Xác định sự hiện diện của dna thai tự do trong máu mẹ bằng kỹ thuật msp kết hợp tạo dòng giải trình tự

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT (TỒN VĂN) ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG XÁC ĐỊNH SỰ HIỆN DIỆN CỦA DNA THAI TỰ DO TRONG MÁU MẸ BẰNG KỸ THUẬT MSP KẾT HỢP TẠO DỊNG GIẢI TRÌNH TỰ Mã số: Chủ nhiệm đề tài: Cử nhân LƯƠNG BẮC AN Tp Hồ Chí Minh, 09/2018 i BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT (TÓM TẮT) ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG XÁC ĐỊNH SỰ HIỆN DIỆN CỦA DNA THAI TỰ DO TRONG MÁU MẸ BẰNG KỸ THUẬT MSP KẾT HỢP TẠO DỊNG GIẢI TRÌNH TỰ Mã số: Chủ nhiệm đề tài (ký, họ tên) Tp Hồ Chí Minh, 05/2019 ii DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU Chức danh Họ tên, học hàm học vị trình thực Đơn vị công tác nhiệm vụ CN LƯƠNG BẮC AN PGS.TS ĐỖ THỊ THANH THUỶ Chủ nhiệm đề tài Trung tâm Y Sinh học Phân tử Đại học Y Dược TP.HCM Thành viên Trung tâm Y Sinh học Phân tử Đại học Y Dược TP.HCM i MỤC LỤC i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC BẢNG vi MỞ ĐẦU vii CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Phương pháp xét nghiệm trước sinh cfDNA thai tự máu mẹ .1 1.1.1 Đặc điểm DNA thai tự máu mẹ 1.1.2 Tách chiết cfDNA từ huyết tương thai phụ 1.2 Xác định diện cffDNA huyết tương thai phụ .2 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Chọn mẫu nghiên cứu 2.2 Vật liệu nghiên cứu .5 2.2.1 Thiết bị - Dụng cụ 2.2.2 Hóa chất 2.3 Thu nhận lưu trữ mẫu máu thai phụ có nguy cao 2.4 Quy trình tách chiết kít MagMAX cell-free DNA isolation 2.5 Chuyển đổi gốc CpG cfDNA 2.6 Khuếch đại vùng quan tâm 2.7 Tạo dòng sản phẩm PCR .9 2.8 Giải trình tự 11 CHƯƠNG 3: CÁC KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC .12 iv 3.1 Kết kiểm tra mồi in silico 12 3.2 Kết phản ứng MSP 14 3.3 Kết tạo dòng sản phẩm MSP .16 3.4 Kết giải trình tự xác định gốc methyl hố vùng gene RASSF1A thai 17 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 20 5.1 Kết luận 20 TÀI LIỆU THAM KHẢO 20 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết Tiếng Việt Tiếng Anh tắt cfDNA DNA tự Circulating free DNA cffDNA DNA thai tự Circulating free fetus DNA NST Nhiễm sắc thể FF Hàm lượng DNA thai tự Fetal fraction DANH MỤC HÌNH Hình 3.1: Kiểm tra cặp mồi phầm mềm CLC 14 Hình 3.2: Kết điện di sản phẩm PCR 15 Hình 3.3: Khuẩn lạc chứa vector chèn 16 Hình 3.4: Kết giải trình tự 17 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Trình tự mồi sử dụng nghiên cứu Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR kiểm tra độ đặc hiệu mồi Bảng 3.1 Kết kiểm tra đặc tính mồi đoạn dị 13 vi THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG Thơng tin chung: - Tên đề tài: XÁC ĐỊNH SỰ HIỆN DIỆN CỦA DNA THAI TỰ DO TRONG MÁU MẸ BẰNG KỸ THUẬT MSP KẾT HỢP TẠO DỊNG GIẢI TRÌNH TỰ - Mã số: - Chủ nhiệm đề tài: CN Lương Bắc An Điện thoại: 0933 908 241 Email: luongbacan@ump.edu.vn - Đơn vị quản lý chuyên môn (Khoa, Tổ môn): Trung tâm Y Sinh học Phân tử - Thời gian thực hiện: Tháng 6-2018 đến tháng 5-2019 Mục tiêu: xác định diện dna thai tự máu mẹ kỹ thuật MSP kết hợp tạo dòng giải trình tự Nội dung chính: - Tạo dịng kết hợp giải trình tự nhận diện điểm thay đổi methyl hoá vùng gen RASSF1A DNA mẹ thai Kết đạt (khoa học, đào tạo, kinh tế-xã hội, ứng dụng, ):  Cơng bố tạp chí nước quốc tế (tên báo, tên tạp chí, năm xuất bản): Hiệu kinh tế - xã hội đề tài mang lại: vii MỞ ĐẦU Sự diện DNA thai tự (cffDNA) máu mẹ mở cách mạng sàng lọc tiền sản không xâm lấn (NIPT) DNA tự (cfDNA) đoạn DNA nhỏ, tồn máu thai phụ CfDNA có nguồn gốc từ tế bào chết, bị vỡ giải phóng cfDNA vào hệ tuần hồn Các cfDNA bắt nguồn từ máu thai phụ (tế bào mô mỡ tế bào máu) từ thai nhi (tế bào thai Năm 1948, lần DNA tự (cfDNA) hệ tuần hoàn phát [24] Gần nửa kỉ sau đó, Deniss Lo chứng minh tồn cfDNA thai (cffDNA) xuất hệ tuần hoàn người mẹ vào tuần thứ thai kì[11] mảnh DNA có nhiều điểm đặc biệt tỉ lệ cffDNA thai tăng dần theo tuổi thai thường thay đổi khoảng - 19% tổng số cfDNA máu mẹ, trung bình 10% [17] Thời gian bán hủy trung bình cffDNA 16,3 phút (từ - 30 phút), vài sau hậu sản cffDNA không cịn tồn máu mẹ[13] Đây đặc tính hữu ích chẩn đốn thai kỳ tránh nhầm lẫn với thai kỳ trước Trong thập kỷ qua, tiềm ứng dụng lâm sàng cffDNA thể kỹ thuật sàng lọc tiền sản không xâm lấn (NIPS) số bất thường lệch bội nhiễm sắc thể T21, T18, T1, ngồi cffDNA cịn sử dụng để xác định nhóm máu rhesus D (RHD) thai nhi, bệnh lí liên kết với giới tính, thalassemia, rối loạn dưỡng cơ, tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh,…Ngồi ra, hàm lượng cffDNA sử dụng xác định số bất thường tiền sản khác tiền sản giật, hay số bất thường thai Một thách thức lớn phát triển xét nghiệm NIPS hàm lượng cffDNA máu mẹ dao động khoảng 3-20% tuỳ thuộc vào tuổi thai Do đó, kết âm tính cần kiểm tra lại để loại trừ khả mang thai nữ hàm lượng cffDNA thấp ngưỡng phát thiết bị, chí thất cffDNA q trình thu nhận xử lí Vì vậy, xác định tồn DNA thai nhi mẫu xét nghiệm điều cần thiết để tránh kết âm tính giả vii CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Phương pháp xét nghiệm trước sinh cfDNA thai tự máu mẹ Năm 1997, Dennis Lo cộng nghiên cứu tìm DNA NST Y máu 43 thai phụ (gồm 30 thai kỳ nam 13 thai kỳ nữ) 10 người phụ nữ không mang thai [11] Kết cho thấy phụ nữ không mang thai thai phụ mang thai nữ khơng có NST Y máu Trong đó, NST Y lại có 80% mẫu huyết tương, 70% mẫu huyết 17% mẫu tế bào máu có nhân 30 thai phụ mang thai kỳ nam [7][12] Đây phát mang tính bước ngoặt gợi ý khả ứng dụng phát DNA tự thai máu mẹ (cell-free fetal DNA - cffDNA) để truy tìm số tình trạng bất thường thai lĩnh vực xét nghiệm thai trước sinh không xâm lấn Phương pháp trở thành xu hướng tiên tiến, ủng hộ rộng rãi phân lập phân tích cffDNA không cần phải thực thủ thuật xâm lấn chọc hút dịch ối, sinh thiết gai lấy máu dây rốn nên không gây biến chứng mẹ thai [19] 1.1.1 Đặc điểm DNA thai tự máu mẹ DNA tự (cell free DNA - cfDNA) lưu hành huyết tương người phát lần vào năm 1948 [14] Đây đoạn DNA ngắn, đa số có kích thước khoảng 150 - 200bp có nguồn gốc từ tế bào có nhân chết theo chương trình [1] Đến năm 1997, Dennis Lo cộng phát cfDNA thai nhi (cffDNA) máu thai phụ Hầu hết cffDNA máu mẹ có nguồn gốc từ tế bào gai phần nhỏ từ hệ thống tạo máu thai [11] Các mảnh cffDNA tạo thành giải phóng vào máu mẹ q trình chết tự nhiên tế bào có nhân gai phát máu mẹ từ tuần thứ thai kỳ Tỉ lệ cffDNA thai tăng dần theo tuổi thai thường thay đổi khoảng - 19% tổng số cffDNA máu mẹ, trung bình 10% [17] Thời gian bán hủy trung bình cff-DNA 16,3 phút (từ - 30 phút), vài sau hậu sản cffDNA khơng cịn máu mẹ[13] Đây đặc tính hữu ích chẩn đốn thai kỳ tránh nhầm lẫn với thai kỳ trước 1.1.2 Tách chiết cfDNA từ huyết tương thai phụ CffDNA phân tử trần đoạn DNA phân mảnh ngắn, có kích thước trung bình nói chung ngắn đoạn DNA tự có nguồn gốc từ mẹ [3], mảnh DNA xuất máu ngoại vi người mẹ suốt thời kì mang thai biến sau sinh Nhìn chung, đặc điểm dễ thấy nồng độ cffDNA máu mẹ thấp, thay đổi theo tuần tuổi thai, trung bình chiếm khoảng 10% số cfDNA tách chiết từ huyết tương mẹ Vì vậy, phương pháp tách chiết cfDNA coi bước quan trọng kỹ thuật NIPT Nồng độ cffDNA thu phụ thuộc vào tuần tuổi thai, sức khỏe thai phụ thời điểm lấy máu Ngoài ra, phương pháp tách chiết sử dụng để thu nhận cfDNA định tới chất lượng cffDNA thu Nhiều tác giả nghiên cứu sử dụng chủ yếu phương pháp tách cột lọc hãng QIAGen để phân lập cfDNA, phương pháp cho thấy số nhược điểm hiệu suất thu thấp khơng thu nhận đoạn cfDNA nhỏ 150bp[6] 1.2 Xác định diện cffDNA huyết tương thai phụ cffDNA định nghĩa đoạn nhỏ DNA thai hình thành từ trình chết theo chương trình (apoptosis) tế bào thai giải phóng trực tiếp vào hệ tuần hồn thai phụ Hàm lượng cffDNA (fetal fraction – FF) tính theo cơng thức: - Chuyển tồn dung dịch vào tube 1,5ml khơng dính ướt - Đặt ống lên khay từ 20 giây (dung dịch suốt), sử dụng dịch để rửa ống mẫu ban đầu (tận thu tối đa mẫu) - Đặt ống lên khay từ phút (dung dịch suốt hạt từ giữ lại hoàn toàn), loại bỏ dịch pipette - Giữ ống khay từ, gõ nhẹ lần xuống mặt bàn, loại bỏ dịch sót pipette - Lặp lại bước thêm lần Bước rửa lần với Ethanol 80% - Tái huyền phù hạt từ với 1ml EtOH 80%, vortex 30 giây - Đặt ống lên khay từ 20 giây (dung dịch suốt), sử dụng dịch để rửa ống mẫu ban đầu (tận thu tối đa mẫu) - Giữ ống khay từ, gõ nhẹ lần xuống mặt bàn, loại bỏ dịch cịn sót pipette - Lặp lại bước thêm lần - Giữ ống khay từ, để khô hạt từ 3-5 phút Bước thu nhận cfDNA khỏi hạt từ 2.5 - Bổ sung 30µl MagMAX Cell Free DNA Elution Solution, vortex phút - Đặt ống khay từ 3-5 phút, hút dung dịch cho vào tube - Trữ mẫu cfDNA -30oC Chuyển đổi gốc CpG cfDNA Tiến hành chuyển đổi trình tự cfDNA thu kít EZ DNA Methylation-Direct TM kit (Zymo Research) Bộ kít EZ DNA Methylation-Direct TM có chứa sodium bisulfite có tác dụng chuyển đổi gốc cytosine chưa methyl hóa thành gốc uracil, cịn gốc cytosine methyl hóa giữ ngun Vì vậy, phân biệt cffDNA huyết tương mẹ Quy trình tiến hành theo hướng dẫn nhà sản xuất Qui trình thực hiện: Bổ sung 750µl H2O 210µl M-Dilution buffer vào ống CT Conversion Mix - hỗn hợp nhiệt độ phòng cách vortex lắc 10 phút Bổ sung 5µl M-Dilution buffer vào 15µl mẫu DNA, thêm H2O cho đủ 50µl Ủ - 37oC 15 phút - Bổ sung thêm 100µl CT conversion, trộn Spin nhẹ - Ủ 50oC, tránh sáng 16 giờ, ủ tiếp đá 10 phút - Bổ sung 400µl M-Binding buffer vào cột lọc Zymo-Spin IC Cột lọc đặt ống thu Cho hồn tồn mẫu vào cột lọc Đóng nắp đảo ống 10 lần Li tâm tốc - độ 14000rpm 30 giây Bỏ dịch thu Bổ sung 100µl M-Wash buffer Li tâm tốc độ 14000rpm 30 giây Bỏ dịch - thu Bổ sung 200µl M-Desulphonation buffer vào cột, đặt yên nhiệt độ phòng - 20 phút Li tâm tốc độ 14000rpm 30 giây Bỏ dịch thu Bổ sung 200µl M-Wash buffer Li tâm tốc độ 14000rpm 30 giây Bỏ dịch - thu Lặp lại lần Đặt cột lọc vào ống Eppendorf 1.5ml Bổ sung 30µl M-Elution buffer Li tâm - tốc độ 14000rpm 30 giây Thu nhận mẫu trữ -30oC - Khuếch đại vùng quan tâm 2.6 Bảng 2.1 Trình tự mồi sử dụng nghiên cứu Trình tự (5’-3’) Tên primer RASSF1A-qMF CGTGTTAACGCGTTGCGTATC RASSF1A-qMF TACGTAACAAACCCCACGAAGTAAAAACG RASSF1A-qUF GGTTGGAGTGTGTTAATGTGTTGTGTATT RASSF1A-qUR TACATAACAAACCCCACAAACTAAAAACA SP6 TAAATCCACTGTGATATCTT Kích thước PCR (bp) 104 112 Tuỳ thuộc T7 đoạn chèn ATTATGCTGAGTGATATCCC Một tiêu chuẩn quan trọng mồi độ đặc hiệu, mồi phải bắt hoàn toàn với trình tự mục tiêu, tạo sản phẩm nhất, khơng hình thành sản phẩm ngoại lai Dùng phản ứng PCR để kiểm tra độ đặc hiệu sau xác nhận thơng số đặc tính của cặp mồi phần mềm Mỗi cặp mồi chạy mẫu cfDNA sau xử lí bisulfite, sử dụng nước làm chứng âm cho phản ứng Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR kiểm tra độ đặc hiệu mồi Thành phần 10X PCR buffer Thể tích (µl) 2,5 dNTPs Nồng độ cuối 1X Mồi RASSF1A-qMF (10 µM) 1,25 500nM Mồi RASSF1A-qMR (10 µM) 1,25 500nM Maxima Taq HS DNA H2 O 0.2 7,8 10-15 ng 25 Tổng Chương trình PCR sau: chu kỳ 98oC phút, 50 chu kỳ với chu kỳ gồm bước: 98oC/10 giây, 58oC/30 giây, 72oC/20 giây chu kỳ 72oC phút Sau đó, điện di gel 2% 100V 30 phút để kiểm tra sản phẩm khuếch đại 2.7 Tạo dịng sản phẩm PCR Chúng tơi tiến hành giải trình tự xác định phản ứng PCR có khuếch đại đoạn DNA mục tiêu quan tâm Do kích thước sản phẩm PCR ngắn (104bp), máy giải trình tự khơng đọc hồn tồn chuỗi trình tự nên chúng tơi tiến hành dịng hố đoạn DNA quan tâm vào plasmid, vừa nhằm mục đích giải trình tự hồn tồn đoạn DNA quan tâm làm chứng dương để hiệu chuẩn thông số phản ứng realtime PCR bước bên Chúng sử dụng kít pGEM®T Easy vector systems với quy trình theo hướng dẫn nhà sản xuất Vector pGEM®T Easy có chứa vùng trình tự promoter T7 SP6 RNA polymerase hai bên vùng gắn chèn DNA đích, nơi có trình tự mã hố chuỗi -peptide enzyme -galactosidase Quá trình chèn vào khiến bất hoạt hình thành chuỗi -peptide, dẫn đến enzyme -galactosidase khơng cịn hoạt tính phân cắt X-Gal (tạo màu xanh) Do đó, khuẩn lạc màu trắng đại diện cho nhóm có trình tự gắn chèn vào vector Quy trình tóm tắt bước sau: Nối sản phẩm PCR với hệ thống vector Sản phẩm PCR điều chỉnh nồng độ thích hợp phản ứng nối vector theo quy trình nhà sản xuất Phản ứng nối thiết lập phản ứng gồm 5µl 2X Rapid ligation buffer, 1µl pGEM T Vector (50ng), 1µl T4 DNA ligase (3 Weiss units/µl) µl sản phẩm PCR Phản ứng ủ 4oC qua đêm Biến nạp sản phẩm vào E coli Tế bào JM109 High Efficiency Competent rã đông đá x phút Cho 2µl sản phẩm vector nối vào tube mới, bổ sung 50 µl tế bào rã đông Nhẹ nhàng trộn hỗn hợp đặt đá 20 phút Shock nhiệt tế bào 45-50 giây xác 42oC, khơng lắc Ủ đá phút Bổ sung 900µl mơi trường LB chuẩn bị sẵn nhiệt độ phòng Ủ 1,5 37oC có lắc nhẹ (~150rpm) Hút 100µl dung dịch sử dụng trải lên bề mặt thạch LB chuẩn bị sẵn có chứa ampicillin 100µg/ml; 0,5mM IPTG 80µg/ml X-Gal Trải mặt đĩa ni ủ 37oC qua đêm Chọn lọc khuẩn lạc quan tâm Đĩa cấy sau ủ qua đêm hình thành khuẩn lạc có màu xanh trắng Sử dụng que cấy cẩn thận thu khuẩn lạc trắng đơn lẻ cho vào 600µl mơi trường LB có chứa ampicillin 100µg/ml Tiếp tục tăng sinh 37oC Ly tâm, thu sinh khối 10 PCR kiểm tra vùng chứa đoạn chèn Cặp mồi SP6 T7 có trình tự nằm vùng promotor RNA polymerase plasmid nhằm khuếch đại phần chèn Tiến hành phản ứng PCR cặp mồi SP6/T7 (bảng 2.1) Chương trình PCR sau: chu kỳ 98oC phút, 40 chu kỳ với chu kỳ gồm bước: 98oC/10 giây, 48oC/30 giây, 72oC/20 giây chu kỳ 72oC phút Sau đó, điện di gel 2% 100V 30 phút để kiểm tra sản phẩm khuếch đại 2.8 Giải trình tự Sản phẩm PCR sau điện di gel agarose 2% TBE 0.5X Nếu kết điện di cho vạch sáng rõ, kích thước sản phẩm PCR tinh tiến hành quy trình giải trình tự Sản phẩm giải trình tự đọc hệ thống điện di mao quản ABI 3500 với thuốc thử ABI PRISM Big Dye Terminator V3.1 Cycle Sequencing Ready reaction (AB, USA) Sản phẩm giải trình tự đọc hệ thống máy giải trình tự ABI 3500 (Applied Biosystem) Kết giải trình tự phân tích phần mềm CLC Main Workbench với trình tự tham chiếu gen RASSF1A tham khảo (NM_007182.4) Xác định tồn nucleotide C bị methyl hố khơng thay đổi trình chuyển đổi gốc CpG 11 CHƯƠNG 3: CÁC KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC 3.1 Kết kiểm tra mồi in silico Các cặp mồi tham khảo kiểm tra phần mềm CLC MainWorkbench Trình tự cặp mồi thay đổi nhằm bắt cặp bổ sung với trình tự DNA xử lí bisulfite Trình tự mồi RASSF1A-qMF có chứa vị trí CpG methyl hố, vị trí đầu 3’ có chứa nucleotide Cmethyl Trình tự mồi RASF1A-qMR có chứa vị trí CpG-methyl hố, vị trí đầu 3’ có chứa nucleotide C-methyl hố, kích thước sản phẩm khuếch đại 104bp Các vị trí CpG nằm phân bố trình tự mồi, giúp mồi bắt đặc hiệu (hình 3.1) Trình tự đoạn dị RASSF1A-MP có vị trí gắn nằm vùng khuếch đại cặp mồi có chứa vị trí CpG-methyl hố (hình 3.1) Ngồi ra, trình tự mồi RASSF1A-qUF/R khơng chứa vị trí CpG methyl hố xem chứng nội kiểm sốt q trình xử lí bisulfite đại diện cho diện cfDNA mẹ với kích thước sản phẩm khuếch đại 112bp (khơng đưa hình ảnh) Các mồi kiểm tra thơng số chiều dài, nhiệt độ nóng chảy (Tm), thành phần GC, khả tạo cấu trúc kẹp tóc, khả tự bắt cặp oligonucleotide giống khả hình thành hetero-dimer phần mềm Oligo Analyzer (IDT, Hoa Kì) (bảng 3.1) Kết cho thấy cặp mồi thỏa mãn yêu cầu chiều dài, thành phần GC nhiệt độ bắt cặp Nhiệt độ bắt cặp cặp mồi chênh lệch không tới 30C Về lượng tự do, cặp mồi có lượng tự ≥ -8.22, lớn -9 kcal.mol-1 nhiều, cho thấy khả tạo cấu trúc thứ cấp khó Như vậy, nhìn chung mồi đạt tiêu chuẩn đề 12 Bảng 3.1 Kết kiểm tra đặc tính mồi đoạn dị Năng lượng tự G (kcal/mole) Tên primer Tm Chiều (oC) dài %GC Cấu 66,36 qMF 21 trúc trúc kẹp homo tóc RASSF1A- Cấu 52,4 -2.9 dimer Cấu hetero dimer -3,61 -6.91 RASSF1AqMR RASSF1AqUF 68,78 29 41,4 -1,7 -8,22 67,18 29 37,9 0,78 -4,85 -7,19 RASSF1A- 65,18 29 31 3,32 -1,47 SP6 54,79 20 30 0,54 -7,06 T7 57,97 20 40 1,08 -7.06 qUR 13 trúc -7,06 Hình 3.1: Kiểm tra cặp mồi phầm mềm CLC 3.2 Kết phản ứng MSP Các phản ứng MSP thiết lập với cặp mồi chuyên biệt Từ hình 3.2 cho thấy, giếng chứng âm (giếng cho cặp mồi RASSF1A-qUF/R giếng cho cặp mồi RASSF1A-qMF/R) không xuất vạch sản phẩm PCR, chứng tỏ phản ứng PCR không xảy nhiễm Giếng xuất vạch chứa sản phẩm khuếch đại cặp mồi RASSF1A-qUF/R có kích thước 112bp, chứng minh q trình bisulfite xảy ra, ngồi cặp mồi làm chứng nội để kiểm soát phản ứng MSP Giếng xuất vạch chứa sản phẩm khuếch đại cặp mồi RASSF1A-qMF/R kích thước 104bp, chứng tỏ phản ứng MSP khuếch đại thành cơng đoạn DNA có chứa gốc C-methyl hố Bước 14 đầu phát diện DNA thai Để khẳng định DNA thai, chúng tơi tiến hành bước tạo dịng giải trình tự sản phẩm PCR giếng Hình 3.2: Kết điện di sản phẩm PCR Giếng 1: cặp mồi RASSF1A-qMF/R + DNA nam (có xử lí bisulfite) Giếng 2: cặp mồi RASSF1A-qUF/R + DNA nam (có xử lí bisulfite) Giếng 3: cặp mồi RASSF1A-qUF/R + H2O Giếng 4: cặp mồi RASSF1A-qUF/R + cfDNA (có xử lí bisulfite) Giếng 6: cặp mồi RASSF1A-qMF/R + H2O Giếng 5: cặp mồi RASSF1A-qMF/R + cfDNA (có xử lí bisulfite) Giếng 7: cặp mồi SP6 T7 + DNA plasmid tạo dòng DNA thai Giếng 8: cặp mồi SP6 T7 + DNA plasmid tạo dòng DNA mẹ Để chứng minh sản phẩm giếng xuất phát từ DNA thai, từ mẹ hay nói cách khác chứng minh tình trạng methyl hoá vùng gen RASSF1A xảy DNA thai Chúng tiến hành thực phản ứng MSP mẫu DNA nam giới bình thường Kết cho thấy không xuất vạch sản phẩm khuếch đại cặp mồi RASSF1A-qMF/R (giếng 1), khơng có methyl hố xảy Chứng nội sử dụng cặp mồi RASSF1A-qUF/R cho sản phẩm có kích thước mong muốn 112bp (giếng 2) 15 3.3 Kết tạo dịng sản phẩm MSP Do kích thước sản phẩm PCR nhỏ (104bp 112bp) nên chèn sản phẩm PCR vào vector pGEM®T Easy, sử dụng cặp mồi có trình tự vector để đọc tồn đoạn trình tự chèn quan tâm Vector có chứa trình tự mã hố gen kháng kháng sinh ampicillin trình tự promoter T7 SP6 RNA polymerase hai bên vùng gắn chèn DNA đích, nơi có trình tự mã hoá chuỗi -peptide enzyme -galactosidase Khuẩn E coli nuôi môi trường chứa kháng sinh ampicillin, vi khuẩn có chứa vector biến nạp vào chọn lọc lại Hình 3.3: Khuẩn lạc chứa vector chèn Ngồi ra, q trình chèn vào khiến bất hoạt hình thành chuỗi -peptide, dẫn đến enzyme -galactosidase khơng cịn hoạt tính phân cắt X-Gal (tạo màu xanh) Do đó, khuẩn lạc màu trắng (mũi tên đỏ) đại diện cho nhóm có trình tự gắn chèn vào vector (hình 3.3) Khuẩn lạc trắng sử dụng phản ứng PCR khuẩn lạc Kết điện di sản phẩm gắn chèn DNA thai (giếng 7) cho kích thước 281bp sản phẩm gắn chèn DNA mẹ (giếng 8) cho kích thước 289bp (hình 3.3) 16 3.4 Kết giải trình tự xác định gốc methyl hoá vùng gene RASSF1A thai Sản phẩm chèn vào vector tiến hành giải trình tự chiều với mồi SP6 T7 nằm trình tự vector Dựa vào sóng trình tự thu nhận được, chân sóng khơng nhiễu, sóng chứa đỉnh nhất, chứng tỏ chuyển đổi bisulfite đạt hiệu suất cao Dựa vào chuỗi trình tự DNA thai (màu xanh) cho thấy tất vị trí C-methyl hố (14 vị trí) khơng bị biến đổi sau q trình bisulfite Hình 3.4: Kết giải trình tự Ngồi ra, tất vị trí C-methyl hố khơng bị biến đổi, cho thấy có methyl hố hồn tồn vùng gen RASSF1A Tuy nhiên, kết giải trình tự đại diện cho vùng nhỏ (104bp) gen RASSF1A nên chưa khẳng định số methyl hoá vùng gen RASSF1A Ngược lại, chuỗi trình tự DNA mẹ (màu đỏ) cho thấy tất vị trí bị biến đổi hồn tồn Từ đó, chúng tơi kết luận phát thành công diện DNA thai tự máu mẹ 17 Những hướng tiếp cận tập trung vào trình tự DNA tự thai mang đặc điểm ngoại di truyền khác biệt so với DNA mẹ Trong đó, methyl hố gốc CpG vùng promoter kiểm sốt q trình điều hố biểu gen đặc biệt đuợc quan tâm Một số vùng promoter gen SERPINB5, PDE9A khơng methyl hố tế bào thai lại methyl hoá nhiều tế bào máu mẹ Sự khác biệt xem đối tượng để xác định tồn cffDNA Tuy nhiên, q trình xử lí bisulfite khiến cho DNA khơng methyl hố bị thái hố tới 96% [8], hàm lượng cffDNA thai huyết tương thai phụ chiếm 8-20% tuỳ tuổi thai [17] Chính vậy, sử dụng marker khơng methyl hóa DNA thai trở thành vấn đề nan giải Trong nghiên cứu này, lựa chọn marker RASSF1A để phát diện cffDNA Marker RASSF1A thể methyl hố hồn tồn tế bào thai, cịn tế bào máu mẹ kết nghiên cứu khơng thấy có methyl hố (hình 3.3) Sự methyl hố vùng promoter gen RASSF1A cho làm ức chế biểu gen Đây gen ức chế khối u, nghiên cứu ung thư, nhiều nghiên cứu cho thấy gen RASSF1A bị methyl hoá, ngăn kiểm soát phát triển khối u [5] Sự xâm lấn thành tử cung lớp ni phơi lớp hợp bào có nhiều tương quan với trình xâm lấn mạch di ung thư, trình chuyển dạng tế bào EMT (epithelial mesenchymal transition) Nghiên cứu xác định diện DNA thai tự huyết tương máu mẹ thơng q methyl hố gen RASSF1A phương pháp MSP kết hợp tạo dòng giải trình tự Ngồi ra, tương lai ứng dụng marker RASSF1A tầm sốt nhóm máu RhD bất thường di truyền cho phép phát 18 kết âm tính giả gây hàm lượng cffDNA thấp thất thoát trình xử lí mẫu Sau chứng minh tồn DNA thai tự máu mẹ qua phương pháp giải trình tự, chúng tơi tiến hành tối ưu thêm quy trình realtime MSP (qMSP) nhằm tạo phương tiện thuận lợi cho nhóm nghiên cứu DNA thai tự máu mẹ 19 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Quy trình tạo dịng giải trình tự phát diện cffDNA huyết tương thai phụ Quy trình đóng vai trị quan trọng xét nghiệm chẩn đốn trước sinh khác như: xác định nhóm máu RhD, bệnh lí di truyền đơn gen Mục đích qui trình giúp kiểm sốt trường hợp xét nghiệm cho kết âm tính giả số nguyên nhân hàm lượng DNA thai tự q thấp, thất q trình xử lí thu nhận mẫu cfDNA Với thiết kế thí nghiệm đơn giản, cho phép phát DNA thai tự máu mẹ trường hợp kết thai nam nữ Chính vậy, xem phản ứng chứng nội chuẩn (internal control) thí nghiệm chẩn đốn di truyền trước sinh TÀI LIỆU THAM KHẢO Bischoff FZ, Lewis DE, Simpson JL (2005) Cell-free fetal DNA in maternal blood: kinetics, source and structure Hum Reprod Update 11:59–67 Chan KA, Ding C, Gerovassili A, Yeung SW, Chiu RW, Leung TN, Lau TK, Chim SS, Chung GT, Nicolaides KH (2006) Hypermethylated RASSF1A in maternal plasma: a universal fetal DNA marker that improves the reliability of noninvasive prenatal diagnosis Clin Chem 52:2211–2218 Chan KA, Zhang J, Hui AB, Wong N, Lau TK, Leung TN, Lo K-W, Huang DW, Lo YD (2004) Size distributions of maternal and fetal DNA in maternal plasma Clin Chem 50:88–92 Chim SS, Jin S, Lee TY, Lun FM, Lee WS, Chan LY, Jin Y, Yang N, Tong YK, Leung TY (2008) Systematic search for placental DNA-methylation markers on chromosome 21: toward a maternal plasma-based epigenetic test for fetal trisomy 21 Clin Chem 54:500–511 Chiu RW, Chim SS, Wong IH, Wong CS, Lee W-S, To KF, Tong JH, Yuen RK, Shum AS, Chan JK (2007) Hypermethylation of RASSF1A in human and rhesus placentas Am J Pathol 170:941–950 20 Clausen FB, Krog GR, Rieneck K, Dziegiel MH (2007) Improvement in fetal DNA extraction from maternal plasma Evaluation of the NucliSens Magnetic Extraction system and the QIAamp DSP Virus Kit in comparison with the QIAamp DNA Blood Mini Kit Prenat Diagn 27:6–10 Edlow AG, Bianchi DW (2012) Tracking fetal development through molecular analysis of maternal biofluids Biochim Biophys Acta BBA-Mol Basis Dis 1822:1970–1980 Grunau C, Clark SJ, Rosenthal A (2001) Bisulfite genomic sequencing: systematic investigation of critical experimental parameters Nucleic Acids Res 29:e65–e65 Lim JH, Kim SY, Park SY, Lee SY, Kim MJ, Han YJ, Lee SW, Chung JH, Kim MY, Yang JH (2011) Non-invasive epigenetic detection of fetal trisomy 21 in first trimester maternal plasma PLoS One 6:e27709 10 Lim JH, Park SY, Kim SY, Kim DJ, Choi JE, Kim MH, Choi JS, Kim MY, Yang JH, Ryu HM (2012) Effective detection of fetal sex using circulating fetal DNA in first-trimester maternal plasma FASEB J 26:250–258 11 Lo YD, Corbetta N, Chamberlain PF, Rai V, Sargent IL, Redman CW, Wainscoat JS (1997) Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum The lancet 350:485–487 12 Lo YD, Tein MS, Lau TK, Haines CJ, Leung TN, Poon PM, Wainscoat JS, Johnson PJ, Chang AM, Hjelm NM (1998) Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: implications for noninvasive prenatal diagnosis Am J Hum Genet 62:768– 775 13 Lo YD, Zhang J, Leung TN, Lau TK, Chang AM, Hjelm NM (1999) Rapid clearance of fetal DNA from maternal plasma Am J Hum Genet 64:218–224 14 Mandel P (1948) Les acides nucleiques du plasma sanguin chez l’homme CR Acad Sci Paris 142:241–243 15 Manegold-Brauer G, Hahn S, Lapaire O (2014) What does next-generation sequencing mean for prenatal diagnosis? Biomark Med 8:499–508 16 Nygren AO, Dean J, Jensen TJ, Kruse S, Kwong W, van den Boom D, Ehrich M (2010) Quantification of fetal DNA by use of methylation-based DNA discrimination Clin Chem 56:1627–1635 17 Suzumori N, Ebara T, Yamada T, Samura O, Yotsumoto J, Nishiyama M, Miura K, Sawai H, Murotsuki J, Kitagawa M (2016) Fetal cell-free DNA fraction in maternal plasma is affected by fetal trisomy J Hum Genet 61:647 21 ... gian thực hiện: Tháng 6-2018 đến tháng 5-2019 Mục tiêu: xác định diện dna thai tự máu mẹ kỹ thuật MSP kết hợp tạo dịng giải trình tự Nội dung chính: - Tạo dịng kết hợp giải trình tự nhận diện điểm... MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT (TĨM TẮT) ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG XÁC ĐỊNH SỰ HIỆN DIỆN CỦA DNA THAI TỰ DO TRONG MÁU MẸ BẰNG KỸ THUẬT MSP KẾT HỢP TẠO DỊNG GIẢI TRÌNH TỰ Mã số: Chủ nhiệm... nghiệm trước sinh cfDNA thai tự máu mẹ .1 1.1.1 Đặc điểm DNA thai tự máu mẹ 1.1.2 Tách chiết cfDNA từ huyết tương thai phụ 1.2 Xác định diện cffDNA huyết tương thai phụ .2 CHƯƠNG