Đang tải... (xem toàn văn)
Chuyên đề 1: Ứng dụng quy trình Multiplex – PCR phát hiện đồng thời các tác nhân gây ngộ độc thực phẩm.CHUYÊN ĐỀ 2: ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR HỖ TRỢ ĐỊNH DANH MỘT SỐ LOÀI VI SINH VẬTChuyên đề 3: Ứng dụng kỹ thuật PCR hỗ trợ định danh một số loài vi khuẩn lactic, từ đó ứng dụng trong lĩnh vực chăm sóc sức khỏe cho con người.Chuyên đề 4: Tiếp cận các công cụ tin sinh học để khai thác dữ liệu, khảo sát in silico trong việc chuẩn đoán một số bệnh di truyền, bệnh ung thư ở người…
MỤC LỤC CHUYÊN ĐỀ .3 A I TỔNG QUAN Đối tượng vi sinh vật: Kỹ thuật Multiplex - PCR: II NỘI DUNG Khảo sát liệu .3 Vật liệu Phương pháp Kiểm tra độ tinh nồng độ DNA III KẾT QUẢ .8 Kết PCR phương pháp điện di gel agarose B CHUYÊN ĐỀ 2: ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR HỖ TRỢ ĐỊNH DANH MỘT SỐ LOÀI VI SINH VẬT .10 VI NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG THUỘC NHÓM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO 10 I TỔNG QUAN 10 Đông trùng hạ thảo 10 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) .11 II NỘI DUNG 11 Khảo sát liệu 11 Vật liệu 12 Phương pháp 12 III KẾT QUẢ 16 I VI KHUẨN LACTIC DỰ TUYỂN LÀM PROBIOTIC CHO NGƯỜI 19 TỔNG QUAN 19 Vi khuẩn lactic 19 II NỘI DUNG 20 Khảo sát liệu 20 Vật liệu 21 Phương pháp 22 III KẾT QUẢ 25 - Kết PCR phương pháp điện di gel agarose 25 - Kết giải trình tự sản phẩm PCR 25 - Dựng phả hệ phân tử: (Sử dụng phần mềm BioEdict Mega6) 27 C CHUYÊN ĐỀ .28 I TỔNG QUAN 28 II NỘI DUNG 28 Khai thác liệu từ báo chuyên đề nội dung lý thuyết môn học Sinh học phân tử chăm sóc sức khỏe 28 Tiến hành khảo sát in silico báo số 8: DNA Methylation at the RARβ Promoter: A Potential Biomarker for Cervical Cancer 31 III KẾT LUẬN 37 A CHUYÊN ĐỀ Mục tiêu: Ứng dụng quy trình Multiplex – PCR phát đồng thời tác nhân gây ngộ độc thực phẩm I TỔNG QUAN Đối tượng vi sinh vật: Hiện tượng ngộ độc thực phẩm xảy ngày nhiều nhiều địa phương nước có nhiều trương hợp để lại hậu nghiêm trọng Có nhiều nguyên nhân dẫn đến ngộ độc thực phẩm, vi khuẩn nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm nhiều Các vi khuẩn gây ngộ độc thường gặp là: Salmonella spp., Escherichia coli, Bacillus cereus, Vibrio parahaemolyticus, Shigella spp., Vibrio cholerae, Staphylococcus aureus… Kỹ thuật Multiplex - PCR: Là cải tiến kỹ thuật PCR mà nhân lên đồng thời nhiều đoạn DNA mong muốn cách sử dụng nhiều cặp mồi cho phản ứng Sử dụng kỹ thuật Multiplex - PCR nhằm phát nhanh đồng thời vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm II NỘI DUNG Khảo sát liệu Đối tượng Phương nghiên cứu pháp Escherichia Multiplex Thực phẩm of a Multiplex (STX), coli, Listeria PCR Macao PCR Method hemolysin (hly), monocytogene, for the invasion (invA), Salmonella STT Tên báo Development Marker verocytotoxin Nguồn mẫu Detection of cholera toxin spp., Vibrio Six Common (ctx), cholerae, Foodborne thermolabile V.parahaemoly Pathogens hemolysin (tlh), ticus, thermostable Staphylococcus nuclease (nuc) aureus Rapid aerolysin (aero), Aeromonas detection of invasion plasmid hydrophila, six types of antigen H Shigella bacterial (ipaH), flexneri, pathogens in attachment Yersinia marine waters invasion locus enterocolitca, by multiplex (ail), invasion Salmonella PCR plasmid antigen typhimurium, B (ipaB), Vibrio enterotoxin parahaemolytic extracellular us multiplex Mẫu nước PCR biển Hồng Kong secretion protein (epsM), a species-specific region of the 16S–23S rDNA (Vpara) Detection of uidA, cth, invA, Escherichia Multiplex Loài thủy sản Microbial ctx tl coli, PCR (ốc, cua ) Pathogens in Salmonella Shellfish with typhimurium, V Multiplex ibrio PCR vulnificus, V cholerae, and V parahaemolytic us Vật liệu - Thu thập mẫu rau, thịt nghi ngờ có tác nhân gây ngộ độc thực phẩm - Mẫu rau B4, mẫu thịt B8 (Đã tăng sinh dịch tách chiết) Phương pháp - Thu mẫu xử lý mẫu Cân 10g mẫu + 90 ml NB đem ủ 370C/24h, thu huyền phù tế bào Tiếp tục ly tâm 5000 vòng/phút phút, thu tủa (sinh khối tế bào) Tách chiết DNA vi khuẩn (Phòng thí nghiệm chuẩn bị sẵn) - Thực phản ứng Multiplex PCR Chuẩn bị ống eppendorf ghi sẵn B4 (Mẫu rau) B8 (Mẫu thịt) Hút thành phần sau: Thực tủ PCR dH2O 17.3 µl Master Mix 3.2 µl GF 0.5 µl GR1 0.5 µl NF 0.5 µl NR 0.5 µl GR2 0.5 µl Thực tủ PCR DNA µl - Khảo sát nhiệt độ lai Ta có thông số nhiệt độ lai mồi sau: Mồi Ta GF 62.3 0C GR1 54.0 0C NF 56.1 0C NR 57.9 0C GR2 53.3 0C Nhận thấy khoảng nhiệt độ thích hợp cho phản ứng PCR 530C – 63 0C Chương trình luân nhiệt: chu kỳ 950C – phút; 35 chu kỳ 950C – 30 giây, 53 - 630C – 30 giây, 720C – 30 giây; chu kỳ 720C – phút; chu kỳ 40C ∞ - Lựa chọn nhiệt độ 53.0 0C, 54.9 0C, 56.70C, 59 0C, 63 0C để khảo sát MẪU RAU MẪU THỊT Line H F E D A H F E D A Group 5 Ta 53 54.9 63 53 54.9 56.7 59.1 63 DNA B4 B4 B2 B2 B4 B6 B8 B10 B10 B8 Giếng 10 11 12 56.7 59.1 (0C) Kiểm tra độ tinh nồng độ DNA - Tiến hành pha loãng: Hút µl DNA cho vào 77 µl H2O Hệ số pha loãng 80/3 Bảng giá trị đo OD Mẫu A260 A280 C A260/A280 Rau ( B4) 0,949 0,929 47,4520 1,0219 Thịt ( B8) 1,011 1,032 50,5498 0,9801 - Nhận xét Dựa vào số A260/A280, nhận thấy sản phẩm DNA sau tách chiết bị nhiễm protein mẫu rau B4 mẫu thịt B8 Nồng độ DNAB4= 47,4520 x 80/3= 1265.39 (µg/ml) Nồng độ DNA B8= 50,5498 x 80/3 = 1347.99 (µg/ml) III KẾT QUẢ Kết PCR phương pháp điện di gel agarose - Mẫu B4: giếng số - Mẫu B8: giếng số - Nhận xét chung: Phương pháp Multilex PCR khuếch đại thành công sản phẩm mẫu rau mẫu thịt khoảng nhiệt độ lai khảo sát Tuy nhiên, chưa trả lời nhiệt độ tối ưu cho cặp mồi - Nhận xét riêng: Phương pháp Multilex PCR khuếch đại thành công sản phẩm mẫu rau B4 (Giếng 2) mẫu thịt B8 (Giếng 9) Ở giếng khuếch đại băng sản phẩm 307 bp Mẫu nhiễm tác nhân vi khuẩn E coli Salmonella Ở giếng khuếch đại băng sản phẩm 307 bp 643 bp Mẫu nhiễm đồng thời tác nhân E coli Salmonella (307 bp), hai Staphylococcus aureus (643 bp) B CHUYÊN ĐỀ 2: ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR HỖ TRỢ ĐỊNH DANH MỘT SỐ LOÀI VI SINH VẬT VI NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG THUỘC NHÓM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO Mục tiêu: Ứng dụng kỹ thuật PCR hỗ trợ định danh số loài vi nấm ký sinh côn trùng thuộc nhóm đông trùng hạ thảo, từ ứng dụng lĩnh vực chăm sóc sức khỏe cho người I TỔNG QUAN Đông trùng hạ thảo - Đông trùng hạ thảo loại nấm ký sinh ấu trùng loại bướm Vào mùa đông, loại nấm cách xâm nhập vào ấu trùng bướm có hình dạng sâu Chúng ăn dần chất dinh dưỡng ấu trùng làm chúng chết dần Đến sợi nấm phát triển mạnh, sâu chết dần, chúng sâm nhập hoàn toàn sâu Tới giai đoạn đinh, thường vào mùa hè ấm áp, nấm bắt đầu mọc ra, vươn dài cỏ chui lên khỏi mặt đất, phát triển Từ mà tên đông trùng hạ thảo sinh - Đông trùng hạ thảo loại dược liệu quí (mùa đông dạng thuốc, mùa hè dạng thuốc), phát lần Trung Quốc từ lâu khoảng 620 sau công nguyên thức sử dụng vào kỷ 18, ngày nước phương Tây sử dụng làm loại thuốc hỗ trợ nhiều bệnh mạn tính - Tại Việt Nam, sau thời gian nghiên cứu nhiều năm GS TSKH Đái Duy Ban TS Lưu Tham Mưu nhân nuôi giống đông trùng hạ thảo 10 Thêm (0.2V2) ammonium acetate 3M Thêm (2V2) cồn tuyệt đối 60 µl 600 µl Ủ 4oC 60 phút Ly tâm 10.000 vòng /phút 20 phút Đổ dịch, thu cắn (thao tác dứt khoát) Rửa tủa Thêm vào EtOH 70% 500 µl Ly tâm 10.000 vòng /phút phút Hút bỏ dịch , thu tủa, phơi khô Bổ sung nước cất lần 15 µl Bảo quản DNA 4oC b Thực phản ứng PCR - Chuẩn bị ống eppendorf ký hiệu L8 L8’ Hút thành phần sau: Thực tủ PCR dH2O 10 µl Master Mix µl MF 0.5 µl MR 0.5 µl Thực tủ PCR DNA µl 23 Chương trình luân nhiệt: chu kỳ 950C – phút; 40 chu kỳ 950C – 35 giây, 55 - 590C – 45 giây, 720C – 35 giây; chu kỳ 720C – phút; chu kỳ 40C - ∞ - Khảo sát nhiệt độ 550C 590C Mẫu vi khuẩn lactic L8 Chạy phản ứng 55 oC Mẫu vi khuẩn lactic L8’ Chạy phản ứng 59 oC c Kiểm tra độ tinh nồng độ DNA - Tiến hành pha loãng: Hút µl DNA cho vào 77 µl H2O Hệ số pha loãng 80/3 Bảng giá trị đo OD 24 Mẫu A260 A280 C A260/280 Vk lactic (L8) 1,257 1,279 62,8716 0,9828 - Dựa vào số A260/A280, nhận thấy sản phẩm DNA sau tách chiết bị nhiễm protein mẫu vi khuẩn lactic L8 - Nồng độ DNAL8= 62,8716x 80/3= 1676.58 (µg/ml) III KẾT QUẢ - Kết PCR phương pháp điện di gel agarose Xuất băng sản phẩm mẫu L8 L8’ có kích thước 217 bp - Kết giải trình tự sản phẩm PCR Sau dùng phần mềm Chromas Lite để đọc kết giải trình tự, nhóm có trình tự nucleotide sau: Trình tự >1R sequence exported from 2R_D07_20130427-gttloc-(1).ab1 25 CATCGTATGTGCGTGTCCTTAGAGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCG TGGCTTTCTGGTTG GATACCGTCACGCCGACAACAGTTACTCTGCCGACCATTCTTCTCC AACAACAGAGTTTT ACGACCCGAAAGCCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGA CTTGCGTCCATTGTG GAAGATTCCCACAATGGAGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTG AGTGAAGAAGGCTTT CGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTGGAGAAGAATGGTCGCGAGTAAC TGTTGTCGGCGTGAC GGTTCCACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCACCGCGGT AATACGTAGGTGGCA AGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAGCGA - Đưa trình tự lên http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ để so sánh với sở liệu NCBI Ta có hình ảnh sau: 26 - Nhận xét: - Có thể kết giải trình tự thuộc nhóm vi khuẩn lactic - Dựng phả hệ phân tử: (Sử dụng phần mềm BioEdict Mega6) 27 C CHUYÊN ĐỀ Mục tiêu: Tiếp cận công cụ tin sinh học để khai thác liệu, khảo sát in silico việc chuẩn đoán số bệnh di truyền, bệnh ung thư người… I TỔNG QUAN - Công cụ tìm kiếm thông tin liệu internet rộng mở Với việc tiếp cận thao tác phần mềm tin sinh học giúp sinh viên khai thác triệt để nguồn liệu Google hay NCBI liên quan đến công trình nghiên cứu khoa học khảo sát in silico liên quan đến Công nghệ sinh học nói chung Sinh học phân tử chăm sóc sức khỏe nói riêng - Khảo sát in silico liên quan đến hướng chuẩn đoán/tiên lượng số bệnh di truyền, bệnh ung thư người ngày quan tâm trở nên cần thiết II NỘI DUNG Khai thác liệu từ báo chuyên đề nội dung lý thuyết môn học Sinh học phân tử chăm sóc sức khỏe Ung thư Bài báo Maker Gen Methyl hoá Methyl hóa Đột biến Methyl hóa promoter CpG gen CpG BRCA1 promoter promoter DAPK, RARb EGFR, K-ras RARb P16INK4 Phương pháp MSP, giải Giải trình tự, MSP trình tự Allele Specific 28 MSP Real-Time PCR Mồi Tách chiết cặp mồi cặp mồi mồi ngược cặp mồi methyl methyl và mồi xuôi methyl unmethyl unmethyl Phenol- Phenol- chloroform chloroform biến Epited biến đổi Kit bisulfic unmethyl Epited Kit Phản ứng PCR 95oC 30s, 95oC 30s, XoC 95oC 30s, 52oC 30s, 30s,72oC 30s 52oC 30s, 72oC 30s, (X nhiệt độ 72oC 30s, 72oC phút tối ưu tương 72oC phút ứng với mồi) Mẫu 95 mẫu ung 83 mẫu Pap thư vú 20 smear từ bệnh thư 27 mẫu Pap mẫu bình viện Âu Lạc, mear mẫu thường từ Việt Nam mô bệnh viện Y Dược TP.HCM 29 19 mẫu ung 32 mẫu gồm Cao cholesterol Bài báo Maker Đột biến Nhiều đột Đột biến LDLR R3500Q biến, không tìm thấy đột biến APOb R3500Q Gen ApoB LDLR gen LDLR Phương pháp Allen specific SSCP, giải SSCP, giải trình tự PCR trình tự Sanger pha bán rắn tự động Mồi mồi (1 mồi 18 cặp mồi cho phương xuôi, một pháp SSCP ngược, Hai cặp mồi: cặp 1: mồi mồi đặc hiệu) xuôi có gắn LOL,UOL, biotin.(hoặc ngược lại) ASO cặp 2: mồi ngược có gắn biotin.(hoặc ngược lại.) Tách chiết Genomic Prep Blood DNA Isolation Kit Phản ứng PCR 960C phút x 1, (96o phút, 54oC 1phút, 72oC phút) x 30, 72 0C 30 phút Mẫu 130 mẫu bệnh 80 mẫu bệnh cao nhân Cholesterol từ Petrozavordk 20 bệnh nhân FH bệnh viện Shariati có 30 mẫu bệnh nhân FH Tiến hành khảo sát in silico cụ thể báo số 8: DNA Methylation at the RARβ Promoter: A Potential Biomarker for Cervical Cancer - Thu thập sở liệu từ GenBank 31 32 33 - Từ ta khảo sát đoạn sử dụng làm mồi xuôi Trình tự chưa biến đổi bisulfite 5’CCGAGAACGCGAGCGATCCGAGCAGGGTTTGTCTGGGCACC GTCGGGGTAGGATCCGGAACGCATTCGGAAGGCTTTTGCAAGC ATTTACTTGGAAGGAGAACTTGGGATCTTTCTGGGAACCCCCC GCCCCGGCTGGATTGGCC3’ 3’GGCTCTTGCGCTCGCTAGGCTCGTCCCAAACAGACCCGTGGC AGCCCCATCCTAGGCCTTGCGTAAGCCTTCCGAAAACGTTCGT AAATGAACCTTCCTCTTGAACCCTAGAAAGACCCTTGGGGGGC GGGGCCGACCTAACCGG 5’ 34 Trình tự sau biến đổi bisulfite 5’TCGAGAACGCGAGCGATTCGAGTAGGGTTTGTTTGGGTATC GTCGGGGTAGGATTCGGAACGTATTCGGAAGGTTTTTGTAAGT ATTTATTTGGAAGGAGAATTTGGGATTTTTTTGGGAATTTTTC GTTTCGGTTGGATTGGTT3’ 3’AGCTCTTGCGCTCGCTAAGCTCATCCCAAACAAACCCATAG CAGCCCCATCCTAAGCCTTGCATAAGCCTTCCAAAAACATTCA TAAATAAACCTTCCTCTTAAACCCTAAAAAAACCCTTAAAAAG CAAAGCCAACCTAACCAA 5' Sử dụng phần mềm Methprimer để biến đổi bisulfite (http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi) 35 Trình tự sản phẩm MSP lần (Chu kỳ 1) 5’TCGAGAACGCGAGCGATTCGAGTAGGGTTTGTTTGGGTATCGTC GGGGTAGGATTCGGAACGTATTCGGAAGGTTTTTGTAAGTATTTA TTTGGAAGGAGAATTTGGGATTTTTTTGGGAATTTTTCGTTTCGGT TGGATTGGTT3’ 3’AGCTCTTGCGCTCGCTAAGCTCATCCCAAACAAACCCATAGCAG CCCCATCCTAAGCCTTGCATAAGCCTTCCAAAAACATTCATAAAT AAACCTTCCTCTTAAACCCTAAAAAAACCCTTAAAAAGCAAAGCC AACCTAACCAA5’ Trình tự sản phẩm MSP lần (Chu kỳ 2) 3’AGCTCTTGCGCTCGCTAAGCTCATCCCAAACAAACCCATAGCAG CCCCATCCTAAGCCTTGCATAAGCCTTCCAAAAACATTCATAAAT AAACCTTCCTCTTAAACCCTAAAAAAACCCTTAAAAAGCAAAGCC AACCTAACCAA5’ 36 5’TCGAGAACGCGAGCGATTCGAGTAGGGTTTGTTTGGGTATCGTC GGGGTAGGATTCGGAACGTATTCGGAAGGTTTTTGTAAGTATTTA TTTGGAAGGAGAATTTGGGATTTTTTTGGGAATTTTTCGTTTCGGT TGGATTGGTT3’ III KẾT LUẬN Đảo CpG bị methyl (1) mồi CG mạch dương gắn vào mạch âm; (2) mồi GC mạch âm gắn vào mạch dương Đảo CpG không bị methyl (1) mồi TG mạch dương gắn vào mạch âm.; (2) mồi CA mạch âm gắn vào mạch dương 37 [...]... khoa học và khảo sát in silico liên quan đến Công nghệ sinh học nói chung và Sinh học phân tử trong chăm sóc sức khỏe nói riêng - Khảo sát in silico liên quan đến hướng chuẩn đoán/tiên lượng một số bệnh di truyền, bệnh ung thư ở người đang ngày được quan tâm và trở nên cần thiết II NỘI DUNG 1 Khai thác dữ liệu từ các bài báo chuyên đề trong nội dung lý thuyết môn học Sinh học phân tử trong chăm sóc sức. .. nấm ký sinh côn trùng - Kết quả phả hệ phân tử: (Sử dụng phần mềm BioEdict và Mega6) VI KHUẨN LACTIC DỰ TUYỂN LÀM PROBIOTIC CHO NGƯỜI Mục tiêu: Ứng dụng kỹ thuật PCR hỗ trợ định danh một số loài vi khuẩn lactic, từ đó ứng dụng trong lĩnh vực chăm sóc sức khỏe cho con người I TỔNG QUAN 1 Vi khuẩn lactic - Vi khuẩn lactic (LAB) đóng vai trò rất quan trọng đối với sức khoẻ, được sử dụng rất nhiều trong. .. cây phả hệ phân tử: (Sử dụng phần mềm BioEdict và Mega6) 27 C CHUYÊN ĐỀ 3 Mục tiêu: Tiếp cận các công cụ tin sinh học để khai thác dữ liệu, khảo sát in silico trong việc chuẩn đoán một số bệnh di truyền, bệnh ung thư ở người… I TỔNG QUAN - Công cụ tìm kiếm thông tin và dữ liệu trên internet hiện nay rất rộng mở Với việc tiếp cận các thao tác cơ bản trên những phần mềm tin sinh học giúp sinh viên khai... µl Ủ ở 4oC trong 60 phút Ly tâm 10.000 vòng /phút trong 20 phút 13 Đổ dịch, thu cắn (thao tác dứt khoát) Rửa tủa Thêm vào EtOH 70% 500 µl Ly tâm 10.000 vòng /phút trong 5 phút Hút bỏ dịch nổi, thu tủa, phơi khô Bổ sung nước cất 2 lần 15 µl Bảo quản DNA ở 4oC b Thực hiện phản ứng PCR Chuẩn bị 2 ống eppendorf ký hiệu N4 và N4’ Hút lần lượt các thành phần sau vào 2 eppendorf: Thực hiện trong tủ PCR... ứng chuỗi trùng hợp khuếch đại số lượng một phân đoạn DNA nào đó trong ống nghiệm để tạo ra một số lượng lớn hơn hàng triệu đến hàng tỷ lần so với số lượng ban đầu nhằm các mục đích khác nhau như nhân dòng, đọc trình tự, phát hiện sự có mặt của bệnh tật, pháp y, phả hệ, an toàn thực phẩm… II NỘI DUNG 1 Khảo sát dữ liệu STT Tên bài báo Marker Phương pháp Vi sinh vật 1 Differentiation of Vùng ITS PCR-single-... khoát) Rửa tủa Thêm vào EtOH 70% 500 µl Ly tâm 10.000 vòng /phút trong 5 phút Hút bỏ dịch nổi , thu tủa, phơi khô Bổ sung nước cất 2 lần 15 µl Bảo quản DNA ở 4oC b Thực hiện phản ứng PCR - Chuẩn bị 2 ống eppendorf ký hiệu L8 và L8’ Hút lần lượt các thành phần sau: Thực hiện trong tủ PCR dH2O 10 µl Master Mix 2 µl MF 0.5 µl MR 0.5 µl Thực hiện ngoài tủ PCR DNA 2 µl 23 Chương trình luân nhiệt: 1 chu... Streptococcus, Lactococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Pediococcus, hoặc hình que như Lactobacillus Giống Lactobacillus là giống lớn nhất trong 13 giống vi khuẩn sinh acid lactic với hơn 100 loài được mô tả bởi Hugenholtz (1998) II NỘI DUNG 1 Khảo sát dữ liệu STT Tên bài báo Marker Đối tượng Phương pháp Nguồn mẫu Species- Thịt specific PCR (Artisanal nghiên cứu 1 Microbial 16S-23S Quality and ribosoma Direct... huyền phù tế bào Tiếp tục ly tâm ở 5000 vòng/phút trong 5 phút, thu tủa (sinh khối tế bào) 21 3 Phương pháp a Tách chiết DNA Phá vỡ tế bào dH2O 615 µl NaCl 2.5M 14 µl Tris – HCl 1M 14 µl EDTA 0.5M 14 µl SDS 90% 33 µl Proteinase K 10 µl Dung dịch phá vỡ tế bào có ∑V = 700 µl Bổ sung lần lượt vào eppendorf chứa sẵn sinh khối tế bào vi khuẩn Đem ủ ở 560C/60’ trong bể ổn nhiệt Loại bỏ protein Thêm Phenol-... µl : 250 µl dung dịch DNA Ly tâm 10.000 vòng /phút trong 10 phút Thu dịch nổi vào epp mới (V) 400 µl Thêm Cloroform vào dịch nổi vừa thu 250µl được Ly tâm 10.000 vòng /phút trong 5 phút Thu dịch nổi vào epp mới (V2) 300 µl Tủa DNA 22 Thêm (0.2V2) ammonium acetate 3M Thêm (2V2) cồn tuyệt đối 60 µl 600 µl Ủ ở 4oC trong 60 phút Ly tâm 10.000 vòng /phút trong 20 phút Đổ dịch, thu cắn (thao tác dứt khoát)... (96o 1 phút, 54oC 1phút, 72oC 1 phút) x 30, 72 0C 5 30 phút Mẫu 130 mẫu bệnh 80 mẫu bệnh cao nhân ở Cholesterol từ Petrozavordk 20 bệnh nhân FH bệnh viện Shariati trong đó có 30 mẫu bệnh nhân FH 2 Tiến hành khảo sát in silico cụ thể trên bài báo số 8: DNA Methylation at the RARβ Promoter: A Potential Biomarker for Cervical Cancer - Thu thập cơ sở dữ liệu từ GenBank 31 32 33 - Từ đây ta khảo sát được