Nghiên cứu tính đa hình đơn nucleotid rs2681492 của gen ATP2B1 và mối tương quan với bệnh tăng huyết áp ở người từ 40 64 tuổi tại tỉnh hà nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THANH HUYỀN NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH ĐƠN NUCLEOTID rs2681492 CỦA GEN ATP2B1 VÀ MỐI TƢƠNG QUAN VỚI BỆNH TĂNG HUYẾT ÁP Ở NGƢỜI TỪ 40-64 TUỔI TẠI TỈNH HÀ NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THANH HUYỀN NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH ĐƠN NUCLEOTID rs2681492 CỦA GEN ATP2B1 VÀ MỐI TƢƠNG QUAN VỚI BỆNH TĂNG HUYẾT ÁP Ở NGƢỜI TỪ 40-64 TUỔI TẠI TỈNH HÀ NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH DƢỢC MÃ SỐ: 8720208 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Trần Quang Bình PGS.TS Nguyễn Văn Rƣ HÀ NỘI 2018 LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết, xin chân thành cám ơn giúp đỡ PGS.TS.Trần Quang Bình, PGS.TS.Nguyễn Văn Rƣ, PGS.TS.Phan Túy, ngƣời thầy nhiệt huyết, bên hỗ trợ định hƣớng cho nhiều kiến thức phƣơng pháp nghiên cứu khoa học Tiếp theo, muốn gửi lời cảm ơn tới ThS Bùi Thị Thúy Nga, ngƣời đồng hành tơi vƣợt qua khó khăn suốt q trình thực đề tài hồn thành luận văn này, cho học ý nghĩa kiến thức, phƣơng pháp nghiên cứu khoa học kỹ thuật di truyền trình làm việc Tôi xin cảm ơn TS.Dƣơng Tuấn Linh, ThS.Nguyễn Ánh Ngọc, DS.Phùng Thị Hƣơng Giang nhân viên khác Phòng Thí nghiệm trung tâm- Viện Dinh dƣỡng hỗ trợ, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ thân thiện, hỗ trợ họ, cho tơi khơng điều kiện tốt mà lời khuyên quan trọng thời gian học tập Trân trọng cảm ơn tới thầy Bộ mơn Hóa sinh, phòng Sau Đại họcTrƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội; Ban Giám đốc, Hội đồng Khoa học, Hội đồng Đạo đức- Viện Dinh dƣỡng; Quỹ Nafosted, Sở Y tế Trung tâm Y tế Dự phòng Hà Nam tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi q trình học tập hồn thành luận văn Rất cảm ơn bạn bè, anh, chị, em đồng nghiệp Trƣờng Đại học Thành Đô, Trƣờng Đại học Hòa Bình, bạn lớp cao học 21, ln sát cánh, động viên tơi lúc khó khăn sống Cuối cùng, muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc tới bố mẹ hai em trai cho động lực bên cạnh ủng hộ tạo điều kiện tốt để tơi đƣợc làm u thích Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Nguyễn Thị Thanh Huyền MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU v ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan bệnh tăng huyết áp 1.1.1 Định nghĩa tăng huyết áp 1.1.2 Chẩn đoán bệnh tăng huyết áp 1.1.3 Phân loại bệnh tăng huyết áp 1.1.4 Đặc điểm dịch tễ học bệnh tăng huyết áp 1.1.5 Các yếu tố nguy bệnh tăng huyết áp 1.1.6 Cơ chế bệnh sinh bệnh tăng huyết áp 1.2 Các gen liên quan đến bệnh tăng huyết áp 12 1.3 Tổng quan gen ATP2B1 14 1.3.1 Vị trí cấu trúc gen ATP2B1 14 1.3.2 Chức gen ATP2B1 16 1.3.3 Lƣợc sử nghiên cứu gen ATP2B1 ảnh hƣởng đến huyết áp 17 1.4 Phƣơng pháp xác định đa hình đơn nucleotid 19 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Thiết kế nghiên cứu 21 2.2 Đối tƣợng nghiên cứu tiêu chuẩn lựa chọn 22 2.2.1 Cỡ mẫu nghiên cứu 22 2.2.2 Tiêu chuẩn lựa chọn 22 i 2.2.3 Tiêu chuẩn loại trừ 23 2.3 Hóa chất trang thiết bị 23 2.3.1 Hóa chất 23 2.3.2 Trang thiết bị 23 2.4 Thu thập thông tin đối tƣợng nghiên cứu 25 2.5 Các phƣơng pháp sinh học phân tử 25 2.5.1 Phƣơng pháp tách ADN từ máu toàn phần 25 2.5.2 Xác định kiểu gen phƣơng pháp PCR- RFLP 26 2.5.3 Phƣơng pháp điện di thạch agarose 27 2.5.4 Giải trình tự gen 28 2.6 Phƣơng pháp phân tích thống kê 28 2.7 Đạo đức nghiên cứu 29 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 30 3.1 Quy trình kỹ thuật xác định kiểu gen 30 3.1.1 Kết thiết kế mồi enzym 30 3.1.2 Quy trình xác định SNP rs2681492 gen ATP2B1 phƣơng pháp PCR- RFLP 32 3.1.3 Kết giải trình tự gen 35 3.2 Đặc điểm đối tƣợng nghiên cứu 36 3.3 Kết xác định kiểu gen 38 3.4 Phân tích đặc điểm huyết áp đối tƣợng nghiên cứu theo kiểu gen nhóm bệnh nhóm chứng 39 3.5 Phân tích riêng liên quan gen ATP2B1 SNP rs2681492 nguy mắc bệnh tăng huyết áp 40 ii 3.6 Phân tích liên quan gen ATP2B1 SNP rs2681492 với yếu tố xã hội, lối sống nguy mắc bệnh tăng huyết áp 43 Chƣơng BÀN LUẬN 45 4.1 Quy trình kỹ thuật xác định kiểu gen ATP2B1 rs2681492 45 4.2 Tần suất alen phân bố kiểu gen SNP rs2681492 gen ATP2B1 45 4.3 Ảnh hƣởng gen ATP2B1 SNP rs2681492 bệnh tăng huyết áp nhóm quần thể Hà Nam, Việt Nam so với số nhóm quần thể giới 48 4.4 Một số đặc điểm nghiên cứu 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt BMI Body Mass Index Chỉ số khối thể CHARGE The Cohorts for Heart and Aging Research in Genome Epidemiology Nhóm nghiên cứu tim lão hóa dịch tễ hệ gen DBP Diastolic blood pressure Huyết áp tâm trƣơng ESH The European Society of Hypertension Hiệp hội tăng huyết áp châu Âu Global BPgen Global BPgen Hiệp hội Di truyền huyết áp Toàn cầu GWAS Genome wide association study Nghiên cứu liên quan toàn hệ gen HDL Lipoprotein Density Hight Lipoproten tỷ trọng cao ISH International Society of Hypertension Hiệp hội tăng huyết áp quốc tế JMGPH The Japanese Millennium Genome Project for Hypertension Dự án Genome thiên niên kỷ Nhật Bản tăng huyết áp JNC Joint National Comittee Liên uỷ ban quốc gia LDL Lipoprotein Density Low Lipoprotein tỷ trọng thấp RAA Renin Angiotensin Aldosteron Renin Angiotensin Aldosteron RFLP-PCR Restriction Fragment Length Polymorphism Đa hình chiều dài đoạn gen cắt giới hạn SBP Systolic blood pressure Huyết áp tâm thu SNP Singel nucleotid polymorphism Đa hình đơn nucleotid WHO World Health Oganization iv Tổ chức Y tế giới DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU Bảng 1.1 Phân độ tăng huyết áp theo hƣớng dẫn Bộ Y tế 2010 Bảng 1.2 Phân độ tăng huyết áp cho ngƣời lớn JNC VII (2003) Bảng 1.3 Phân độ tăng huyết áp theo WHO – ISH (2003) Bảng 1.4 Phân độ tăng huyết áp theo yếu tố nguy tim mạch Bảng 3.1 Đặc điểm nhân trắc đối tƣợng nghiên cứu 37 Bảng 3.2 Phân bố kiểu gen tần số alen gen ATP2B1 SNP rs2681492 39 Bảng 3.3 Ảnh hƣởng kiểu gen ATP2B1 SNP rs2681492 lên số huyết áp nhóm chứng nhóm bệnh 40 Bảng 3.4 Các mơ hình phân tích ảnh hƣởng SNP rs2681492 với bệnh tăng huyết áp ngƣời từ 40 – 64 tuổi Hà Nam 42 Bảng 3.5 Ảnh hƣởng đa hình ATP2B1- rs2681492 yếu tố xã hội, lối sống liên quan đến tăng huyết áp 43 v DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Sơ đồ chế bệnh sinh tăng huyết áp tăng hoạt động thần kinh giao cảm tăng cung lƣợng tim 10 Hình 1.2 Các gen liên quan đến tăng huyết áp 14 Hình 1.3 Vị trí cấu trúc gen ATP2B1 nhiễm sắc thể 12 15 Hình 1.4 Các đồng dạng ATP2B1 15 Hình 1.5 Cơ chế điều hòa Ca2+ tế bào 17 Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 21 Hình 2.2 Hình ảnh số thiết bị sử dụng nghiên cứu 24 Hình 3.1 Chu trình thử nghiệm gradient nhiệt phƣơng pháp PCR- RFLP 31 Hình 3.2 Kết thử nghiệm xác định đa hình ATP2B1 rs2681492 phƣơng pháp PCR- RFLP 32 Hình 3.3 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 33 Hình 3.4 Kết xác định kiểu gen SNP rs2681492 gen ATP2B1 phƣơng pháp PCR- RFLP 35 Hình 3.5 Kết giải trình tự gen ATP2B1 SNP rs2681492 36 Hình Tần suất alen (A) phân bố kiểu gen (B) SNP rs2681492 gen ATP2B1 giới 47 vi ĐẶT VẤN ĐỀ Trên toàn giới, nhóm bệnh tim mạch nhóm nguyên nhân gây tử vong hàng đầu Mỗi năm có khoảng 17 triệu ca tử vong bệnh tim mạch, chiếm gần phần ba tổng số ca tử vong tồn cầu [81] Trong tăng huyết áp yếu tố nguy hàng đầu, biến chứng tăng huyết áp chiếm 9,4 triệu ngƣời năm gây 45% tử vong bệnh tim [47] Theo thống kê tổ chức Y tế giới năm 2012, ƣớc tính có khoảng 40% ngƣời trƣởng thành đƣợc chẩn đoán mắc bệnh tăng huyết áp; với mức tăng từ năm 1980 600 triệu ngƣời lên tỷ ngƣời năm 2008 [28] Ƣớc tính, tỷ lệ mắc bệnh tăng huyết áp tồn cầu (12,7%) cao nguyên nhân khác nhƣ sử dụng thuốc (8,7%) hay tăng đƣờng máu (5,8%) Tỷ lệ tăng huyết áp nói chung giới khoảng 41% nƣớc phát triển 32% nƣớc phát triển [82, 83] Ở Việt Nam, nghiên cứu tăng huyết áp cho thấy tỷ lệ tăng huyết áp tăng nhanh theo thời gian: 1,9% năm 1982; 11,79% năm 1992; 16,3% năm 2002; 27,4% năm 2008 47,3% năm 2016 Trong giai đoạn 2012- 2015, có 50% bệnh nhân tăng huyết áp đƣợc phát điều trị theo phác đồ Bộ Y tế [4] Yếu tố di truyền giải thích 31- 68% bệnh tăng huyết áp, cần nghiên cứu yêu tố di truyền liên quan đến bệnh [37] Các gen liên quan đến tăng huyết áp thông qua thay đổi trình giữ muối nƣớc đơn vị thận, thay đổi cấu trúc gen hệ thống reninangiotensin- aldosteron, gen liên quan đến vận chuyển ion Ca2+ qua màng sinh học co mạch [44] Năm 2009, nghiên cứu liên quan hệ gen (GWAS- Genome Wide Association Study) tim lão hóa dịch tễ hệ genome (CHARGE- The Cohorts for Heart and Aging Research in Genome Epidemiology) đƣa kết luận đa hình đơn nucleotid (SNP- Single nucleotide Polymorphysm) gen ATP2B1 liên quan với 80 World Health Organization (1992), The World Health Report 2002: Reducing Risks, Promoting Healthy Life, World Health Organization, Geneva 81 World Health Organization (2008), Causes of Death, World Health Organization, Geneva 82 World Health Organization (2008), Global Health Observatory Data Repository, World Health Organization, Geneva 83 World Health Organization (2009), Global health risks : Mortality and burden of disease attributable to selected major risks, World Health Organization, Geneva 84 World Health Organization (2009), Global strategy for prevention and control of noncommunicable diseases, World Health Organization, Geneva 85 World Health Organization (2011), Global status report on noncommunicable diseases 2010, World Health Organization, Geneva 86 World Health Organization (2013), Draft action plan for the prevention and control of noncommunicable diseases 2013–2020, World Health Organization, Geneva 87 World Health Organization (2013) A global brief on Hypertension, World Health Organization, Geneva 88 World Health Organization, International Society of Hypertension Writing Group (2003), "World Health Organization (WHO)/International Society of Hypertension (ISH) statement on management of hypertension 2003", J Hypertens, 21:1983-1992 89 Xi B, Tang W, Wang Q (2012), "Polymorphism near the ATP2B1 gene is associated with hypertension risk in East Asians: a meta- analysis involving 15 909 cases and 18 529 controls", Blood Press, 21:134–138 90 Xu J et al (2016), Gender- Specific Association of ATP2B1 variants with susceptibility to essential hypertension in the Han Chinese population, Biomed Res Int 91 Y Kobayashi, N.Hirawa, Y.Tabara et al (2012), ―Mice lacking hypertension candidate gene ATP2B1 in vascular smooth muscle cells show signifiant blood pressure elevation‖, Hypertension, vol.59, no.4, pp.854-860 92 Young Bin Shin et al (2012), ―Characterization of the ATP2B1 gene family in blood pressure‖, Genes and Genomics, 34: 539- 547 Phụ lục Chứng nhận chấp thuận Hội đồng Đạo đức nghiên cứu y sinh Phụ lục Giấy đồng ý cho sử dụng số liệu khoa học CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tƣ - Hạnh phúc GIẤY ĐỒNG Ý CHO SỬ DỤNG SỐ LIỆU KHOA HỌC Kính gửi: Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Trần Quang Bình, Chức vụ: Trƣởng Phòng Thí nghiệm trung tâm, Viện Dinh dƣỡng QG Căn vào đề nghị hợp tác nghiên cứu khoa học Bộ môn Hóa sinh, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội; Thay mặt thành viên đề tài: ―Nghiên cứu tập năm bệnh đái tháo đường typ hội chứng chuyển hóa người Việt Nam: Vai trò yếu tố di truyền lối sống‖ mã số 106- YS.01-2015.10, tơi chủ trì đề tài đồng ý cho Dƣợc sĩ Nguyễn Thị Thanh Huyền sử dụng phần số liệu khoa học đề tài cho mục đích thực luận văn Thạc sĩ: ―Nghiên cứu tính đa hình đơn nucleotid rs2681492 gen ATP2B1 mối tương quan với bệnh tăng huyết áp người 40 - 64 tuổi tỉnh Hà Nam‖ Tôi không chịu trách nhiệm cho mục đích khác khơng thuộc phạm vi luận văn thạc sĩ Hà Nội, Ngày 20 tháng năm 2018 Ngƣời viết PGS.TS Trần Quang Bình Phụ lục Mẫu điều tra dịch tễ học bệnh đái tháo đƣờng hội chứng chuyển hóa ... ngƣời từ 40- 64 tuổi tỉnh Hà Nam Phân tích mối tƣơng quan SNP rs2681492 bệnh tăng huyết áp ngƣời từ 40 -64 tuổi Hà Nam Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan bệnh tăng huyết áp 1.1.1 Định nghĩa tăng huyết. .. VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THANH HUYỀN NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH ĐƠN NUCLEOTID rs2681492 CỦA GEN ATP2B1 VÀ MỐI TƢƠNG QUAN VỚI BỆNH TĂNG HUYẾT ÁP Ở NGƢỜI TỪ 40- 64 TUỔI... kiểu gen gen ATP2B1 SNP rs2681492 mức độ ảnh hƣởng đa hình bệnh tăng huyết áp Việt Nam hạn chế Do chúng tơi thực đề tài: Nghiên cứu tính đa hình đơn nucleotid rs2681492 gen ATP2B1 mối tƣơng quan