Theo báo cáo của Tổ chức y tế Thế giới (World Health Organization – WHO, 2012), ung thư cổ tử cung (cervical cancer) là bệnh ung thư đứng hàng thứ tư trong nhóm ung thư gây tử vong cao nhất ở phụ nữ trên thế giới. Hàng năm, trên thế giới có khoảng 528.000 trường hợp mới mắc bệnh ung thư cổ tử cung và khoảng 266.000 trường hợp mắc ung thư cổ tử cung bị tử vong. Ở Việt Nam, hàng năm có khoảng 5.146 trường hợp ung thư cổ tử cung mới được phát hiện[83]. Tỷ lệ chữa khỏi bệnh ung thư cổ tử cung tăng cao nếu các trường hợp mắc bệnh được phát hiện sớm và có phác đồ điều trị thích hợp[98]. HPV (Human Papillomavirus) thuộc họ Papillomaviridae[80], gồm có hơn 100 type. Nhóm HPV nguy cơ cao là nguyên nhân gây bệnh ung thư cổ tử cung, gồm các type: 16, 18, 31, 33, 35,... Nhóm HPV nguy cơ thấp là nguyên nhân dẫn đến bệnh lý sùi mào gà (Condyloma Acuminata), gồm các type: 6, 11, 42, 43, 44...[13][15][79]. Đáng lưu ý, HPV type 16 và HPV type 18 là yếu tố nguy cơ cao dẫn đến khoảng 70% các trường hợp ung thư cổ tử cung trên toàn thế giới[13][15][79]. Một số công trình nghiên cứu của Sharma và cộng sự (2009), Zhao và cộng sự (2008) xác định tính chất methyl hóa trên đảo CpG thuộc vùng promoter gen DAPK có chức năng ức chế khối u (tumor suppressor gene) liên quan đến quá trình sinh ung[69][91]. Tính chất methyl hóa vượt mức (hypermethylation) DNA ở nhóm gen này được ghi nhận là dấu chứng sinh học (biomarker) đặc trưng cho nhiều loại bệnh ung thư, cụ thể là ung thư cổ tử cung[69]. Gene DAPK (Death-associated protein kinase) nằm trên nhiễm sắc thể 9q21, mã hóa nhân tố điều hòa dương cơ chế chết theo chương trình của tế bào (apoptosis)[96]. Ở trạng thái bình thường, protein DAPK giữ vai trò ức chế quá trình sinh u[57][91]. Công bố khoa học của Zhao và cộng sự (2008) khẳng định tính chất methyl hóa vượt mức trên đảo CpG thuộc vùng promoter gen DAPK bị methyl hóa dẫn đến “đóng” hoạt động của DAPK, hệ quả là kích hoạt cơ chế sinh ung[57][91]. Do vậy, chúng tôi thực hiện đề tài Khóa luận tốt nghiệp: “Khảo sát tính chất methyl hóa trên vùng promoter thuộc gen DAPK ở bệnh nhân Việt Nam với yếu tố nhiễm HPV”. Mục tiêu: Xác định tính chất methyl hóa DNA trên vùng promoter thuộc gen DAPK liên quan đến bệnh ung thư cổ tử cung ở Việt Nam, dựa trên bộ mẫu có tính chất nhiễm HPV type nguy cơ cao, nhiễm HPV nguy cơ thấp hoặc không nhiễm HPV (mẫu lành). Nội dung nghiên cứu: Khảo sát bộ dữ liệu về tính chất methyl hóa vùng promoter gen DAPK liên quan đến bệnh ung thư cổ tử cung và tính chất nhiễm HPV type nguy cơ cao/không nhiễm HPV, tính chất nhiễm HPV nguy cơ cao/nhiễm HPV nguy cơ thấp và không nhiễm HPV. Khảo sát bộ mồi phù hợp với phương pháp sinh học phân tử (Nested-MSP) phù hợp nhằm khảo sát tính chất methyl hóa trên các gen DAPK trên bộ mẫu có tính chất nhiễm HPV type nguy cơ cao/không nhiễm HPV, tính chất nhiễm HPV nguy cơ cao/nhiễm HPV nguy cơ thấp và không nhiễm HPV. Khảo sát thực nghiệm dựa vào phương pháp Nested-MSP nhằm khảo sát tính chất methyl hóa gen DAPK trên bộ mẫu có tính chất nhiễm HPV type nguy cơ cao/không nhiễm HPV, tính chất nhiễm HPV nguy cơ cao/nhiễm HPV nguy cơ thấp và không nhiễm HPV. PHẦN I: TỔNG QUAN I.1 Tổng quan về ung thư I.1.1 Khái niệm ung thư Ung thư là các dạng bệnh lý do một số tế bào thoát khỏi sự kiểm soát, dẫn đến sự tăng sinh bất thường và hình thành các khối u (u lành, u ác tính) (hình 1.1). Những tế bào bất thường có khả năng xâm lấn ở các vùng mô lân cận hoặc di trú đến nhiều cơ quan khác nhau thông qua hệ thống máu và hình thành sự di căn, cuối cùng gây tử vong[3]. Ung thư bao gồm hơn 200 bệnh khác nhau, đặc trưng bởi sự tăng sinh bất thường của tế bào khối u, tế bào ác tính trong các mô, cơ quan[99]. Theo báo cáo của Tổ chức y tế thế giới (World Health Organization - WHO, 2013), ung thư là các dạng bệnh lý ảnh hưởng ở tất cả các đối tượng, trẻ em, phụ nữ và đàn ông. Đối với nam giới, các loại ung thư thường gặp là ung thư phổi, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư đại trực tràng, ung thư dạ dày và ung thư gan. Đối với nữ giới, các loại ung thư thường gặp là ung thư vú, ung thư đại trực tràng, ung thư phổi, ung thư cổ tử cung và ung thư dạ dày. I.1.2 Phân loại khối u Theo công bố của Alison và cộng sự (2001), có hai dạng khối u: khối u lành tính và khối u ác tính. Khối u lành tính là các khối u có mức độ phát triển chậm, không xâm lấn đến các mô lân cận. Khối u lành tính thường ít gây hại nghiêm trọng cho sức khỏe bệnh nhân và thường được cắt bỏ dễ dàng, ngoại trừ khi phát triển trong một không gian giới hạn như hộp sọ. Tuy nhiên, khối u lành tính có khả năng biến đổi thành khối u ác tính[5]. Khối u ác tính là các khối u thường có mức độ phát triển nhanh. Các tế bào khối u ác tính có thể tách ra khỏi khối u nguyên phát, di cư và xâm lấn các mô, cơ quan ở vùng lân cận hoặc ở xa trên cơ thể, hình thành các khối u thứ phát[5].
Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến người Thầy, người Cô khoa Công nghệ sinh học, trường Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh tận tình tâm huyết truyền đạt kiến thức tảng ngành học cho em suốt năm qua Những kiến thức Thầy Cô truyền đạt thật cần thiết quan trọng giúp em có sở để viết lên Khóa luận tốt nghiệp Tiếp theo, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Cô Lê Huyền Ái Thúy Cô Trương Kim Phượng bảo tận tình tạo điều kiện tốt cho em hoàn thành đề tài tốt nghiệp Em trân trọng biết ơn điều Cảm ơn người bạn lớp, phòng bạn nhóm thí nghiệm bên động viên, chia sẻ giúp đỡ lúc khó khăn Cuối cùng, điều thiếu sót, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình sinh ra, nuôi dưỡng đem đến cho điều tốt đẹp sống Con biết ơn nhiều Ba Mẹ tạo cho điều kiện tốt để yên tâm học hành suốt năm qua Em xin gửi lời chúc sức khỏe đến thầy cô khoa Công nghệ sinh học, kính mong Thầy Cô có thật nhiều sức khỏe, đồng hành sinh viên thân yêu nghiệp giáo dục đất nước Tôi xin chúc người bạn hoàn thành xuất sắc đề tài Khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn! Bình Dương, ngày 05/2016 Sinh viên thực tập Trần Thị Thùy Trinh SVTH: Trần Thị Thùy Trinh Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT i DANH MỤC BẢNG iii DANH MỤC HÌNH iv ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN I: TỔNG QUAN I.1 Tổng quan ung thƣ I.1.1 Khái niệm ung thư I.1.2 Phân loại khối u I.1.3 Tình hình ung thư giới I.1.4 Tình hình ung thư Việt Nam I.2 Ung thƣ cổ tử cung .5 I.2.1 Các giai đoạn ung thư cổ tử cung I.2.2 Phân loại tiền ung thư cổ tử cung I.2.3 Yếu tố nguy dẫn đến ung thư cổ tử cung I.2.4 Tình hình ung thư cổ tử cung giới I.2.5 Tình hình ung thư cổ tử cung Việt Nam I.3 Tổng quan HPV .9 I.3.1 Human papillomavirus (HPV) .9 I.3.2 Phân loại type HPV I.3.3 Ung thư gây HPV 10 I.3.4 Cơ chế gây bệnh ung thư HPV 11 I.4 Epigenetics, methyl hóa DNA đảo CpG 12 I.4.1 Epigenetics 12 SVTH: Trần Thị Thùy Trinh Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp I.4.2 Sự methyl hóa DNA 12 I.4.3 Đảo CpG 13 I.5 Gen DAPK (Death-Associated Protein Kinase) .14 I.5.1 Vị trí, cấu trúc 14 I.5.2 Chức 14 I.5.3 Sự methyl hóa gen DAPK 15 I.6 Phƣơng pháp xác định tính chất methyl hóa DNA 16 I.6.1 Phương pháp MSP (Methylation - specific PCR) 16 I.6.2 Phương pháp Nested-MSP 18 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 II.1 Vật liệu 19 II.2 Phƣơng pháp nghiên cứu .19 II.2.1 Khảo sát liệu 19 II.2.2 Khảo sát in silico 19 II.2.3 Khảo sát thực nghiệm .20 PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 28 III.1 Kết khai thác liệu .28 III.1.1 Bộ liệu tính chất methyl hóa vùng promoter gen DAPK loại ung thư 28 III.1.2 Bộ liệu tính chất methyl hóa vùng promoter thuộc gen DAPK ung thư cổ tử cung 32 III.2 Kết khảo sát in silico .39 III.2.1 Thu thập trình tự gen DAPK (Death – Associated Protein Kianase) .39 III.2.2 Xác định vị trí đảo CpG vị trí nhận biết nhân tố phiên mã vùng promoter thuộc gen DAPK 39 SVTH: Trần Thị Thùy Trinh Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp III.2.3 Thu thập khảo sát mồi methyl unmethyl phù hợp với phương pháp Nested–MSP 40 III.3 Kết khảo sát thực nghiệm .46 III.3.1 Kết phân tích tính chất methyl hóa vùng promoter thuộc gen DAPK mẫu dịch phết tế bào có tính chất nhiễm/không nhiễm HPV .47 II.3.2 Kết phân tích tương quan tính chất methyl hóa tính chất nhiễm HPV 48 III.3.2 Kết giải trình tự mẫu đại diện sản phẩm MSP thuộc gen DAPK .51 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 54 IV.1 Kết luận 54 IV.2 Đề nghị 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 PHỤ LỤC I SVTH: Trần Thị Thùy Trinh Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AC Adenoma carcinoma Bp Base pairs CIS Carcinomar in situ CIN Cervical intraepithelial neoplasia CpG Cytosine phosphodiester guanine DAPK Death-Associated Protein Kinase DNA Deoxyribonucleotic acid FIGO International Federation of Gynaecology and Obstetrics HPV Human papillomavirus IARC International Agency for Research on Cancer IDT Integrated DNA Technologies kD KiloDalton MF Methylated forward MR Methylated reverse MSP Methylation specific PCR NCBI National Center for Biotechnology Information NSCLC Non-small cell lung carcinoma NST Nhiễm sắc thể PCR Polymeration chain reaction QMSP Quantitative MSP RNA Ribonucleic acid SCC Squamous cell carcinomar SIL Squamous intraepithelial lesion SVTH: Trần Thị Thùy Trinh Trang i Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp STT Số thứ tự Tm Temperature melt UF Unmethylated forward UR Unmethylated reverse UTCTC Ung thƣ cổ tử cung WHO World Health Organization SVTH: Trần Thị Thùy Trinh Trang ii Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Phân loại tiền ung thƣ cổ tử cung: thuật ngữ cho tế bào học mô học Bảng 2.2: Thành phần phản ứng Nested-MSP Bảng 3.1: Bộ liệu tài liệu khoa học gen DAPK Bảng 3.2: Bộ liệu tính chất methyl hóa gen DAPK tổng số 11 công trình nghiên cứu Bảng 3.3: Tóm tắt ảnh hƣởng biến thiên tính chất methyl hóa gen DAPK nguy mắc ung thƣ cổ tử cung dựa vào số yếu tố nghiên cứu thực nghiệm đối chứng (case control study) Bảng 3.4: Thông tin mồi Nested-MSP gen DAPK Bảng 3.5: Khảo sát thông số vật lý mồi MSP mồi Nested-MSP gen DAPK Bảng 3.6: Sự tƣơng quan tính chất methyl hóa tính chất nhiễm HPV SVTH: Trần Thị Thùy Trinh Trang iii Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Sự phân chia tế bào bình thƣờng tế bào ung thƣ Hình 1.2: Tỷ lệ mắc tử vong ung thƣ tính 100.000 ngƣời/ năm giới (2012) Hình 1.3: Tỷ lệ mắc tử vong ung thƣ tính 100.000 ngƣời/ năm Việt Nam (2012) Hình 1.4: Sự methyl hóa bất thƣờng ung thƣ Hình 1.5: Vị trí gen DAPK NST số Hình 1.6: Chức gen DAPK kiểm soát chết theo chƣơng trình tế bào (apoptosis) Hình 1.7: Cơ chế chuyển đổi DNA sodium bisulfite Hình 1.8: Sự biến đổi DNA gốc sodium bisulfite Hình 1.9: Sơ đồ phƣơng pháp methylation - specific PCR (MSP) Hình 1.10: Sơ đồ phƣơng pháp Nested-MSP Hình 2.1: Chƣơng trình luân nhiệt trình biến đổi bisulfite Hình 2.2: Chu trình luân nhiệt cho phản ứng Nested-MSP Hình 3.1: Đồ thị mô tả phƣơng pháp sinh học phân tử đƣợc sử dụng để khảo sát tính chất methyl hóa vùng promoter gen DAPK Hình 3.2: Đồ thị mô tả loại mẫu đƣợc sử dụng khảo sát tính chất methyl hóa vùng promoter gen DAPK Hình 3.3: Đồ thị khảo sát loại ung thƣ liên quan đến tính chất methyl hóa vùng promoter gen DAPK Hình 3.4: Đồ thị ―Forest plot‖ phản ánh tƣơng quan tính chất methyl hóa gen DAPK nguy ung thƣ cổ tử cung theo phân tích mô hình ảnh hƣởng biến thiên Hình 3.5: Định vị gen DAPK NST số SVTH: Trần Thị Thùy Trinh Trang iv Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.6: Định vị đảo CpG vùng promoter gen DAPK Hình 3.7: Kết Annhyb cặp mồi xuôi mồi ngƣợc Nested-MSP trình tự vùng promoter gen DAPK Hình 3.8: Kết Annhyb cặp mồi xuôi mồi ngƣợc methyl trình tự vùng promoter gen DAPK Hình 3.9: Kết Annhyb cặp mồi xuôi mồi ngƣợc unmethyl trình tự vùng promoter gen DAPK Hình 3.10: Cấu trúc đảo CpG vùng promoter gen DAPK, vị trí nhận biết nhân tố phiên mã đảo CpG vị trí bắt cặp mồi gen DAPK Hình 3.11: Kết điện di sản phẩm MSP gen DAPK mẫu PAP1 - PAP12 Hình 3.12: Kết giải trình tự mẫu HP5 với cặp mồi methyl gen DAPK (DAPK MF DAPK - MR) Hình 3.13: Kết giải trình tự mẫu HP5 với cặp mồi unmethyl gen DAPK (DAPK - UF DAPK - UR) SVTH: Trần Thị Thùy Trinh Trang v Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp ĐẶT VẤN ĐỀ Theo báo cáo Tổ chức y tế Thế giới (World Health Organization – WHO, 2012), ung thƣ cổ tử cung (cervical cancer) bệnh ung thƣ đứng hàng thứ tƣ nhóm ung thƣ gây tử vong cao phụ nữ giới Hàng năm, giới có khoảng 528.000 trƣờng hợp mắc bệnh ung thƣ cổ tử cung khoảng 266.000 trƣờng hợp mắc ung thƣ cổ tử cung bị tử vong Ở Việt Nam, hàng năm có khoảng 5.146 trƣờng hợp ung thƣ cổ tử cung đƣợc phát hiện[83] Tỷ lệ chữa khỏi bệnh ung thƣ cổ tử cung tăng cao trƣờng hợp mắc bệnh đƣợc phát sớm có phác đồ điều trị thích hợp[98] HPV (Human Papillomavirus) thuộc họ Papillomaviridae[80], gồm có 100 type Nhóm HPV nguy cao nguyên nhân gây bệnh ung thƣ cổ tử cung, gồm type: 16, 18, 31, 33, 35, Nhóm HPV nguy thấp nguyên nhân dẫn đến bệnh lý sùi mào gà (Condyloma Acuminata), gồm type: 6, 11, 42, 43, 44 [13][15][79] Đáng lƣu ý, HPV type 16 HPV type 18 yếu tố nguy cao dẫn đến khoảng 70% trƣờng hợp ung thƣ cổ tử cung toàn giới[13][15][79] Một số công trình nghiên cứu Sharma cộng (2009), Zhao cộng (2008) xác định tính chất methyl hóa đảo CpG thuộc vùng promoter gen DAPK có chức ức chế khối u (tumor suppressor gene) liên quan đến trình sinh ung[69][91] Tính chất methyl hóa vƣợt mức (hypermethylation) DNA nhóm gen đƣợc ghi nhận dấu chứng sinh học (biomarker) đặc trƣng cho nhiều loại bệnh ung thƣ, cụ thể ung thƣ cổ tử cung[69] Gene DAPK (Death-associated protein kinase) nằm nhiễm sắc thể 9q21, mã hóa nhân tố điều hòa dƣơng chế chết theo chƣơng trình tế bào (apoptosis)[96] Ở trạng thái bình thƣờng, protein DAPK giữ vai trò ức chế trình sinh u[57][91] Công bố khoa học Zhao cộng (2008) khẳng định tính chất methyl hóa vƣợt mức đảo CpG thuộc vùng promoter gen DAPK bị methyl hóa dẫn đến ―đóng‖ hoạt động DAPK, hệ kích hoạt chế sinh ung[57][91] SVTH: Trần Thị Thùy Trinh Trang Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp Compared with Clinicopathological Findings and HPV PresenceInfectious, Diseases in Obstetrics and Gynecology, pp 1-5 72 Sriraksa R., Zeller C., El-Bahrawy M A., Dai W., Daduang J., Jearanaikoon P., Chau-In S., Brown R., Limpaiboon T (2011), CpG-island methylation study of liver fluke-related cholangiocarcinoma, British Journal of Cancer, 104(8), pp 1313-1318 73 Stamatelli A., Vlachou C., Aroni K., Papassideri I., Patsouris E., Saetta A A (2014), Epigenetic alterations in sporadic basal cell carcinomas, Archives of Dermatological Research, 306(6), pp 561-569 74 Sugita H., Iida S., Inokuchi M., Kato K., Ishiguro M., Ishikawa T., Takagi Y., Enjoji M., Yamada H., Uetake H., Kojima K., Sugihara K (2011), Methylation of BNIP3 and DAPK indicates lower response to chemotherapy and poor prognosis in gastric cancer, Oncology Reports, 25(2), pp 513-518 75 Sun Y., Li S., Shen K., Ye S., Cao D., Yang J (2015), DAPK1, MGMT and RAR promoter methylation as biomarkers for high-grade cervical lesions, International Journal of Clinical and Experimental Pathology 8, pp 14939-14945 76 Tahara T., Shibata T., Arisawa T., Nakamura M., Yamashita H., Yoshioka D., Okubo M., Yonemura J., Maeda Y., Maruyama N., Kamano T., Kamiya Y., Fujita H., Nakagawa Y., Nagasaka M., Iwata M., Hirata I (2010), CpG island promoter methylation (CIHM) status of tumor suppressor genes correlates with morphological appearances of gastric cancer, Anticancer Research, 30(1), pp 239-244 77 Takeuchi S., Matsushita M., Zimmermann M., Ikezoe T., Komatsu N., Seriu T., Schrappe M., Bartram C R., Koeffler H P (2011), Clinical Significance of Aberrant DNA Methylation in Childhood Acute Lymphoblastic Leukemia, Leukemia Research, 35(10), pp 1345-1349 78 Tang X., Khuri F R., Lee J J., Kemp B L., Liu D., Hong W K., Mao L (2000), Hypermethylation of the Death-Associated Protein (DAP) Kinase SVTH: Trần Thị Thùy Trinh Trang 65 Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp Promoter and Aggressiveness in Stage I Non-Small-Cell Lung Cancer, Journal of the National Cancer Institute, 92(18) 79 Villa L L., Denny L (2006), Methods for detection of HPV infection and its clinical utility, International Journal of Gynecology and Obstetrics 94 (Supplement 1), S71-S80 80 Villiers E M., Fauquet C., Broker T R., Bernard H U and Hausen H (2004), Classification of papillomaviruses, Virology 324, pp 17 – 27 81 Vinci S., Giannarini G., Selli C., Kuncova J., Villari D., Valent F., Orlando C (2011), Quantitative methylation analysis of BCL2, hTERT, and DAPK promoters in urine sediment for the detection of non-muscle-invasive urothelial carcinoma of the bladder: a prospective, two-center validation study, Urologic Oncology, 29(2), pp 150-156 82 Walboomers J M M., Jacobs M V., Manos M M., Bosch F X., Kummer J A., Shah K V., Snijders P J F., Peto J., Meijer C L M and Mun˜ oz N (1999), Human Papillomavirus Is A Necessary Cause Of Invasive Cervical Cancer Worldwide, Journal of pathology 189, pp 12–19 83 WHO/ICO Information Centre on HPV and Cervical Cancer (HPV Information Centre), Human Papillomavirus and Related Diseases in Viet Nam, Summary Report (2014) 84 Winkelstein W (1977), Smoking and cancer of the uterine cervix: hypothesis, American Journal of Epidemiology, 106(4), pp 257 – 259 85 Wisman G B A., Nijhuis E R., Hoque M O., Peters N R , Koning A J., Volders H H., Buikema H J., Boezen H M., Hollema H., Schuuring E., Sidransky D and Zee A G J (2006), Assessment of gene promoter hypermethylation for detection of cervical neoplasia, International Journal Cancer 119, pp 1908–1914 86 Xiong J., Li Y., Huang K., Lu M., Shi H., Ma L., Luo A., Yang S., Lu Z., Zhang J., Yang L., Wang S (2014), Association between DAPK1 promoter methylation and cervical cancer: a meta-analysis, PLoS One, 9(9) SVTH: Trần Thị Thùy Trinh Trang 66 Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp 87 Yang M and Park J Y (2012), DNA Methylation in Promoter Region as Biomarkers in Prostate Cancer, Cancer Epigenetics: Methods and Protocols 863, pp 69 88 Yang N., Nijhuis E R., Volders H H., Eijsink J J., Lendvai A., Zhang B., Hollema H., Schuuring E., Wisman G B., van der Zee A G (2010), Gene promoter methylation patterns throughout the process of cervical carcinogenesis, Cell Oncology, 32(1-2), pp 131-143 89 Zhang C Y., Jin Y T., Xu H Y., Zhang H., Zhang W M., Sun X Y., Tan C., Chen C M (2011), Relationship between promoter methylation of p16, DAPK and RAR beta genes and the clinical data of non-small cell lung cancer, Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi, 28(1), pp 23-28 90 Zhang Y., Wang R., Song H., Huang G., Yi J., Zheng Y., Wang J., Chen L (2011), Methylation of multiple genes as a candidate biomarker in nonsmall cell lung cancer, Cancer Letters, 303(1), pp 21-28 91 Zhao X L., Meng Z Y., Qiao Y H and Zhang H L (2008), Promoter methylation of DAPK gene in cervical carcinoma, Chinese Journal of Cancer, 27(9), pp 212-215 Internet 92 http://atlasgeneticsoncology.org/Genes/DAPK1ID417ch9q21.html, The Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology 93 http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_cancer.aspx, Globocan (IARC) 94 http://www.cancer.gov/types/cervical/pap-hpv-testing-fact-sheet, National Cancer Institute 95 http://www.cancer.org/cancer/cervicalcancer/detailedguide/cervical-cancerwhat-is-cervical-cancer, American Cancer Society 96 http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=DAPK1&keywords=dapk, GeneCards Human gene database 97 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1612, National Center for Biotechnology Information SVTH: Trần Thị Thùy Trinh Trang 67 Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp 98 http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en/, World health Organization 99 https://www.aacrfoundation.org/Pages/what-is-cancer.aspx, American Association for Cancer Reseach (AACR) 100 http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer_results.cgi, MethPrimer 101 http://www.who.int/reproductivehealth/publications/cancers/cervical-cancerguide/en/, Cervical cancer staging, World Health Organization – WHO, 2014 102 http://www.who.int/reproductivehealth/publications/cancers/cervical-cancerguide/en, Cancer and pre-cancer classification systems, World Health Organization – WHO 103 http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_population.aspx, GLOBOCAN 2012 (IARC), Viet Nam SVTH: Trần Thị Thùy Trinh Trang 68 Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp PHỤ LỤC Phụ lục 1: Sử dụng phần mềm MethPrimer cho vùng promoter gen DAPK SVTH: Trần Thị Thùy Trinh Trang I Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp Phụ lục 2: Kết Blast trình tự promoter gen DAPK NCBI SVTH: Trần Thị Thùy Trinh Trang II Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Trần Thị Thùy Trinh Trang III Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp Phụ lục 3: Tần suất methyl hóa gen DAPK loại ung thƣ TT Tên Phƣơng Loại Tổng Tổng Tổng mẫu Tần số TLTK ung pháp số mẫu unmethyl mẫu methyl 102 37 mẫu thƣ LEUC MSP Máu methyl (%) 65 36 Bodoor et al., 2014 LEUC MSP Mô 15 13 13 Takeuchi et al., 2011 BLC MSP Máu 42 27 15 64.3 Jablonowski et al., 2006 BLC MSP Mô 80 62 18 77 Christoph et al., 2006 BLC QMSP Mô 108 52 56 48 Vinci et al., 2011 OVC MSP Mô 32 16 16 50 Häfner et al., 2011 OVC MSP Máu 32 18 14 56 Häfner et al., 2011 CC MSP Mô 85 17 68 20 Chaopatchayakul et al., 2010 CC MSP Mô 42 14 28 33.33 Missaoui et al., 2010 10 CC MSP Mô 52 SVTH: Trần Thị Thùy Trinh 34 18 65.38 Zhao et al.,2008 Trang IV Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp 11 CC MSP Pap's 28 13 15 46.43 smear 12 CC MSP Nƣớc Wisman et al., 2006 16 15 6.25 Feng et al., 2007 140 21 119 15 Flatley et tiểu 13 CC MSP Pap's smear 14 CC MSP Pap's al.,2009 72 37 35 51.39 smear 15 CC MSP Pap's 2013 198 63 135 31.82 smear 16 CC QMSP Pap's Kalantari et al, Carestiato et al., 2013 48 35 13 72.92 smear Reesink-Peters et al., 2004 17 CC QMSP Mô 202 83 119 41.09 Sun et al., 2015 18 CC MSP Mô 78 35 43 44.87 Jeong et al.,2006 19 CC MSP Mô 82 37 45 45.12 Narayan et al., 2003 20 CC MSP Mô 53 40 13 75.47 Banzai et al., 2014 21 CC QMSP Mô 20 12 40 Yang et al., 2010 22 CC MSP Mô 69 11 58 15.94 Kahn et al., 2008 23 CC MSP Mô 33 21 12 63.64 Kang et al; 2006 24 CC MSP Pap's 92 62 30 67.39 Phuong et al., SVTH: Trần Thị Thùy Trinh Trang V Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp smear 2015 25 CC MSP Mô 48 12 36 25 Sun et al., 2015 26 GASC MSP Mô 69 33 36 47.8 KupčinskaitėNoreikienė et al., 2013 27 GASC MSP Mô 80 33 47 41 Sugita et al., 2011 28 GASC MSP Mô 146 127 19 87 Tahara et al., 2010 29 GASC MSP Mô 81 18 63 22.2 Kato et al., 2008 30 COLC MSP Mô 80 Almeida et al., 2015 31 COLC MSP Mô 7 100 Almeida et al., 2015 32 COLC MSP Mô 43 12 31 27.6 Kuester et al., 2010 33 COLC MSP Mô 43 21 22 48.3 Kuester et al., 2010 34 LC MSP Máu 23 18 22 Esteller et al., 1999 35 LC MSP Mô 135 59 76 44 Tang et al., 2000 36 LC Nested- Mô 314 53 261 17 Guo et al., 2015 SVTH: Trần Thị Thùy Trinh Trang VI Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp MSP 37 LC MSP Mô 107 63 44 58.5 Peng et al.,2010 38 LC MSP Máu 70 24 46 34 Niklinska et al., 2009 39 LC QMSP Máu 76 52 24 68.4 Hofmann et al., 2009 40 LC MSP Mô 107 17 90 15.9 Liu et al., 2008 41 KIDC MSP Mô 90 37 53 41 Christoph et al., 2006 42 KIDC QMSP Mô 110 81 29 74 Christoph et al., 2006 SVTH: Trần Thị Thùy Trinh Trang VII Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp Phụ lục 4: Tính chất methyl hóa vùng promoter gen DAPK 12 mẫu bệnh phẩm (PAP1 – PAP12) Tính chất nhiễm HPV Kết phản ứng Tính chất Nested-MSP methyl hóa Mẫu bệnh phẩm Type nguy Type nguy cao thấp Phản ứng Phản ứng methyl unmethyl Gen DAPK PAP1 18 + + + PAP2 18 + - + PAP3 18 + + + PAP4 58 + - + PAP5 16 + + + + + + + - + PAP6 PAP7 55 16 PAP8 + - + PAP9 11 - + - PAP10 - - + - PAP11 - - + - PAP12 - - + - SVTH: Trần Thị Thùy Trinh Trang VIII Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp Phụ lục 5: Thống kê nguy mắc ung thƣ cổ tử cung 11 công trình nghiên cứu SVTH: Trần Thị Thùy Trinh Trang IX Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp Phụ lục 6: Thống kê tần số methyl hóa mẫu bệnh phẫm nhiễm HPV type nguy cao/ nguy thấp/không nhiễm HPV SVTH: Trần Thị Thùy Trinh Trang X Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Trần Thị Thùy Trinh Trang [...]...Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp Do vậy, chúng tôi thực hiện đề tài Khóa luận tốt nghiệp: Khảo sát tính chất methyl hóa trên vùng promoter thuộc gen DAPK ở bệnh nhân Việt Nam với yếu tố nhiễm HPV Mục tiêu: Xác định tính chất methyl hóa DNA trên vùng promoter thuộc gen DAPK liên quan đến bệnh ung thƣ cổ tử cung ở Việt Nam, dựa trên bộ mẫu có tính chất nhiễm HPV type nguy cơ cao, nhiễm HPV nguy cơ thấp... trên các gen DAPK trên bộ mẫu có tính chất nhiễm HPV type nguy cơ cao/không nhiễm HPV, tính chất nhiễm HPV nguy cơ cao /nhiễm HPV nguy cơ thấp và không nhiễm HPV Khảo sát thực nghiệm dựa vào phƣơng pháp Nested-MSP nhằm khảo sát tính chất methyl hóa gen DAPK trên bộ mẫu có tính chất nhiễm HPV type nguy cơ cao/không nhiễm HPV, tính chất nhiễm HPV nguy cơ cao /nhiễm HPV nguy cơ thấp và không nhiễm HPV SVTH:... nhiễm HPV (mẫu lành) Nội dung nghiên cứu: Khảo sát bộ dữ liệu về tính chất methyl hóa vùng promoter gen DAPK liên quan đến bệnh ung thƣ cổ tử cung và tính chất nhiễm HPV type nguy cơ cao/không nhiễm HPV, tính chất nhiễm HPV nguy cơ cao /nhiễm HPV nguy cơ thấp và không nhiễm HPV Khảo sát bộ mồi phù hợp với phƣơng pháp sinh học phân tử (Nested-MSP) phù hợp nhằm khảo sát tính chất methyl hóa trên các gen. .. liệu về tính chất methyl hóa trên vùng promoter gen DAPK trên bộ mẫu ung thƣ, điển hình là ung thƣ cổ tử cung và bộ mẫu có tính chất nhiễm HPV hoặc không nhiễm HPV, nhiễm HPV type nguy cơ cao hoặc nguy cơ thấp trên thế giới Chúng tôi tổng hợp, xử lý và phân tích số liệu bằng phần mềm MedCalc phiên bản 16.4.3 Chúng tôi xác định mối tƣơng quan giữa tính chất methyl hóa vùng promoter gen DAPK và bệnh ung... đảo CpG trên vùng promoter của gen SVTH: Trần Thị Thùy Trinh Trang 19 Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp - Gene Promoter Miner (http://gpminer.mbc.nctu.edu.tw/): xác định vị trí nhận biết nhân tố phiên mã trên vùng promoter của gen II.2.2.3 Thu thập và khảo sát bộ mồi methyl và unmethyl phù hợp với phương pháp Nested-MSP Dựa vào các công bố khoa học thực nghiệm xác định tính chất methyl hóa trên gen DAPK, ... (2006) ghi nhận tính chất methyl hóa vƣợt mức vùng promoter gen DAPK trên ung thƣ cổ tử cung Kết quả nghiên cứu xác định tần suất methyl hóa ở mẫu mô ung thƣ cổ tử cung và mẫu mô cổ tử cung bình thƣờng (mẫu lành) lần lƣợt là 44,9% (35/78 mẫu bệnh phẩm ung thƣ) và 4,2% (1/24 mẫu lành)[38] Công trình nghiên cứu của Zhao và cộng sự (2008) khảo sát sự methyl hóa trên vùng promoter thuộc gen DAPK trên 52 mẫu... mềm Meta-analysis II.2.2 Khảo sát in silico II.2.2.1 Thu thập trình tự gen DAPK Thu thập trình tự gen DAPK trên cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) và cơ sở dữ liệu GeneCards (http://www.genecards.org/) II.2.2.2 Xác định vị trí đảo CpG và vị trí nhận biết nhân tố phiên mã trên vùng promoter thuộc gen DAPK Công cụ tin sinh học: - Methprimer (http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi):... methyl hóa gen DAPK ở hai trƣờng hợp lần lƣợt là 80% tƣơng ứng với 4/5 trƣờng hợp và 100% tƣơng ứng với 7/7 trƣờng hợp[6] I.6 Phƣơng pháp xác định tính chất methyl hóa DNA I.6.1 Phương pháp MSP (Methylation - specific PCR) Methylation – specific PCR (MSP) là phƣơng pháp đơn giản, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cho phép xác định tình trạng methyl hóa ở hầu hết đảo CpG thuộc vùng promoter trên từng gen[ 33]... DNA đƣợc xúc tác bởi nhóm enzym DNA methyltransferase, là phản ứng hóa học chuyển một nhóm methyl (CH3) từ S-adenosyl-methionine (SAM) đến vị trí C5 của phân tử Cytosine tạo thành dạng 5-methylcytosine (5mC)[53] Sự methyl hóa bất thƣờng gồm có methyl hóa vƣợt mức (hypermethylation) và giải methyl hóa (hypomethylation) Sự methyl hóa vƣợt mức tại vùng đảo CpG thuộc vùng promoter của gen ức chế khối u... 12 Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh lý và bệnh lý ở động vật có vú: biểu hiện gen, phát triển của phôi thai, tăng sinh tế bào, biệt hóa, in dấu bộ gen, bất hoạt nhiễm sắc thể X và ổn định nhiễm sắc thể[46][53] Sự methyl hóa DNA thƣờng xảy ra ở base Cytosine (C) đứng trƣớc base Guanosine (G) ở vùng điều hòa gen thuộc vùng promoter[ 4][46] Sự methyl hóa DNA đƣợc