Nghiên cứu mô tả cắt ngang. Tách chiết cfDNA (DNA tự do) từ mẫu huyết tương của thai phụ. Bài viết trình bày việc ác định sự hiện diện của cffDNA thông qua sự khác biệt trạng thái methyl hóa vùng promoter gen RASSF1A.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 XÁC ĐỊNH SỰ HIỆN DIỆN DNA THAI TỰ DO TRONG MÁU MẸ BẰNG KỸ THUẬT MSP KẾT HỢP TẠO DỊNG GIẢI TRÌNH TỰ Lương Bắc An*,***, Lê Thị Xuân Thảo*, Nguyễn Khắc Hân Hoan**, Lê Quang Thanh**, Đỗ Thị Thanh Thủy* TÓM TẮT Mở đầu: Phân tích DNA thai tự (cffDNA) máu mẹ khơng hữu ích sàng lọc tiền sản không xâm lấn (NIPS) số bất thường lệch nhiễm sắc thể T21, T18, T13 mà hữu ích tầm sốt số bất thường liên kết giới tính, nhóm máu rhesus D (RhD), -thalassemia, tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh, loạn dưỡng Tất xét nghiệm tập trung vào phát trình tự bất thường thai nhi di truyền từ bố mẹ Thai nhi có thừa hưởng trình tự bất thường hay khơng xác định cách phân tích cffDNA huyết tương thai phụ Tuy nhiên, kết không phát trình tự bất thường bị tác động yếu tố hàm lượng cffDNA thấp cffDNA bị thối hố thất q trình xử lí mẫu Chính vậy, cần có dấu ấn xác định diện cffDNA huyết tương thai phụ cho phép kiểm soát trường hợp âm tính giả Mục tiêu: Xác định diện cffDNA thông qua khác biệt trạng thái methyl hố vùng promoter gen RASSF1A Phương pháp: Nghiên cứu mơ tả cắt ngang Tách chiết cfDNA (DNA tự do) từ mẫu huyết tương thai phụ Mẫu cfDNA xử lí bisulfite trước thực phản ứng methylation specific PCR (MSP) để phát cffDNA máu mẹ Tạo dòng trình tự DNA thai DNA mẹ vào vector Giải trình tự xác định vị trí C-methyl hoá DNA thai Kết quả: Phát diện cffDNA máu mẹ thông qua methyl hố promoter gen RASSF1A Tạo dòng thành cơng vector chứa trình tự DNA thai vector chứa trình tự DNA mẹ Kết giải trình tự cho thấy tồn 14 vị trí C-methyl hố vùng trình tự DNA thai trạng thái methyl hoá Kết luận: Methyl hoá vùng promoter gen RASSF1A xem dấu ấn để phát tồn cffDNA Dấu ấn cho phép phát kết âm tính giả sàng lọc khơng xâm lấn sử dụng cffDNA để phân tích Từ khóa: Methylation, RASSF1A, methylation specific PCR (MSP), cfDNA, cffDNA ABTRACTS IDENTIFICATION THE CIRCULATING FREE FETUS DNA IN MATERNAL BLOOD BY USING MSP COMBINES CLONING AND SEQUENCING TECHINIQUES Luong Bac An, Le Thi Xuan Thao, Nguyen Khac Han Hoan, Le Quang Thanh, Do Thi Thanh Thuy Ho Chi Minh City Journal of Medicine *Vol 22 - No 4- 2018: 367 – 374 Introduction: Circulating fetal DNA analysis in maternal plasma is useful in the non-invasive prenatal screening (NIPS) not only the detection of aneuplodies but also identification of sex-linked disorders, fetal rhesus D (RhD), B-thalassemia and aneuplodies Many of these applications focus on the detection of paternally inherited disease-causing sequences in maternal plasma Whether the fetus has inherited such a sequence is inferred by the * Đại học Y Dược TP HCM, ** Bệnh viện Từ Dũ Tp HCM, *** Đại học Khoa Học Tự Nhiên-Tp.HCM Tác giả liên lạc: CN Lương Bắc An ĐT: 0933.908.241 Email: luongbacan1991@gmail.com 368 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học presence or absence of the target sequence in maternal plasma, but the absence of such a sequence in maternal plasma could alternatively be a result of low cffDNA concentrations or cffDNA loss during samples processing Thus, the availability of a positive control confirming the presence of fetal DNA in the sample would be avoided false-negative results Objectives: Identification of cffDNa in maternal blood through differently methylation status of RASSF1A promoter Methods: A cross-sectional study CfDNA were extracted, then were treated bisulfate MSP was carried out to detect cffDNA in maternal plasma Cloning and sequencing the MSP products to identify the C-methylation bases Results: we identified the presentation of fetal DNA in maternal blood through methylation of RASSF1A promoter We have successfully cloned the fetal DNA and maternal DNA into vector All 14 CpG sites was absolute methylation in fetal DNA sequence Conclusions: Hypermethylation RASSF1A is a universal marker for fetal DNA and is readily detectable in maternal plasma This marker allows the detection of false-negative results when applied to NIPS Key words: Methylation, RASSF1A, methylation specific PCR (MSP), cfDNA, NIPS ĐẶT VẤN ĐỀ Sự diện DNA thai tự (cffDNA) máu mẹ mở cách mạng sàng lọc tiền sản không xâm lấn (NIPS) DNA tự (cfDNA) đoạn DNA nhỏ, tồn máu thai phụ CfDNA có nguồn gốc từ tế bào chết, bị vỡ giải phóng cfDNA vào hệ tuần hoàn Các cfDNA bắt nguồn từ máu thai phụ (tế bào mô mỡ tế bào máu) từ thai nhi (tế bào thai) Năm 1997, Lo cộng chứng minh cffDNA tồn suốt thai kỳ(5) Các nghiên cứu cffDNA tìm thấy vào tuần thứ thai kỳ hàm lượng cffDNA tăng dần theo phát triển thai, dao động từ 3-13% tổng số cfDNA huyết tương thai phụ tùy theo tuổi thai(8) CffDNA giảm nhanh chóng sau sinh biến hồn tồn khoảng sau sinh(6) Đâặc tính hữu ích chẩn đốn thai kỳ tránh nhầm lẫn với thai kỳ trước Năm 1998, Lo cộng công bố tách chiết lượng cffDNA cao máu thai phụ: 3,4 đến 6,2%, cao khoảng 25 lần so với sử dụng tế bào thai nhi nguyên vẹn lượng huyết tương mẹ(6) Trong thập kỷ qua, tiềm ứng dụng lâm sàng cffDNA thể kỹ thuật sàng lọc tiền sản không xâm lấn (NIPS) số bất thường lệch bội nhiễm sắc thể T21, T18, T1, cffDNA sử dụng để xác định nhóm máu rhesus D (RHD) thai nhi, bệnh lí liên kết với giới tính, - thalassemia, rối loạn dưỡng cơ, tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh,…Ngoài ra, hàm lượng cffDNA sử dụng xác định số bất thường tiền sản khác tiền sản giật, hay số bất thường thai(8) Một thách thức lớn phát triển xét nghiệm NIPS hàm lượng cffDNA máu mẹ dao động khoảng 3-13% tuỳ thuộc vào tuổi thai(2) Để phân biệt cffDNA cfDNA thai phụ, ngưới ta thường dựa đặc điểm di truyền học hoàn toàn khác biệt mẹ thai, diện gen nhiễm sắc thể (NST) Y điểm đa hình cffDNA thừa hưởng từ người bố có khác biệt so với gen người mẹ(4,9) Rất nhiều phương pháp sàng lọc phát triển từ sớm dựa vào đặc điểm cffDNA, nhiên kèm theo hạn chế định Đầu tiên, xét nghiệm sàng lọc phát triển 369 Nghiên cứu Y học dựa diện NST Y áp dụng trường hợp thai nam Ngoài ra, kết âm tính cần kiểm tra lại để loại trừ khả mang thai nữ hàm lượng cffDNA thấp ngưỡng phát thiết bị, chí thất cffDNA q trình thu nhận xử lí Thứ hai, phát dựa vào đặc điểm đa hình thừa hưởng từ bố u cầu phải có thêm thơng tin liệu di truyền từ cha áp dụng với số lượng nhỏ đối tượng có điểm đa hình đặc trưng Vì vậy, điều cần thiết cần phải nghiên cứu marker phản ánh khác biệt DNA thai DNA mẹ Các marker khơng phụ thuộc vào giới tính thai nhi hay liệu di truyền từ bố Trong đó, khác biệt ngoại di truyền DNA thai DNA mẹ lĩnh vực thu hút nhiều ý Trong đó, số gen methyl hố hồn tồn DNA mẹ khơng methyl hố tế bào thai gen PDE9A, SERPINB5(7) Tuy nhiên, có gen có trạng thái methyl hố hồn tồn ngược lại Trong nghiên cứu này, sử dụng methyl hoá vùng promoter gen RASSF1A để chứng minh tồn cffDNA huyết tương thai phụ ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Thiết kế nghiên cứu Mô tả cắt ngang Phương pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu thai phụ Bệnh viện Từ Dũ thời gian từ tháng 10/2017 đến Bảng Trình tự mồi sử dụng nghiên cứu Tên primer RASSF1A-qMF RASSF1A-qMF RASSF1A-qUF RASSF1A-qUR SP6 T7 370 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 tháng 5/2018 Nghiên cứu sử dụng ống Streck BCT để thu nhận mẫu máu Thai phụ lấy 10ml máu chứa ống Streck BCT, đảo ống 180o khoảng 10 lần để máu trộn với chất bảo quản bên ống Nếu chưa xử lý kịp thời, lưu mẫu nhiệt độ phòng (18oC-25oC) vòng 14 ngày Li tâm ống máu với tốc độ 1.600 rpm 10 phút nhiệt độ phòng Sau nhẹ nhàng hút lớp huyết tương phía trên, ý khơng chạm phần buffy coat Li tâm lần huyết tương vừa thu với tốc độ 13.000 rpm 10 phút, 4oC, thu dịch Mẫu huyết tương trữ tủ -80oC Mẫu huyết tương sau tách chiết kít QIAamp Circulating Nucleic acid (QIAgen) CfDNA thu trữ -30oC sẵn sàng để tiến hành bước phân tích Nghiên cứu thực Trung tâm Y Sinh học Phân tử - Đại học Y Dược TP HCM Kiểm tra mồi Cặp mồi cho phản ứng MSP tham khảo theo nghiên cứu Dennis Lo cộng sự(1) Mồi RASSF1A-qMF/R có đầu 3’ thiết kế bắt cặp bổ sung đặc hiệu vị trí C-methyl hố, giúp khuếch đại xác đoạn DNA bị methyl hố Mồi RASSF1A-qUF/R có đầu 3’ thiết kế bắt cặp bổ sung đặc hiệu vị trí Ckhơng methyl hố Các cặp mồi chúng tơi kiểm tra khả bắt cặp phần mềm CLC MainWorkbench (QIA) Nhiệt độ nóng chảy (Tm) kiểm tra Tm Tool (https://www.dna.utah.edu/tm/tool.html) Trình tự (5’-3’) CGTGTTAACGCGTTGCGTATC TACGTAACAAACCCCACGAAGTAAAAACG GGTTGGAGTGTGTTAATGTGTTGTGTATT TACATAACAAACCCCACAAACTAAAAACA TAAATCCACTGTGATATCTT ATTATGCTGAGTGATATCCC o Tm ( C) 66,36 68,78 67,18 65,18 54,79 57,97 Kích thước PCR (bp) 104 112 Tuỳ thuộc đoạn chèn Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 Biến đổi gốc CpG cfDNA CfDNA tiến hành xử lí với sodium bisulfite để biến đổi toàn vị trí Cytosine (C-) khơng methyl hố Dưới tác dụng sodium bisulfite tất vị trí C- khơng methyl hố chuyển hố thành uracil C-methyl hố khơng bị biến đổi Kết thúc qui trình, trình tự DNA có thay đổi, điều phụ thuộc vào tình trạng methyl hố vị trí cystosine Chúng tơi tiến hành chuyển đổi trình tự cfDNA thu kít EZ DNA Methylation-Direct TM kit (Zymo Research) Bộ kít EZ DNA Methylation-Direct TM có chứa sodium bisulfite có tác dụng chuyển đổi gốc cytosine chưa methyl hóa thành gốc uracil, gốc cytosine methyl hóa giữ ngun Vì vậy, phân biệt cffDNA huyết tương mẹ Quy trình tiến hành theo hướng dẫn nhà sản xuất Phản ứng MSP (Methylation Specific PCR) Phản ứng MSP thiết lập để khuếch đại đoạn DNA chứa gốc CpG methyl hoá (DNA thai) cặp mồi RASSF1A-qMF/R Tương tự, phản ứng MSP thiết lập để khuếch đại đoạn DNA chứa gốc CpG không methyl hố (DNA mẹ) cặp mồi RASSF1A-qUF/R Ngồi ra, để chứng minh độ đặc hiệu cặp mồi RASSF1A-qMF/R, thực phản ứng MSP với mẫu DNA nam giới Thành phần phản ứng MSP (bảng 2) Bảng Thành phần phản ứng MSP Thành phần Thể tích (µl) Nồng độ phản ứng 10X Maxima Buffer 1,5 1X dNTPs 250nm 1,2 20 nM Primer F (10µM) 0,75 500 nM Primer R (10µM) 0,75 500 nM 2+ Mg 1,5 Maxima Taq 0,12 DNA 10-30 ng H2O 5,18 Vừa đủ 15 µl Chu trình ln nhiệt cho PCR thực máy Mastercycler@Pro S (Eppendorf, Đức) Chu kì nhiệt: khởi đầu 95oC phút; với 45 chu kì lặp lại bước 95oC 20 Nghiên cứu Y học giây, 58 oC 20 giây, 72oC 20 giây; với bước nhiệt 72oC phút Sản phẩm giữ 4oC sau chương trình PCR kết thúc Kiểm tra sản phẩm PCR điện di thạch agarose 2% có thuốc nhuộm GelRed quan sát với hệ thống chụp ảnh điện di GelDocItTM (UVP, Mỹ) Tạo dòng sản phẩm PCR Chúng tơi sử dụng hệ thống pGEM®T Easy vector với quy trình theo hướng dẫn nhà sản xuất Vector pGEM®T Easy có chứa vùng trình tự promoter T7 SP6 RNA polymerase hai bên vùng gắn chèn DNA đích Quy trình tóm tắt với bước: Bước 1: Nối sản phẩm PCR với hệ thống vector Phản ứng nối thiết lập phản ứng gồm: 5µl 2X Rapid ligation buffer; 1µl pGEM T Vector (50ng); 1µl T4 DNA ligase (3 Weiss units/µl) µl sản phẩm PCR Phản ứng ủ 4oC qua đêm Bước 2: Biến nạp vector vào E coli Rã đông tế bào JM109 High Efficiency Competent đá phút; trộn 2µl sản phẩm vector nối với 50 µl tế bào rã đơng; nhẹ nhàng trộn hỗn hợp đặt đá 20 phút; shock nhiệt tế bào 45-50 giây xác 42oC, không lắc; ủ đá phút; bổ sung 900µl mơi trường LB chuẩn bị sẵn nhiệt độ phòng; ủ tiếp 1,5 37oC có lắc nhẹ (~150rpm); hút 100µl dung dịch sử dụng trải lên bề mặt thạch LB chuẩn bị sẵn có chứa ampicillin 100µg/ml, 0,5mM IPTG 80µg/ml X-Gal; trải mặt đĩa nuôi ủ 37oC qua đêm Bước 3: Chọn lọc khuẩn lạc quan tâm Đĩa cấy sau ủ qua đêm hình thành khuẩn lạc có màu xanh trắng Sử dụng que cấy cẩn thận thu khuẩn lạc trắng đơn lẻ cho vào 600µl mơi trường LB có chứa ampicillin 100µg/ml Tiếp tục tăng sinh 37oC Ly tâm, thu sinh khối 371 Nghiên cứu Y học Bước 4: PCR kiểm tra vùng chứa đoạn chèn Sử dụng cặp mồi SP6 T7 có trình tự nằm vùng promotor RNA polymerase vector Bảng 3: Thành phần phản ứng PCR khuẩn lạc Thành phần Thể tích Nồng độ (µl) phản ứng 10X Maxima Buffer 1,5 1X dNTPs 250nm 1,2 20 nM Primer RASSF1A-Qmf (10µM) 0,75 500 nM Primer RASSF1A-qMR (10µM) 0,75 500 nM 2+ Mg 1,5 Maxima Taq 0,12 DNA plasmid 50-100 ng H2O 8,18 Vừa đủ 15 µl Tiến hành phản ứng PCR cặp mồi SP6/T7 (bảng 1) Chương trình PCR sau: chu kỳ 95oC phút, 40 chu kỳ với chu kỳ gồm bước: 95oC/20 giây, 48oC/20 giây, 72oC/20 giây chu kỳ 72oC phút Sau đó, điện di gel 2% 100V 30 phút để kiểm tra sản phẩm khuếch đại Giải trình tự Nếu kết điện di cho vạch sáng rõ, kích thước sản phẩm PCR tinh kít ExoSAP IT express PCR product cleanup (AB, USA) Sản phẩm giải trình tự chiều (xuôi ngược) với mồi SP6 T7 Sản phẩm giải trình tự đọc hệ thống điện di mao quản ABI 3500 với thuốc thử ABI PRISM Big Dye Terminator V3.1 Cycle Sequencing Ready reaction (AB, USA) Kết giải trình tự phân tích phần mềm CLC Main Workbench với trình tự tham chiếu gen RASSF1A tham khảo (NM_007182.4) Xác định tồn nucleotide C bị methyl hố khơng thay đổi trình chuyển đổi gốc CpG KẾT QUẢ Đánh giá hiệu cặp mồi Các cặp mồi tham khảo kiểm tra phần mềm CLC MainWorkbench Trình tự cặp mồi thay đổi nhằm bắt cặp bổ sung với trình tự DNA xử lí bisulfite Trình tự mồi RASSF1A-qMF có chứa vị trí CpG 372 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 methyl hố, vị trí đầu 3’ có chứa nucleotide C-methyl Trình tự mồi RASF1A-qMR có chứa vị trí CpG-methyl hố, vị trí đầu 3’ có chứa nucleotide C-methyl hố, kích thước sản phẩm khuếch đại 104bp Các vị trí CpG nằm phân bố trình tự mồi, giúp mồi bắt đặc hiệu (hình 3) Ngồi ra, trình tự mồi RASSF1A-qUF/R khơng có chứa vị trí CpG methyl hố xem chứng nội kiểm sốt q trình xử lí bisulfite đại diện cho diện cfDNA mẹ với kích thước sản phẩm khuếch đại 112bp Nhiệt độ nóng chảy (Tm) mồi xi ngược tương đương (bảng1) Kết phản ứng MSP Các phản ứng MSP thiết lập với cặp mồi chuyên biệt Từ hình cho thấy, giếng chứng âm (giếng cho cặp mồi RASSF1AqUF/R giếng cho cặp mồi RASSF1A-qMF/R) không xuất vạch sản phẩm PCR, chứng tỏ phản ứng PCR không xảy nhiễm Giếng xuất vạch chứa sản phẩm khuếch đại cặp mồi RASSF1A-qUF/R có kích thước 112bp, chứng minh q trình bisulfite xảy ra, cặp mồi làm chứng nội để kiểm soát phản ứng MSP Giếng xuất vạch chứa sản phẩm khuếch đại cặp mồi RASSF1A-qMF/R kích thước 104bp, chứng tỏ phản ứng MSP khuếch đại thành công đoạn DNA có chứa gốc C-methyl hố Bước đầu phát diện DNA thai Để khẳng định DNA thai, chúng tơi tiến hành bước tạo dòng giải trình tự sản phẩm PCR giếng Để chứng minh sản phẩm giếng xuất phát từ DNA thai, khơng phải từ mẹ hay nói cách khác chứng minh tình trạng methyl hố vùng promoter gen RASSF1A xảy DNA thai Chúng tiến hành thực phản ứng MSP mẫu DNA nam giới bình thường Kết cho thấy khơng xuất vạch sản phẩm khuếch đại cặp mồi RASSF1A-qMF/R (giếng 1), khơng có methyl hoá xảy Chứng nội sử dụng cặp mồi RASSF1A-qUF/R cho sản phẩm có kích thước mong muốn 112bp (giếng 2) Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 Kết tạo dòng sản phẩm MSP Do kích thước sản phẩm PCR nhỏ (104bp 112bp) nên chèn sản phẩm MSP vào vector pGEM®T Easy, sử dụng cặp mồi có trình tự vector để đọc tồn đoạn trình tự chèn quan tâm Vector có chứa trình tự mã hố gen kháng kháng sinh ampicillin trình tự promoter T7 SP6 RNA polymerase hai bên vùng gắn chèn DNA đích, nơi có trình tự mã hố chuỗi -peptide enzyme galactosidase Khuẩn E coli nuôi môi trường chứa kháng sinh ampicillin, vi khuẩn có chứa vector biến nạp vào chọn lọc lại Ngồi ra, q trình chèn vào khiến bất hoạt hình thành chuỗi -peptide, dẫn đến enzyme galactosidase khơng hoạt tính phân cắt X-Gal (tạo màu xanh) Do đó, khuẩn lạc màu trắng (mũi tên đỏ) đại diện cho nhóm có trình tự gắn chèn vào vector (hình 2) Khuẩn lạc trắng sử dụng phản ứng PCR khuẩn lạc Kết điện di sản phẩm gắn chèn DNA thai (giếng 7) cho kích thước 281bp sản phẩm gắn chèn DNA mẹ (giếng 8) cho kích thước 289bp (hình 1) Kết giải trình tự Sản phẩm chèn vào vector tiến hành giải trình tự chiều với mồi SP6 T7 nằm trình tự vector Dựa vào sóng trình tự thu nhận được, chân sóng khơng nhiễu, sóng chứa đỉnh nhất, chứng tỏ chuyển đổi bisulfite đạt hiệu suất cao Dựa vào chuỗi trình tự DNA thai (màu xanh) cho thấy tất vị trí Cmethyl hố (14 vị trí) khơng bị biến đổi sau q trình bisulfite Ngồi ra, tất vị trí C-methyl hố khơng bị biến đổi, cho thấy có methyl hố hồn tồn vùng gen RASSF1A Tuy nhiên, kết giải trình tự đại diện cho vùng nhỏ (104bp) promoter gen RASSF1A nên chưa khẳng định số methyl hoá vùng promoter gen RASSF1A Nghiên cứu Y học Ngược lại, chuỗi trình tự DNA mẹ (màu đỏ) cho thấy tất vị trí bị biến đổi hồn tồn Từ đó, kết luận phát thành công diện DNA thai tự máu mẹ (hình 3) Hình 1: - Giếng 1: mồi RASSF1A-qMF/R + DNA nam; - Giếng 2: mồi RASSF1A-qUF/R DNA nam; - Giếng 6: chứng âm cặp mồi RASSF1A-qUF/R RASSF1A-qMF/R; - Giếng 4: mồi RASSF1A-qUF/R; - Giếng 5: mồi RASSF1A-qMF/R, - Giếng sản phẩm tạo dòng DNA thai DNA mẹ Hình 2: Kết khuẩn lạc chứa vector chèn 373 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 Hình 3: Kết giải trình tự nghiệm sàng lọc hay kiểm tra diện số BÀN LUẬN lượng cffDNA Sự diện DNA thai tự huyết Những hướng tiếp cận tập trung vào tương thai phụ đặc biệt hữu ích sàng lọc trình tự DNA tự thai mang đặc điểm tiền sản số hội chứng di truyền liên quan ngoại di truyền khác biệt so với DNA mẹ Trong tới NST giới tính, nhóm máu RhD đó, methyl hố gốc CpG vùng thalassemia Hầu hết ứng dụng tập promoter kiểm sốt q trình điều hố biểu trung vào phát trình tự gây bệnh di gen đặc biệt đuợc quan tâm Một số vùng truyền từ bố mẹ huyết tương thai phụ Liệu promoter gen SERPINB5, PDE9A khơng thai nhi có thừa hưởng trình tự gây bệnh methyl hố tế bào thai lại hay không chứng minh có tồn methyl hố nhiều tế bào máu mẹ Sự trình tự bất thường huyết tương thai khác biệt xem đối tượng để xác định phụ, vắng mặt trình tự đơi tồn cffDNA Tuy nhiên, q trình xử lí lúc bị thay đổi hàm lượng cffDNA bisulfite khiến cho DNA không methyl thấp cffDNA bị thất q trình xử hố bị thái hố tới 96%(3), hàm lí mẫu Do vậy, cần phải có bước xác định lượng cffDNA thai huyết tương thai phụ diện DNA tự thai trước trả kết chiếm 8-20% tuỳ tuổi thai(8) Chính vậy, sử cho bệnh nhân âm tính với bệnh lý khảo dụng marker khơng methyl hóa DNA sát Một số trình tự đặc trưng NST Y, thai trở thành vấn đề nan giải gen SRY hay DYS14, sử dụng để xác Trong nghiên cứu này, lựa chọn nhận diện cffDNA Tuy nhiên, marker RASSF1A để phát diện marker áp dụng trường hợp thai cffDNA Marker RASSF1A thể nam Một số yếu tố khác áp dụng sử methyl hố hồn tồn tế bào thai, dụng điểm đa hình di truyền từ bố mẹ, tế bào máu mẹ kết nghiên cứu bất lợi xảy liệu di khơng thấy có methyl hố (hình 3) truyền từ người bố khơng sẵn có; liệu di truyền người mẹ cần phải thực thêm xét nghiệm khác để có Những marker DNA thai, với đặc trưng độc lập với giới tính thai khơng phụ thuộc vào đa hình di truyền từ bố mẹ, sử dụng xét 374 Sự methyl hoá vùng promoter gen RASSF1A cho làm ức chế biểu gen Đây gen ức chế khối u, nghiên cứu ung thư, nhiều nghiên cứu cho thấy gen RASSF1A bị methyl hoá, ngăn kiểm sốt phát Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học triển khối u(1) Sự xâm lấn thành tử cung lớp ni phơi lớp hợp bào có nhiều tương quan với trình xâm lấn mạch di ung thư, trình chuyển dạng tế bào EMT (epithelial mesenchymal transition) Nghiên cứu xác định diện DNA thai tự huyết tương máu mẹ thơng q methyl hố gen RASSF1A phương pháp MSP kết hợp tạo dòng giải trình tự Ngồi ra, tương lai ứng dụng marker RASSF1A sàng lọc nhóm máu RhD bất thường di truyền cho phép phát kết âm tính giả gây hàm lượng cffDNA thấp thất q trình xử lí mẫu KẾT LUẬN Nghiên cứu khuếch đại thành cơng cffDNA máu mẹ, tạo dòng đoạn DNA thai DNA mẹ vào vector chứng minh diện cffDNA máu mẹ phương pháp giải trình tự Sanger TÀI LIỆU THAM KHẢO Dar P, Curnow KJ., Gross SJ et al (2014) Clinical experience and follow-up with large scale single-nucleotide polymorphismebased noninvasive prenatal aneuploidy testing Am J Obstet Gynecol, 211(5):527.e1-527.e17 Grunau C., Clark SJ., and Rosenthal A (2001) Bisulfite genomic sequencing: systematic investigation of critical experimental parameters Nucleic Acids Res, 29(13), e65–e65 Lo YD., Chan KA., Sun H et al (2010) Maternal plasma DNA sequencing reveals the genome-wide genetic and mutational profile of the fetus Sci Transl Med, 2(61), 61ra91–61ra91 Lo YD., Corbetta N., Chamberlain PF et al (1997) Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum The lancet, 350(9076), 485–487 Lo YD., Zhang J., Leung TN et al (1999) Rapid clearance of fetal DNA from maternal plasma Am J Hum Genet, 64(1), 218–224 Poon LL., Leung TN., Lau TK et al (2002) Differential DNA methylation between fetus and mother as a strategy for detecting fetal DNA in maternal plasma Clin Chem, 48(1), 35–41 Suzumori N, Ebara T, Yamada T et al (2016) Fetal cell-free DNA fraction in maternal plasma is affected by fetal trisomy J Hum Genet, 61(7), 647 Zimmermann B, El-Sheikhah A, Nicolaides K et al (2005) Optimized real-time quantitative PCR measurement of male fetal DNA in maternal plasma Clin Chem, 51(9), 1598–1604 Ngày nhận báo: 21/06/2018 Ngày phản biện nhận xét báo: 21/06/2018 Ngày báo đăng: 30/06/2018 Chiu RW., Chim SS., Wong IH et al (2007) Hypermethylation of RASSF1A in human and rhesus placentas Am J Pathol, 170(3), 941–950 375 ... specific PCR (MSP) , cfDNA, NIPS ĐẶT VẤN ĐỀ Sự diện DNA thai tự (cffDNA) máu mẹ mở cách mạng sàng lọc tiền sản không xâm lấn (NIPS) DNA tự (cfDNA) đoạn DNA nhỏ, tồn máu thai phụ CfDNA có nguồn... kết âm tính giả gây hàm lượng cffDNA thấp thất thoát trình xử lí mẫu KẾT LUẬN Nghiên cứu khuếch đại thành cơng cffDNA máu mẹ, tạo dòng đoạn DNA thai DNA mẹ vào vector chứng minh diện cffDNA máu. .. cứu xác định diện DNA thai tự huyết tương máu mẹ thông methyl hoá gen RASSF1A phương pháp MSP kết hợp tạo dòng giải trình tự Ngồi ra, tương lai ứng dụng marker RASSF1A sàng lọc nhóm máu RhD bất