Nghiên cứu này được tiến hành với mục tiêu xác định tính đa hình đơn A17893G tại intron 5 của gen XRCC3 ở nhóm bệnh nhân mắc ung thư buồng trứng so với nhóm đối chứng. 102 bệnh nhân mắc ung thư buồng trứng và 102 người không mắc ung thư buồng trứng đã được lựa chọn vào nghiên cứu. Sử dụng kỹ thuật enzym cắt giới hạn (RCR - RFLP) để phân tích kiểu gen của XRCC3, sau đó xác định tỉ lệ phân bố và khả năng mắc bệnh của các kiểu gen.
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC ĐA HÌNH ĐƠN NUCLEOTIDE A17893G CỦA GEN XRCC3 TRONG UNG THƯ BUỒNG TRỨNG Nguyễn Hải Phương, Trần Huy Thịnh, Trần Vân Khánh, Tạ Thành Văn, Nguyễn Viết Tiến Trường Đại học Y Hà Nội Gen XRCC3 có chức trì bền vững nhiễm sắc thể sửa chữa tổn thương DNA trình tái tổ hợp tương đồng, thay đổi gen có liên quan tới hình thành phát triển nhiều loại ung thư Nghiên cứu tiến hành với mục tiêu xác định tính đa hình đơn A17893G intron gen XRCC3 nhóm bệnh nhân mắc ung thư buồng trứng so với nhóm đối chứng 102 bệnh nhân mắc ung thư buồng trứng 102 người không mắc ung thư buồng trứng lựa chọn vào nghiên cứu Sử dụng kỹ thuật enzym cắt giới hạn (RCR - RFLP) để phân tích kiểu gen XRCC3, sau xác định tỉ lệ phân bố khả mắc bệnh kiểu gen Kết cho thấy tỉ lệ alen A 0,61 alen G 0,39 Tỉ lệ phân bố kiểu gen AA, AG, GG nhóm bệnh 39,2%, 43,1%, 17,6% nhóm chứng 40,2%, 35,3%, 24,5% Các alen kiểu gen SNP A17893G khơng có khác biệt nhóm bệnh nhóm chứng Từ khóa: Ung thư buồng trứng, đa hình đơn A17893G, gen XRCC3 I ĐẶT VẤN ĐỀ A17893G vị trí intron nhiều Ung thư buồng trứng bảy ung nghiên cứu giới phân tích vai trò thư thường gặp phụ nữ Năm 2012 với bệnh lý ung thư buồng trứng [3 - 5] Kết toàn giới ghi nhận 239.000 ca mắc báo cáo tồn mâu ung thư buồng trứng, chiếm 4% tổng số thuẫn Một số nghiên cứu cho thấy liên ca mắc ung thư Căn bệnh quan SNP A17893G với bệnh lý ung thư tám nguyên nhân gây tử vong buồng trứng có ý nghĩa thống kê [3; 6] Một ung thư hàng đầu phụ nữ [1] số nghiên cứu khác lại cho thấy khơng có mối XRCC3 protein gia đình protein RAD51 Các tác nhân gây ung liên quan SNP A17893G nguy mắc bệnh [4; 7] thư tác động vào phân tử DNA làm Hiện Việt Nam, đa hình đơn nucleo- đứt gẫy mạch phân tử Lúc họ tide gen XRCC3 bệnh lý ung thư gia đình protein RAD51 có vai trò bảo vệ buồng trứng vấn đề bỏ ngỏ, hàn gắn lại phân tử DNA, đảm bảo ổn định nghiên cứu thực với mục tiêu: xác phân tử [2] Gen quy định tổng hợp nên định tỷ lệ đa hình đơn A17893G gen protein XRCC3 nằm vị trí 14q32.3, gen dài XRCC3 bệnh nhân ung thư buồng trứng 23kbp, nhóm người bình thường Việt Nam gồm 10 exon Trong đó, SNP Địa liên hệ: Trần Huy Thịnh, Bộ mơn Hóa sinh, Trường Đại học Y Hà Nội Email: tranhuythinh@hmu.edu.vn Ngày nhận: 19/4/2018 Ngày chấp thuận: 15/6/2018 TCNCYH 115 (6) - 2018 II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Đối tượng Nhóm bệnh: 102 bệnh nhân mắc ung thư buồng trứng điều trị Bệnh viện Phụ sản 53 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Trung ương với độ tuổi trung bình 44,69 ± 2% với điện 100V 20 phút chụp 16,4 Các bệnh nhân thăm khám lâm ảnh hệ thống máy EC3 Imaging System sàng, làm xét nghiệm cận lâm sàng Khi enzym cắt đoạn gen tạo đoạn giải phẫu bệnh để chẩn đốn xác định ung thư DNA có kích thước 650 bp (kiểu gen GG); 283 buồng trứng bp 367 bp (kiểu gen AA); 280 bp, 367 bp - Nhóm chứng: 102 bệnh nhân nữ khơng mắc ung thư buồng trứng đến khám Bệnh viện Phụ Sản Trung ương với độ tuổi trung bình 45,74 ± 17,1 650 bp (kiểu gen AG) Phân tích số liệu Sử dụng phần mềm SPSS 16.0 để phân tích số liệu Kiểm định χ2 để so sánh tỉ lệ kiểu Các đối tượng thuộc nhóm bệnh nhóm gen nhóm bệnh nhóm chứng Để ước chứng lấy 2ml máu chống đơng tính mối liên quan kiểu gen khả EDTA mắc ung thư buồng trứng dùng tỉ suất Phương pháp Tách chiết DNA: DNA tổng số tách chiết từ mẫu máu theo kit PROMEGA Kỹ thuật PCR-RFLP (PCR-Restrict Fragment Length Polymophism) OR với khoảng tin cậy 95% Các kiểm định ý nghĩa p < 0,05 Đạo đức nghiên cứu Đề tài Hội đồng Đạo đức Bệnh viện Phụ sản Trung ương chấp thuận Vùng gen chứa SNP A17893G gen theo định số 966/CN-PSTW Bệnh XRCC3 khuếch đại cách sử dụng nhân hoàn toàn tự nguyện tham gia vào cặp mồi: nghiên cứu Bệnh nhân có quyền rút lui khỏi Mồi xuôi: 5’-GACACCTCTACAGAGGACG- nghiên cứu không đồng ý tiếp tục tham gia vào nghiên cứu Các thông tin cá nhân 3’ Mồi ngược: 3’-CTGTGCCTAACCATCGAGAA -5’ bảo mật III KẾT QUẢ Thành phần phản ứng PCR (thể tích 15 µl) gồm: µl H2O, 7,5 µl Tag polymerase, µl mồi xi, µl mồi ngược 1,5 µl DNA Đặc điểm chung nhóm nghiên cứu Chu trình nhiệt phản ứng: [94ºC/30 Khi so sánh tiêu chí tuổi, tuổi trung giây, 58ºC/30 giây, 72ºC/30 giây] 38 chu kỳ Bảo quản sản phẩm 15ºC bình tình trạng kinh nguyệt cho thấy nhóm Sản phẩm PCR điện di gel agarose 1,5%, điện 120V 15 phút p > 0,05 Ở bệnh nhân ung thư buồng Xác định đa hình A17893G gen nhóm tuổi từ 40 đến 59 tuổi chiếm 45,1% XRCC3 kỹ thuật enzym cắt giới hạn: bệnh nhóm chứng tương đồng nhau,với trứng, nhóm tuổi mắc bệnh nhiều nhất nhóm tuổi ≥ 60 tuổi chiếm 20,6% Tuổi Thành phần phản ứng: 0,3 µl enzym trung bình mắc bệnh 44,69 tuổi Tỉ lệ bệnh Pvu II, µl buffer NE 3.1, 1,7 µl H2O µl nhân mắc bệnh mãn kinh chiếm 44,1%, sản phẩm PCR Phản ứng cắt ủ 37 ºC so với bệnh nhân chưa mãn kinh giờ, sau điện di gel agarose chưa có kinh (chiếm 55,9%) (bảng 1) 54 TCNCYH 115 (6) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Bảng Đặc điểm chung nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu Đặc điểm Tuổi (n = 102) (n = 102) p % n % ≤ 39 35 34,3 32 31,4 40 - 59 46 45,1 50 49,0 ≥ 60 21 20,6 20 19,6 44,69 ± 16,4 Mãn kinh Chưa mãn kinh kinh nguyệt Nhóm chứng n Tuổi trung bình Tình trạng Nhóm bệnh chưa có kinh 45,74 ± 17,1 45 44,1 42 41,2 57 55,9 60 58,9 0,850 0,622 0,671 Mối liên quan SNP A17893G với số yếu tố bệnh ung thư buồng trứng M (+) (-) BT21 BT22 BT23 BT24 BT25 BT26 BT27 BT28 BT29 650 bp Hình Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen XRCC3 chứa SNP A17893G bệnh nhân ung thư buồng trứng M: marker; (+): chứng dương; (-): chứng âm BT21-BT29 mẫu bệnh nhân Hình cho thấy sản phẩm PCR đoạn gen XRCC3 chứa SNP A17893G sau điện di nhóm bệnh nhân ung thư buồng trứng Bản gel soi tia UV cho hình ảnh rõ ràng, sắc nét, không xuất vạch phụ TCNCYH 115 (6) - 2018 55 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC M AA GG BT21 BT22 BT23 BT24 BT25 BT26 BT27 BT28 BT29 650 bp 367 bp 283 bp Hình Hình ảnh điện di sản phẩm cắt đoạn gen XRCC3 enzym PvuII mẫu bệnh nhân ung thư buồng trứng * M: Marker 100 bp; AA: mẫu chứng mang kiểu gen AA; GG: mẫu chứng mang kiểu gen GG; kiểu gen AA (BT28); kiểu gen AG (BT21, BT24, BT25, BT27, BT29); kiểu gen GG (BT22, BT23, BT26) Hình Kết giải trình tự sản phẩm PCR đoạn gen XRCC3 chứa SNP A17893G bệnh nhân mang kiểu gen AA, AG, GG Sản phẩm PCR kiểu gen AA, AG, GG kiểm tra lại phương pháp giải trình tự so sánh Genebank Kết giải trình tự thu trùng khớp với kết xác định kiểu gen phương pháp RFLP Bảng Tỉ lệ kiểu gen kiểu alen SNP A17893G nhóm bệnh nhóm chứng Kiểu alen kiểu gen Kiểu alen Kiểu gen 56 Nhóm bệnh Nhóm chứng n % n % A 124 60,8 118 57,8 G 80 39,2 86 42,2 AA 40 39,2 41 40,2 AG 44 43,1 36 35,3 GG 18 17,6 25 24,5 p 0,545 0,377 TCNCYH 115 (6) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Tỉ lệ alen G nhóm chứng ghi 0,42 nhóm bệnh 0,39 Ở nhóm bệnh, tỉ lệ kiểu gen AG lớn nhất, chiếm 43,1%, tiếp sau kiểu gen AA chiếm 39,2% kiểu gen GG 17,6% Còn nhóm chứng, nhiều kiểu gen AA với tỉ lệ 40,2% kiểu gen GG với tỉ lệ 24,5% Tuy nhiên kiểu alen kiểu gen lại khơng có khác biệt nhóm bệnh chứng Bảng So sánh khả mắc bệnh kiểu gen SNP A17893G nhóm bệnh nhóm chứng Nhóm bệnh Các cặp kiểu gen n % n % GG 18 31,0 25 37,9 AA 40 69,0 41 62,1 AG 44 52,4 36 46,8 AA 40 47,6 41 53,2 GG + AG 62 60,8 61 59,8 AA 40 39,2 41 40,2 GG 18 17,6 25 24,5 AA + AG 84 82,4 77 75,5 GG với AA AG với AA GG + AG với AA GG với AA + AG Nhóm chứng OR (95% CI) p 0,74 (0,35 - 1,56) 0,424 1,25 (0,67 - 2,32) 0,476 1,04 (0,60 - 1,82) 0,886 0,66 (0,33 - 1,30) 0,230 Khi so sánh khả mắc bệnh kiểu gen chứa alen G với kiểu gen khác theo cặp: kiểu gen đồng hợp GG với AA, kiểu gen dị hợp AG với AA, kiểu gen nhóm GG AG với AA kiểu gen GG với nhóm AA AG khơng thấy có mối liên quan với khả mắc bệnh IV BÀN LUẬN Trong nghiên cứu này, độ tuổi hay gặp ung thư buồng trứng 40 – 59 tuổi chiếm 53,9%, nhóm tuổi < 39 chiếm 27,4%, lại nhóm tuổi > 60 chiếm 18,8% [9] Đứng thứ hai nhóm tuổi 39 tuổi Về tình trạng kinh nguyệt nhóm bệnh nhóm tuổi 60 tuổi Sự phân bố nhân tham gia nghiên cứu, kết thu nhóm tuổi tương đồng với số cho thấy tỉ lệ gặp bệnh nhân ung thư buồng nghiên cứu tác giả khác Việt Nam trứng nhóm chưa mãn kinh chưa Theo nghiên cứu bệnh nhân ung có kinh cao nhóm mãn kinh Kết thư buồng trứng thành phố Hồ Chí Minh khơng giống nhận định lứa nhóm tuổi 40 – 59 chiếm 55,3% tổng số bệnh tuổi thường gặp ung thư buồng trứng nhân, nhóm tuổi 39 tuổi chiếm 37,7% bệnh nhân cao tuổi mãn kinh Ở gặp nhóm tuổi sau 60 tuổi chiếm nghiên cứu tác giả Việt Nam, tỉ lệ bệnh 7,25% [8] Tại Thái Nguyên, nhóm tuổi 40 – 59 nhân mãn kinh chiếm 70%, tỉ lệ bệnh nhân TCNCYH 115 (6) - 2018 57 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC chưa mãn kinh chiếm 30% số bệnh nhân 95%CI = 0,83 - 0,99 , p = 0,04) [6] Ở nghiên bị ung thư buồng trứng [10] cứu tổng hợp khác nhóm bệnh nhân ung Sau xác định kiểu gen SNP thư tuyến giáp phát mối liên A17893G phương pháp PCR-RFLP quan SNP nguy mắc ung thư tuyến kiểm tra lại kỹ thuật giải trình tự, số giáp (kiểu gen GG so với AA AG có OR = liệu phân tích với phép kiếm định χ2 0,57, 95%CI 0,35 - 0,93, p = 0,02) [12] Tuy đo OR với độ tin cậy 95% Tỉ lệ alen G theo nghiên cứu nhóm chứng 0,42 nhóm bệnh 0,39 Tỉ lệ SNP A17893G nghiên cứu tổng hợp bệnh - chứng chủng tộc người da trắng Anh, Hoa Kỳ Đan Mạch 0,33 nhóm bệnh nhóm nhiên, số nghiên cứu giới có kết giống với nghiên cứu chúng tơi, chứng minh SNP A17893G khơng có mối liên quan với nguy mắc bệnh [4; 7] V KẾT LUẬN chứng [3] Ở châu Á, Đài Loan tỉ lệ SNP Nghiên cứu xác định đa hình đơn nhóm chứng 0,30 nhóm bệnh nhân ung nucleotide A17893G gen XRCC3 thư vú 0,29 [11] Như chủng tộc nhóm bệnh nhân ung thư buồng trứng khác nhau, tỉ lệ SNP khơng giống nhóm chứng Các phân tích liệu cho thấy Cùng thuộc khu vực châu Á, tỉ lệ SNP khơng có mối liên quan đa hình đơn A17893G nghiên cứu lớn A17893G nguy mắc ung thư buồng so với nghiên cứu tiến hành trứng Đài Loan Khi tiến hành kiểm định mối liên quan Lời cám ơn kiểu gen AA, AG GG, kết thu Nghiên cứu thực với hỗ trợ kiểu gen khơng có khác biệt kinh phí đề tài cấp Bộ Y tế “Nghiên cứu nhóm bệnh nhóm chứng Phân tích sâu xây dựng quy trình xác định đột biến đa liệu để so sánh khả mắc hình thái đơn nucleotid số gen liên bệnh kiểu gen chứa alen G quan đến ung thư vú ung thư buồng trứng” kiểu gen lại, chúng tơi khơng ghi Nhóm nghiên cứu trân trọng cảm ơn Bệnh nhận mối liên quan có ý nghĩa thống kê viện Phụ Sản Trung ương; Bộ mơn Hóa Sinh, với khoảng 95% CI chứa Trong đó, Trung tâm Nghiên cứu Gen – Protein, Trường số nghiên cứu giới mối liên quan Đại học Y Hà Nội SNP bệnh lý ung thư lại chứng minh SNP có liên quan SNP TÀI LIỆU THAM KHẢO A17893G có vai trò yếu tố bảo vệ khỏi nguy Ferlay J, Soerjomataram I, Dikshit R mắc bệnh Cùng đối tượng ung thư et al (2014) Cancer incidence and mortality buồng trứng, năm 2014, nghiên cứu tổng hợp worldwide: Sources, methods and major pat- chủng tộc người da trắng cho thấy mối terns in GLOBOCAN 2012 International Jour- tương quan có ý nghĩa thống kê với nguy nal of Cancer, 136 (5), E359-E386 ung thư buồng trứng cách sử dụng so Liu Y, Tarsounas M, O'regan P et al sánh dị hợp tử (T1T2 với T1T1: OR = 0.91, (2007) Role of RAD51C and XRCC3 in Ge- 58 TCNCYH 115 (6) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC netic Recombination and DNA Repair The quan đến khả sống sau 05 năm Journal of Biological Chemistry, 282, 1973 1979 bệnh nhân ung thư buồng trứng chẩn Auranen A, Song H, Waterfall C et al theo dõi đến năm 2007 Tạp chí Y học (2005) Polymorphisms in DNA repair genes and epithelial ovarian cancer risk International Journal of Cancer, 117 (4), 611 - 618 đoán - điều trị bệnh viện Từ Dũ năm 2002 Thành phố Hồ Chí Minh, 14 (2), 60 - 68 Vũ Hô, Vi Trần Doanh, Lê Thị Lộc cộng (2010) Nghiên cứu đặc điểm lâm Kareem., sàng - mô bệnh học điều trị ung thư buồng Mohammad A Anazi et al (2015) Polymor- trứng Trung tâm Ung bướu Thái Nguyên từ phisms in DNA Repair Gene XRCC3 and Sus- 2005 - T8/201 Tạp chí Y học Thành phố Hồ ceptibility to Breast Cancer in Saudi Females Chí Minh, 14 (4), 491 - 494 Alaa M Ali., Huda A BioMed Research International, (2016), 10 Phạm Thị Diệu Hà, Nguyễn Văn Yong S Song, Hee S Kim, Daisuke A Tuyên (2013) Nhận xét giá trị HE4 test et al (2014) Ovarian Cancer BioMed Re- ROMA chẩn đoán ung thư buồng trứng search International, (2012), Tạp chí Nghiên cứu Y học, 82 (2), 37 - 44 Yuan C, Liu X, Yan S et al (2014) Analyzing Association of the XRCC3 Gene Polymorphism with Ovarian Cancer Risk BioMed Research International, 2014, He XF, Wei W, Su J et al (2012) Association between the XRCC3 polymorphisms and breast cancer risk: meta-analysis based on case-control studies Molecular Biology Report, 39 (5), 5125 - 5134 Võ Hoàng Nhân, Nguyễn Thị Ngọc Phượng (2010) Khảo sát yếu tố liên 11 Su CH, Chang WS, Hu PS et al (2015) Contribution of DNA Double-strand Break Repair Gene XRCC3 Genotypes to Triple-negative Breast Cancer Risk Cancer Genomics and Proteomics, 12 (6), 359 - 367 12 Yu XL, Liu H, Wang B et al (2014) Significant associations between X-ray repair cross-complementing group genetic polymorphisms and thyroid cancer risk Tumor Biology, 35 (3), 2009 - 2015 Summary ASSOCIATION BETWEEN XRCC3 GENE POLYMORPHISM A17893G AND OVARIAN CANCER RISK XRCC3 gene plays a significant role of stabilizing chromosomes and repairing DNA doublestrand disruption by homologous recombination Thus, it is speculated that the polymorphic variants of the XRCC3 gene are associated with the initiation and progression of cancer This case control study was carried out to identify the intronic XRCC3 gene polymorphism A17893G in ovarian cancer 102 patients and 102 controls were selected Genotyping of XRCC3 A17893G was performed with polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCRRFLP) Then, the distributions of the genotypic or allelic frequencies and the association between the genotype and ovarian cancer risk were investigated The frequency of allele A is 0.61 and that TCNCYH 115 (6) - 2018 59 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC of allele G is 0.61 For the study group, the distribution of genotype AA, AG, GG are 39.2%, 43.1%, 17.6% and for the control group, the distribution of genotype AA, AG, GG are 40.2%, 35.3%, 24.5%, respectively However, no statistically significant associations were observed between the polymorphism and ovarian cancer risk Keywords: Ovarian cancer, SNP A17893G, rs1799796, XRCC3 gene 60 TCNCYH 115 (6) - 2018 ... lệ SNP Nghiên cứu xác định đa hình đơn nhóm chứng 0,30 nhóm bệnh nhân ung nucleotide A17893G gen XRCC3 thư vú 0,29 [11] Như chủng tộc nhóm bệnh nhân ung thư buồng trứng khác nhau, tỉ lệ SNP không... bp Hình Hình ảnh điện di sản phẩm cắt đoạn gen XRCC3 enzym PvuII mẫu bệnh nhân ung thư buồng trứng * M: Marker 100 bp; AA: mẫu chứng mang kiểu gen AA; GG: mẫu chứng mang kiểu gen GG; kiểu gen. .. Ở nghiên bị ung thư buồng trứng [10] cứu tổng hợp khác nhóm bệnh nhân ung Sau xác định kiểu gen SNP thư tuyến giáp phát mối liên A17893G phương pháp PCR-RFLP quan SNP nguy mắc ung thư tuyến kiểm