Hội chứng đa polyp tuyến gia đình (Familial adenomatous polyposis-FAP) là bệnh di truyền đặc trưng bởi sự hiện diện rất nhiều polyp tuyến ở đại tràng, thường trên 100 polyp. Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự xác định các SNP ở gen APC trên bệnh nhân FAP.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 21 * Số * 2017 Nghiên cứu Y học XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH ĐƠN NUCLEOTIDE (SNP) CỦA GEN APC Ở BỆNH NHÂN MẮC BỆNH ĐA POLYP TUYẾN GIA ĐÌNH Nguyễn Thị Băng Sương*,**, Nguyễn Hữu Huy**, Lê Minh Khôi *,**, Nguyễn Trung Tín*,**, Nguyễn Hồng Bắc*,** TĨM TẮT Mở đầu: Hội chứng đa polyp tuyến gia đình (Familial adenomatous polyposis-FAP) bệnh di truyền đặc trưng diện nhiều polyp tuyến đại tràng, thường 100 polyp Theo Sheng cộng sự, 100% bệnh nhân FAP không điều trị dẫn đến ung thư đại tràng tuổi 35-40 Nguyên nhân gây nên FAP xác định đột biến gen APC Các đa hình gen APC nhạy cảm với ung thu Tuy nhiên mối liên hệ đa hình gen APC nguy ung thư đại trực tràng chưa biết rõ Mục tiêu: Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự xác định SNP gen APC bệnh nhân FAP Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu: 63 bệnh nhân có triệu chứng đa polyp tham gia nghiên cứu Chúng tơi sử dụng kỹ thuật giải trình tự để phát SNP gen APC Kết quả: Trong nghiên cứu này, chúng tơi tìm thấy 10 SNP gen APC Trong 7/10 SNP khơng làm thay đổi acid amin nên SNP không làm thay đổi kiểu hình Tuy nhiên, có SNP có ảnh hưởng làm thay đổi acid amin SNP rs201764637 (p.Arg106His), SNP rs459552 (p.Val1822Asp) SNP rs534228737 (p.Ile2231Phe) Trong số đó, SNP rs534228737 (p.Ile2231Phe) có nguy cao gây ung thư đại trực tràng Kết luận: Chúng phát SNP làm thay đổi acid amin SNP rs201764637 (p.Arg106His), SNP rs459552 (p.Val1822Asp) SNP rs534228737 (p.Ile2231Phe) Vai trò SNP cần làm rõ qua nghiên cứu Từ khoá: FAP, gen APC, SNP, giải trình tự ABSTRACT MOLECULAR DIAGNOSIS OF FAMILIAL ADENOMATOUS POLYPOSIS (FAP) Nguyen Thi Bang Suong, Nguyen Huu Huy, Le Minh Khoi, Nguyen Trung Tin, Nguyen Hoang Bac * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 21 - No - 2017: 115 - 119 Background: Familial adenomatous polyposis-FAP is an inherited disorder characterized by the presence lot of adenomatous polyps in the colon, usually over 100 polyps According to Sheng et al, 100% of patients with untreated FAP will lead to colon cancer at the age of 35-40 FAP is caused by germline mutations in APC genes Adenomatous polyposis coli (APC) gene polymorphisms are believed to contribute to tumor susceptibility However, the association between single-nucleotide polymorphisms (SNP) in the APC gene and colorectal cancer (CRC) susceptibility remains unknown Objective: Applying sequencing methods to detect SNPs of APC gene in FAP patients Materials and Methods: 63 polyposis patients were recruited in the research We use the sequencing method to detect SNPs in APC genes Results: In this study, we found 10 SNPs in the APC gene of 10 SNPs not change the amino acid * Đại học Y Dược TP.HCM, ** Bệnh viện Đại học Y Dược TPHCM Tác giả liên lạc: TS.BS Nguyễn Thị Băng Sương ĐT:0914007038 Email: suongnguyenmd@gmail.com 115 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 21 * Số * 2017 sequence of a protein so there is no significant change in phenotype However, there are SNPs that change amino acid: SNP rs201764637 (p.Arg106His), SNP rs459552 (p.Val1822Asp) and SNP rs534228737 (p.Ile2231Phe) Among them, SNP rs534228737 (p.Ile2231Phe) is associated with a high risk of colorectal cancer Conclusion: We detected three SNPs that change amino acid: SNP rs201764637 (p.Arg106His), SNP rs459552 (p.Val1822Asp) and SNP rs534228737 (p.Ile2231Phe) Their role should be clarified through further research Key words: FAP, APC gene, SNP, sequencing ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh đa polyp tuyến gia đình (hereditary familial adenomatous polyposis: FAP) bệnh rối loạn di truyền trội(6) Đa polyp tuyến gia đình đặc trưng phát sinh hàng trăm đến hàng ngàn polyp đại trực tràng, hầu hết tuổi vị thành niên(6,7) Triệu chứng FAP tiêu chảy có máu phân(6) Bệnh xảy với tần suất 1/8300 trẻ sinh sống(2) có nguy cao dẫn đến ung thư đại trực tràng, gần 100% bệnh nhân bị K hóa trước 40 tuổi không điều trị sớm(1) báo cáo(3,2) Xuất phát từ thực tiễn đó, chúng tơi tiến hành đề tài với mục tiêu: “Xác định đa hình đơn nucleotide (SNP) gen APC bệnh nhân mắc bệnh đa polyp tuyến gia đình” ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Đối tượng nghiên cứu Đây bệnh gặp, tỷ lệ mắc bệnh khoảng 1/10.000-1/6000, thời gian năm nghiên cứu, thực nghiên cứu 63 bệnh nhân mắc bệnh đa polyp gia đình Phương pháp nghiên cứu Bệnh có liên quan mật thiết đến đột biến dòng mầm gen ức chế khối u APC (tumor - supressor adenomatous polyposis coligen: APC) nằm vị trí 5q21-q22(4,6) Gen APC gen ức chế khối u cổ điển dài 14000 nucleotid, có cấu trúc gồm 15 exon, gen mã hóa phân tử mRNA dài 8972 bp, sản phẩm dịch mã dài 2843 acid amin Các nghiên cứu giới tìm thấy khoảng 300 đột biến khác gen APC gây bệnh FAP(2) Trong năm gần đây, nhiều nghiên cứu xác định tầm quan trọng đa hình đơn nucleotide (single nucleotide polymorphisms – SNP) bên cạnh đột biến gen liên quan đến ung thư đại trực tràng Một số SNP đóng vai trò phát triển ung thư đại trực tràng tác động đến chức gen điều hòa hoạt động tế bào Kỹ thuật tách chiết DNA từ máu ngoại vi Máu ngoại vi thu nhận giữ ống chống đông EDTA nắp xanh dương ly trích vòng 24 Sử dụng kit QiAamp DNA blood mini kit hãng Qiagen – Đức để ly trích DNA Ở Việt Nam, việc nghiên cứu đột biến gen APC bệnh nhân FAP hạn chế Năm 2012 tác giả Nguyễn Phương Anh phân tích gen APC cho số gia đình bệnh nhân FAP phát đột biến gây bệnh exon 15 gen APC nhiên SNP gen APC chưa System 9700 (USA) 116 Sản phẩm ly trích tiến hành kiểm tra độ nguyên vẹn mạch phương pháp điện di gel agarose 3%, đo nồng độ độ tinh máy NanoDrop 2000 Chỉ mẫu tách chiết đạt độ tinh với tỷ số A260/A280 khoảng 1,8-2,0 tiếp tục sử dụng cho thí nghiệm sau Kỹ thuật khuếch đại exon gen APC Dùng phương pháp PCR khuếch đại 15 đoạn exon gen APC máy Gene Amp PCR Thành phần phản ứng PCR gồm 20 μl chứa thành phần: DNA khuôn; 0,2 mmol/L dNTP; 1,5 mmol/L Mg++; 0,1-0,2 μmol/L primer 1-1,5 đơn vị Taq polymerase Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 21 * Số * 2017 Chu trình nhiệt phản ứng sau: Đầu Nghiên cứu Y học Xử lý thống kê tiên giai đoạn biến tính 94°C phút, Số liệu thống kê phân tích xử lý 35-40 chu kỳ gồm biến tính 94°C phần mềm SPSS 19.0 30 giây; gắn mồi 60°C 30 giây KẾT QUẢ - BÀN LUẬN bước kéo dài 72°C 30 giây, cuối giai đoạn hoàn chỉnh 72°C phút bảo quản tạm thời sản phẩm PCR 4°C Đặc điểm nhóm nghiên cứu Bảng Phân bố theo giới tuổi bệnh nhân Nhóm tuổi Nam Nữ Kết PCR sau kiểm chứng phương pháp điện di gel agarose 1,5% Kỹ thuật giải trình tự gen Thực phản ứng cycle sequencing với BigDye version 3.1 công ty Applied Dưới 30 Từ 30 - 60 Trên 60 Tổng số Biosystems, theo chiều xi ngược, giải trình tự DNA máy sequencer ABI 3500 Phân tích kết giải trình tự n Tỷ lệ % n Tỷ lệ % 25 40 11,1 39,7 12,7 63,5 19 23 6,3 30,1 36,5 Chung hai giới n Tỷ lệ % 11 44 63 17,4 69,8 12,7 100 Nhận xét: Trong nhóm nghiên cứu nhóm bệnh nhân từ 30 đến 60 tuổi chiếm đa số (69,8%), độ tuổi trung bình bệnh Kết giải trình tự phân tích nhân nhóm nghiên cứu 43,9 Tỷ lệ phần mềm CLC Main Workbench so sánh bệnh nhân nam tham gia nghiên cứu 63,5% với trình tự gen APC chuẩn có mã trình tự tham nữ chiếm 36,5% chiếu NCBI NG_008481.4 Kết thống kê SNP gen APC Bảng Thống kê SNP gen APC STT 10 Exon chứa đột Nucleotide bị biến thay đổi 11 13 15 15 15 15 15 15 15 c.317G>A c.1458 T>C c.1635 G>A c.4479 G>A c.5034 G>A c.5268 T>G c.5465 T>A c.5880 G>A c.6063 C>T c.6691 A>T Acid amin bị thay đổi Mã SNP p.Arg106His p.Tyr486Tyr p.Ala545Ala p.Thr1493Thr p.Gly1678Gly p.Ser1756Ser p.Val1822Asp p.Pro1960Pro p.Phe2021Phe p.Ile2231Phe rs201764637 rs2229992 rs351771 rs41115 rs42427 rs866006 rs459552 rs465899 rs786203342 rs534228737 Nhận xét: Chúng tìm thấy 10 SNP gen APC, 7/10 SNP không làm thay đổi acid amin, SNP khơng có ý nghĩa mặt lâm sàng khơng ảnh hưởng đến cấu trúc protein Tuy nhiên, có SNP có ảnh hưởng làm thay đổi acid amin SNP rs201764637 (p.Arg106His), SNP rs459552 (p.Val1822Asp) SNP rs534228737 (p.Ile2231Phe) Số lượng kiểu gen Dị hợp Đồng hợp 20 13 25 13 14 24 11 17 16 22 10 Kiểm tra sở liệu 1000genomes (http://browser.1000genomes.org/), giải trình tự 99 người dân tộc Kinh Việt Nam khơng phát hai SNP rs201764637 (p.Arg106His) SNP rs534228737 (p.Ile2231Phe) SNP rs459552 (p.Val1822Asp) có 13 người dị hợp người đồng hợp Điều cho thấy SNP rs459552 (p.Val1822Asp) phổ biến quần 117 Nghiên cứu Y học thể người Việt Nam nên SNP gây bệnh Tuy nhiên theo nghiên cứu Guerreiro vào năm 2017 cho thấy SNP rs459552 (p.Val1822Asp) có liên quan đến phần ăn nguy ung thư trực tràng cụ thể người có mang allen đột biến có nguy mắc ung thư đại trực tràng cao ăn phần ăn nhiều cholesterol, chất xơ canxi so với người có kiểu gen bình thường có phần ăn tương tự(3) Điều cho thấy SNP có tương tác định nguy ung thư đại trực tràng Khi tiếp tục hồi cứu kết giải trình tự 2503 người tồn giới thống kê 1000genomes cho thấy có trường hợp dị hợp tử tương ứng với SNP rs201764637 (p.Arg106His) trường hợp dị hợp tử SNP rs534228737 (p.Ile2231Phe) Điều chứng tỏ SNP có tỉ lệ thấp Theo sở liệu ClinVar SNP rs201764637 (p.Arg106His) Johnston báo cáo từ năm 2012(3) ý nghĩa rõ ràng mặt lâm sàng Theo tiêu chuẩn phân Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 21 * Số * 2017 loại Counsyl (2015) SNP rs201764637 xếp loại biến thể chưa có ý nghĩa rõ ràng (variant of uncertain significance - VUS) có báo cáo SNP giới nên chưa đủ liệu để đánh giá ảnh hưởng SNP lên kiểu hình bệnh Theo sở liệu ClinVar SNP rs534228737 xếp loại biến thể chưa có ý nghĩa rõ ràng Tuy nhiên biến thể khơng tìm thấy giải trình tự 6500 người Mỹ gốc châu Âu châu Phi dự án NHLBI Exome Sequencing Project cho thấy SNP biến thể lành tính thơng thường quần thể Dựa thơng tin có, chưa thể kết luận SNP rs534228737 đột biến gây bệnh biến thể lành tính Tuy nhiên SNP thay đổi acid amin p.Ile2231Phe nằm vùng protein APC, vùng có chức ổn định kích thích trùng hợp vi ống tham gia trình phân chia tế bào Cấu trúc vùng có tính bảo tồn cao Hình Phân tích Polyphen-2 SNP rs534228737 Phân tích SNP c.6691A>T phần mềm Polyphen-2 thu số điểm nguy SNP 0.997, số điểm cao, chứng tỏ SNP gây bệnh bệnh nhân Do cần theo dõi diễn tiến lâm sàng bệnh nhân theo dõi báo cáo cập nhật tác giả khác giới SNP 118 KẾT LUẬN Bằng phương pháp giải trình tự, chúng tơi tìm thấy 10 SNP gen APC, 7/10 SNP khơng làm thay đổi acid amin, SNP khơng có ý nghĩa mặt lâm sàng khơng ảnh hưởng đến cấu trúc protein Tuy nhiên, có SNP có ảnh hưởng làm thay đổi acid amin SNP Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 21 * Số * 2017 rs201764637 (p.Arg106His), SNP rs459552 (p.Val1822Asp) SNP rs534228737 (p.Ile2231Phe) Vai trò SNP cần làm rõ qua nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO Guerreiro CS et al (2007), "The D1822V APC polymorphism interacts with fat, calcium, and fiber intakes in modulating the risk of colorectal cancer in Portuguese persons", The American journal of clinical nutrition, 85(6), pp 1592-1597 Half E, Bercovich D, and Rozen P (2009), "Familial adenomatous polyposis", Orphanet J Rare Dis, 4(22Jian-Qiu Sheng, et al (2010), "APC gene mutations in Chinese familial adenomatous polyposis patients", World J Gastroenterol, 16(12), pp 1522–1526 Johnston JJ et al (2012), "Secondary variants in individuals undergoing exome sequencing: screening of 572 individuals identifies high-penetrance mutations in cancer-susceptibility genes", The American Journal of Human Genetics, 91(1), pp 97-108 Nghiên cứu Y học Leppert M, et al (1987), "The gene for familial polyposis coli maps to the long arm of chromosome 5", Science, 238(4832), pp 1411-3 Nguyễn Phương Anh, Nguyễn Nghiêm Luật, and Trần Văn Khánh (2010), Nghiên cứu đột biến gene APC bệnh ung thư đại trực tràng thể đa polyp tuyến gia đình, Luận án tiến sỹ y học, Trường đại học Y Hà Nội, Hà Nội Plawski A and Slomski R (2009), "APC gene mutations causing familial adenomatous polyposis in Polish patients", J Appl Genet, 49(4), pp 407–414 Poovorawan K, et al (2012), "Colon Cancer Prevention by Detection of APC Gene Mutation in a Family with Attenuated Familial Adenomatous Polyposis", Asian Pacific J Cancer Prev, 13(10), pp 5101-5104 Ngày nhận báo: 29/11/2016 Ngày phản biện nhận xét báo: Ngày báo đăng: 28/11/2016 15/05/2017 119 ... words: FAP, APC gene, SNP, sequencing ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh đa polyp tuyến gia đình (hereditary familial adenomatous polyposis: FAP) bệnh rối loạn di truyền trội(6) Đa polyp tuyến gia đình đặc trưng... 100% bệnh nhân bị K hóa trước 40 tuổi khơng điều trị sớm(1) báo cáo(3,2) Xuất phát từ thực tiễn đó, chúng tơi tiến hành đề tài với mục tiêu: Xác định đa hình đơn nucleotide (SNP) gen APC bệnh nhân. .. nhân mắc bệnh đa polyp tuyến gia đình ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Đối tượng nghiên cứu Đây bệnh gặp, tỷ lệ mắc bệnh khoảng 1/10.000-1/6000, thời gian năm nghiên cứu, thực nghiên cứu 63 bệnh nhân