8_JAP P5+45sequences 52 mẫu chủng HAdV 27 HAdV 22 HAdV 45 HAdV 10 HAdV 26 HAdV 17 HAdV 29 95 HAdV 15 HAdV 51 HAdV 48 HAdV 44 HAdV 20 HAdV 47 HAdV 25 HAdV 19 HAdV 32 HAdV 99 HAdV 28 HAdV 28.1 HAdV 42 99 HAdV 30 HAdV 30.1 97 HAdV 13 HAdV 37.1 99 HAdV 37 76 KL 16 HAdV 33 HAdV 36 HAdV 49 99 HAdV 38 HAdV 38.1 HAdV 23 HAdV 46 72 93 HAdV 43 HAdV 39 HAdV 24 HAdV 7.1 99 HAdV HAdV 3.1 89 98 HAdV P11 N6 97 HAdV KL 99 KL22 HAdV 4.1 HAdV 16 HAdV 50 81 HAdV 21 98 99 HAdV 35 HAdV 11 HAdV 34 HAdV 14 70 HAdV 88 99 HAdV HAdV D mẫu chủng 37 mẫu chủng mẫu chủng 77 E B2 HAdV HAdV 52 91 B1 HAdV 41 HAdV 40 HAdV 12 HAdV 31 HAdV 18 C F A QH.2014.T.CH - 60420121 39 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Quang Hưng Hình 3.7 Phân loại chủng HAdV cho mẫu bênh đau mắt đỏ Việt Nam (2015-2017) dựa vào trình tự gen hexon Mơ hình xây dựng dựa vào phương pháp Maximum-Likelihood với 1000 lần lặp Chỉ số boostrap gốc nhánh thể độ tin cậy cho mối quan hệ phát sinh chủng thích lớn 70 Mơ hình bao gồm loài (A-F) thể màu khác Các nhánh đóng khung thể cho chủng phát nghiên cứu với mẫu tơ màu đỏ Phân tích mơ hình phát sinh chủng loại xây dựng từ 50 trình tự gen hexon tương ứng với 50 chủng đối chứng thuộc loài (A-F) chi Mastadenovirus 57 trình tự gen hexon mẫu bệnh cho thấy xác cao với nhánh có giá trị boostrap 76 Kết thể hình 3.7 cho thấy có 52 mẫu chủng HAdV-8 mẫu HAdV-37 hai chủng thuộc loài D; mẫu HAdV-3 thuộc lồi B1; có mẫu chủng HAdV-4 thuộc lồi E QH.2014.T.CH - 60420121 40 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Quang Hưng 3.4.2 Phân loại chủng HAdV dựa trêntrình tự gen penton 88 97 99 99 99 mẫu chủng 37 91 D 83 92 99 98 99 97 96 47 mẫu chủng 99 98 70 99 B2 99 99 99 mẫu chủng 72 mẫu chủng 99 mẫu chủng 99 84 91 99 82 B1 E C F A QH.2014.T.CH - 60420121 41 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Quang Hưng Hình 3.8 Phân loại chủng HAdV cho mẫu bệnh đau mắt đỏ Việt Nam (2015-2017) dựa vào trình tự gen penton Mơ hình xây dựng dựa vào phương pháp Maximum-Likelihood với 1000 lần lặp Chỉ số boostrap gốc nhánh thể độ tin cậy cho mối quan hệ phát sinh chủng thích lớn 70 Mơ hình bao gồm lồi (A-F) thể màu khác Các nhánh đóng khung thể cho chủng phát nghiên cứu với mẫu tơ màu đỏ Phân tích mơ hình phát sinh chủng loại xây dựng từ 50 trình tự gen penton tương ứng với 50 chủng đối chứng thuộc loài (A-F) chi Mastadenovirus 55 trình tự gen penton mẫu bệnh cho thấy xác cao với nhánh có giá trị boostrap 72 Kết thể hình 3.8 cho thấy có 47 mẫu chủng HAdV-8 mẫu HAdV-37 hai chủng thuộc lồi D; có mẫu chủng HAdV-7 mẫu HAdV-3 thuộc loài B1; có mẫu chủng HAdV-4 thuộc lồi E QH.2014.T.CH - 60420121 42 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Quang Hưng 3.4.3 Phân loại chủng HAdV dựa trêntrình tự gen fiber 57 mẫu chủng 99 87 96 76 mẫu chủng 37 99 D 98 99 83 98 99 72 99 86 99 99 87 87 99 99 E mẫu chủng 85 98 mẫu chủng B mẫu chủng B F 96 98 94 99 99 93 99 A 92 99 93 94 C Hình 3.9.Phân loại chủng HAdV cho mẫu bênh đau mắt đỏ Việt Nam (215-20117) dựa vào trình tự gen fiber QH.2014.T.CH - 60420121 43 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Quang Hưng Mơ hình xây dựng dựa vào phương pháp Maximum-Likelihood với 1000 lần lặp Chỉ số boostrap gốc nhánh thể độ tin cậy cho mối quan hệ phát sinh chủng thích lớn 70 Mơ hình bao gồm lồi (A-F) thể màu khác Các nhánh đóng khung thể cho chủng phát nghiên cứu với mẫu tô màu đỏ Phân tích mơ hình phát sinh chủng loại xây dựng từ 50 trình tự gen fiber tương ứng với 50 chủng đối chứng thuộc loài (A-F) chi Mastadenovirus 64 trình tự gen fiber mẫu bệnh cho thấy xác cao với nhánh có giá trị boostrap 76 Kết thể hình 3.9 cho thấy có 57 mẫu chủng HAdV-8 mẫu HAdV-37 hai chủng thuộc lồi D; có mẫu chủng HAdV-7 mẫu HAdV-3 thuộc lồi B1; có mẫu chủng HAdV-4 thuộc loài E Kết đồng với kết phân tích với 57 mẫu sử dụng trình tự gen hexon penton Kết lần khẳng định số chủng HAdV gây bệnh đau mắt đỏ Việt Nam Chủng HAdV-8 chủng phổ biến (chiếm 85%).Chủng HAdV-3 có mức độ phổ biến đứng thứ với ( chiếm 5,97%) Ngoài Việt Nam có phát chủng HAdV gây bệnh đau mắt đỏ với tỉ lệ thấp như: HAdV-37 ( chiếm 1,49%) HAdV-4 ( chiếm 1,49%) Phân tích trình tự gen thấy chủng có trình tự gen giống với chủng gen HAdV gây bệnh đau mắt đỏ giới QH.2014.T.CH - 60420121 44 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Quang Hưng KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Với kết thu được, đưa kết luận sau: Đã thiết kế thành công cặp mồi đặc hiệu phục vụ cho việc nhân gen hexon, penton, fiber chủng HAdV gây bệnh đau mắt đỏ Đã tối ưu quy trình PCR nhân đặc hiệu gen hexon, penton, fiber chủng HAdV gây bệnh đau mắt đỏ Sử dụng thành cơng quy trình PCR nhân gen hexon, penton fiber để phân tích 122 mẫu bệnh phẩm thu từ Bệnh viện Mắt Trung ương Kết phân tích cho thấy 122 mẫu bệnh phẩm, chúng tơi phát 66 mẫu có chứa virut HAdVs Giải trình tự gen ba gen hexon, penton fiber xây dựng chủng loại phát sinh nhằm xác định xác chủng HAdV Việt Nam Trong 66 mẫu HAdVs có 59 mẫu chứa chủng HAdV-8, mẫu chứa chủng HAdV-3; mẫu chứa chủng HAdV-7; mẫu chứa chủng HAdV-37 mẫu chứa chủng HAdV-4 Như HAdV-8 chủng phổ biến gây bệnh đau mắt đỏ Việt Nam KIẾN NGHỊ Căn vào kết nghiên cứu, chúng tơi có kiến nghị sau: Phân tích thêm mẫu bệnh phẩm khu vực Miền Trung, Miền Nam Việt Nam Hoàn thiện kit phát nhanh chủng virut HAdV gây bệnh đau mắt đỏ giúp cho việc phân tích nhanh mẫu bệnh nghị bị nhiễm HAdV QH.2014.T.CH - 60420121 45 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Quang Hưng TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Anh 10 11 12 13 14 15 Akiyoshi K., et al (2011),"Outbreak of epidemic keratoconjunctivitis caused by adenovirus type 54 in a nursery school in Kobe City", Japan in 2008.Jpn J Infect Dis 64(4), pp 353-5 AokiK., Y Tagawa, (2002), "A twenty-one year surveillance of adenoviral conjunctivitis in Sapporo, Japan".Int Ophthalmol Clin, 42(1), pp 49-54 Azari, A.A and N.P Barney (2013), "Conjunctivitis: a systematic review of diagnosis and treatment".JAMA, 310(16), pp 1721-9 Chang, C.H., et al (2003), "The change of etiological agents and clinical signs of epidemic viral conjunctivitis over an 18-year period in southern Taiwan".Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, 241(7), pp 554-60 Cheng, J., et al (2016), "Epidemiology and transmission characteristics of human adenovirus type caused acute respiratory disease outbreak in military trainees in East China".Am J Transl Res, 8(5), pp 2331-42 Brudno, M., et al (2003), "LAGAN and Multi-LAGAN: efficient tools for large-scale multiple alignment of genomic DNA" Genome Res, 13(4), pp 721-31 Engelmann, I., et al (2006), "An outbreak of epidemic keratoconjunctivitis caused by a new intermediate adenovirus 22/H8 identified by molecular typing" Clin Infect Dis, 43(7), pp e64-6 Erdman, D.D., et al (2002), "Molecular epidemiology of adenovirus type in the United States, 1966-2000" Emerg Infect Dis, 8(3), pp 269-77 Fujimoto, T., et al (2012), "A molecular epidemiologic study of human adenovirus type isolates causing epidemic keratoconjunctivitis in Kawasaki City, Japan in 2011".Jpn J Infect Dis, 65(3), pp 260-3 Ghebremedhin, B (2014), "Human adenovirus: Viral pathogen with increasing importance".Eur J Microbiol Immunol (Bp), 4(1), pp 26-33 Gordon, Y.J., et al (1991), "Inhibitory effect of (S)-HPMPC, (S)-HPMPA, and 2'-nor-cyclic GMP on clinical ocular adenoviral isolates is serotypedependent in vitro" Antiviral Res, 16(1), pp 11-6 Hiroi, S., et al (2013), "Molecular epidemiology of human adenoviruses d associated with epidemic keratoconjunctivitis in Osaka, Japan, 20012010".Jpn J Infect Dis, 66(5), pp 436-8 Horwood, N.J., et al (2002), "High-efficiency gene transfer into nontransformed cells: utility for studying gene regulation and analysis of potential therapeutic targets".Arthritis Res, Suppl 3: pp S215-25 Ishii, K., et al (1987), "Comparative studies on aetiology and epidemiology of viral conjunctivitis in three countries of East Asia Japan, Taiwan and South Korea".Int J Epidemiol, 16(1), pp 98-103 Janani, M.K., J Malathi, and H.N Madhavan (2012), "Isolation of a variant human adenovirus identified based on phylogenetic analysis during an QH.2014.T.CH - 60420121 46 Luận văn thạc sĩ khoa học 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Nguyễn Quang Hưng outbreak of acute keratoconjunctivitis in Chennai".Indian J Med Res, 136(2), pp 260-4 John E Schneider, P., Cara M Scheibling, Darron Segall, MHS, Robert Sambursky, MD, Robert L Ohsfeldt, PhDand M Laura Lovejoy (2013), "Epidemiology and Economic Burden of Conjunctivitis: A Managed Care Perspective".Journal of Managed Care Medicine, 17(1), pp Kajon, A.E., et al (2010), "Molecular epidemiology and brief history of emerging adenovirus 14-associated respiratory disease in the United States".J Infect Dis, 202(1), pp 93-103 Kaneko, H., et al (2011), Complete genome analysis of a novel intertypic recombinant human adenovirus causing epidemic keratoconjunctivitis in Japan".J Clin Microbiol, 49(2), pp 484-90 Kaneko, H., et al (2011), "Recombination analysis of intermediate human adenovirus type 53 in Japan by complete genome sequence" J Gen Virol, 92(Pt 6), pp 1251-9 Kimura, M (1980), "A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences".J Mol Evol, 16(2), pp 111-20 Kumar, S., G Stecher, and K Tamura (2016), MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets".Mol Biol Evol, 33(7), pp 1870-4 Lee, W.J., et al (2010), "Molecular Classification of Human Adenovirus Type Isolated From Acute Respiratory Disease Outbreak (ARD) in Korea, 2005-2006" Osong Public Health Res Perspect, 1(1), pp 10-6 Lyons, A., et al (2008), A double-blind, placebo-controlled study of the safety and immunogenicity of live, oral type and type adenovirus vaccines in adults".Vaccine, 26(23), pp 2890-8 Martone, W.J., et al (1980), "An outbreak of adenovirus type disease at a private recreation center swimming pool".Am J Epidemiol, 111(2), pp 229-37 Meyer-Rusenberg, B., et al (2011), "Epidemic keratoconjunctivitis: the current situation and recommendations for prevention and treatment".Dtsch Arztebl Int, 108(27), pp 475-80 Nauheim, R.C., et al (1990), "Prolonged recoverability of desiccated adenovirus type 19 from various surfaces".Ophthalmology, 97(11), pp 1450-3 Saitoh-Inagawa, W., et al (1999), Ten years' surveillance of viral conjunctivitis in Sapporo, Japan".Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, 237(1), pp 35-8 Sanderson, M.J and M.F Wojciechowski (2000), "Improved bootstrap confidence limits in large-scale phylogenies, with an example from NeoAstragalus (Leguminosae)".Syst Biol, 49(4), pp 671-85 Sarantis, H., et al (2004), "Comprehensive detection and serotyping of human adenoviruses by PCR and sequencing".J Clin Microbiol, 42(9), pp 39639 QH.2014.T.CH - 60420121 47 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Quang Hưng 30 Schmitz, H., R Wigand, and W Heinrich (1983), "Worldwide epidemiology of human adenovirus infections".Am J Epidemiol, 117(4), pp 455-66 31 Sriwanna, P., et al., Molecular characterization of human adenovirus infection in Thailand, 2009-2012 Virol J, 2013 10: pp 193 32 Walsh, M.P., et al (2009), "Evidence of molecular evolution driven by recombination events influencing tropism in a novel human adenovirus that causes epidemic keratoconjunctivitis".PLoS One, 4(6), pp e5635 33 Wigand, R., et al (1982), "Adenoviridae: second report".Intervirology, 18(4), pp 169-76 34 Yoon, J., et al (2011), "Virucidal mechanism of action of NVC-422, a novel antimicrobial drug for the treatment of adenoviral conjunctivitis" Antiviral Res, 92(3), pp 470-8 35 Zhu, Z., et al (2009), "Outbreak of acute respiratory disease in China caused by B2 species of adenovirus type 11" J Clin Microbiol, 47(3), pp 697703 Website 36 http://lib.sytu.edu.cn/asm/460-Introduce.htm 37 http://www.sciencephoto.com/media/248982/view 38 http://www.shutterstock.com/pic-160235651 QH.2014.T.CH - 60420121 48 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Quang Hưng DANH SÁCH MẪU BỆNH ĐAU MẮT ĐỎ THU THẬP STT TÊN MẪU NC KL2.2 L89 H45 KL1 KL3 KL4 KL5 KL6 10 KL7 11 12 13 14 15 16 17 KL8 KL9 KL10 KL11 KL12 KL13 KL14 18 KL15 19 KL16 20 21 KL17 KL18 22 KL19 23 24 25 KL20 KL21 KL22 TÊN, ĐỊA ĐIỂM SỐ THU ĐỢT THU 2.2 Thanh 32 9/23/2017 Linh 89 Hạnh 15 (4) 1.2 Hà Hà Nữ Tình 13 13 Hà (black) 1/18/2016 Hà (black) 13 (6)Hà (black) 13(6) 1-red 2-red 4-red 5-red Vân 3 Khang Chiến (Nga) Mạnh (Nga) Mạnh (8.2) (Kim) 10 Chi (10.1) 10 10 Thúy (10.2) 10 11HKL L.Anh NGÀY TÁCH 10/7/2015 11/26/2015 11/26/2015 10/7/2015 2/17/2016 12/9/2015 11/26/2015 3/8/2016 3/8/2016 3/8/2016 4/19/2016 4/19/2016 4/19/2016 4/19/2016 12/16/2015 11/26/2015 12/16/2015 12/9/2015 4/19/2016 4/19/2016 12/19/2015 4/19/2016 3/8/2016 QH.2014.T.CH - 60420121 49 Luận văn thạc sĩ khoa học 26 KL23 27 28 KL24 12HKL 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 J1 J2 J3 J4 J5 J6 J7 J9 M4 M5 M7 M13 N3.2 N6 N9? N11 N12 N14 H1 H2 H3 H4 H5 H6 Nguyễn Quang Hưng 6/11 ngư(7HKL) 12 (xanh) Hà (black) Hà Hà (black) 6/ Hà 9/ Bình 6/ Nga M4 6(11) 3/8/2016 12 Nga M7 Nga M13 Nga 3.2 Nga Nga Nga 11 Nga 12 14 Hưng N.anh Thủy Bình Minh Thiên 45 3/8/2016 3/8/2016 9 3/8/2016 4/19/2016 4/19/2016 4/19/2016 6/29/2016 6/29/2016 6/29/2017 6/29/2016 6/29/2016 6/29/2016 6/29/2016 6/29/2016 8/30/2016 8/18/2016 8/8/2016 10/16/2016 8/30/2016 8/30/2016 8/30/2016 8/30/2016 9/13/2016 1/19/2017 1/19/2017 1/19/2017 1/19/2017 12/9/2016 QH.2014.T.CH - 60420121 50 Luận văn thạc sĩ khoa học 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 H7 H8 H9 H10 H11 O2 O3 O8 O10 O14 O15 P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11 P12 P13 P14 P15 P16 P17 P18 P19 P20 P21 P22 P23 Q1 Nguyễn Quang Hưng Sim 48 Nga 32 Lâm 11/10/2017 11/8/2016 11/30/2016 10/29/2016 10/3/2016 Minh 10 14 15 Nam Lâm C Đức 36 Nhi 13 Thủy Hùng 30 Thành 60 H.Anh Mai 30 Hug Sơn 20 Dung 27 Nhật Ánh Bảo Linh Vân 70 Bảo 6t Hằng 35 Thế 47 Vany 32 Bình 60 Dãn Hoa 36 10 14 15 9/26/2016 11/11/2016 1/8/2017 11/9/2016 10/5/2016 1/3/2017 11/10/2016 10/25/2016 10/11/2016 9/30/2016 10/25/2016 8/15/2016 10/11/2016 11/18/2016 8/15/2016 11/11/2016 11/9/2016 9/4/2016 6/12/2017 9/13/2016 9/12/2016 9/13/2016 9/13/2016 9/13/2016 9/12/2016 1/19/2017 1/19/2017 1/19/2017 1/19/2017 1/19/2017 1/19/2017 1/19/2017 2/17/2017 2/17/2017 2/17/2017 2/17/2017 2/17/2017 2/17/2017 2/17/2017 7/16/2017 1/15/2017 6/19/2017 QH.2014.T.CH - 60420121 51 Luận văn thạc sĩ khoa học 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 Q2 Q3 Q4 Q5 Q6 Q7 Q8 Q9 Q10 Q11 Q12 Q13 Q14 Q15 Q16 Q17 Q18 Q19 Q20 Q21 Q22 Q23 Q24 Q25 Q26 Q27 Q28 Q29 Q30 Nguyễn Quang Hưng Tuần 68 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Mai Thấu 68 Thanh 32 Hiên 47 Hà 47 Tân 26 Luân 30 Yến 18 Thanh 32 Suw 55 Ly 12 Tiềm 23 Hiền 25 Hà 22 Bảo Huy7 Hằng Ly 29 Khôi 55 Len 54 Cúc 22 Cường 30 Vinh 48 Phương Mạnh 5/21/2017 2/27/2017 6/30/2017 5/30/2017 3/15/2017 3/15/2017 3/15/2017 5/31/2017 5/30/2017 5/30/2017 3/27/2017 4/23/2017 7/4/2017 7/18/2017 7/12/2017 7/4/2017 7/4/2017 7/4/2017 7/4/2017 6/8/2017 7/12/2017 4/15/2017 4/23/2017 4/15/2017 4/16/2017 3/19/2017 4/25/2017 3/23/2017 6/10/2017 5/10/2017 7/12/2017 7/4/2017 7/12/2017 6/22/2017 6/22/2017 7/12/2017 5/25/2017 4/12/2017 5/18/2017 4/22/2017 5/20/2017 8/11/2017 6/19/2017 7/4/2017 7/4/2017 7/4/2017 6/19/2017 QH.2014.T.CH - 60420121 52 ... nhiễm HAdV gây bệnh đau mắt đỏ chủ yếu chủng 37, Việt Nam theo nghiên cứu trước tỉ lệ mắc HAdV gây bệnh đau mắt đỏ chủ yếu chủng 1.2.2 HAdV gây bệnh đau mắt đỏ Ở Việt Nam, bệnh đau mắt đỏ HAdV. .. HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ** Học viên : Nguyễn Quang Hƣng NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VIRUT HAdV GÂY BỆNH ĐAU MẮT ĐỎ Ở VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT PCR KẾT HỢP GIẢI TRÌNH TỰ Chuyên ngành... HAdV 22 HAdV 45 HAdV 10 HAdV 26 HAdV 17 HAdV 29 95 HAdV 15 HAdV 51 HAdV 48 HAdV 44 HAdV 20 HAdV 47 HAdV 25 HAdV 19 HAdV 32 HAdV 99 HAdV 28 HAdV 28.1 HAdV 42 99 HAdV 30 HAdV 30.1 97 HAdV 13 HAdV