Nghiên cứu nhân giống in vitro cây Thổ nhân sâm (Talinum crassifolium Willd) (Luận văn thạc sĩ)

Nghiên cứu nhân giống in vitro cây Thổ nhân sâm (Talinum crassifolium Willd) (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu nhân giống in vitro cây Thổ nhân sâm (Talinum crassifolium Willd) (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu nhân giống in vitro cây Thổ nhân sâm (Talinum crassifolium Willd) (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu nhân giống in vitro cây Thổ nhân sâm (Talinum crassifolium Willd) (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu nhân giống in vitro cây Thổ nhân sâm (Talinum crassifolium Willd) (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu nhân giống in vitro cây Thổ nhân sâm (Talinum crassifolium Willd) (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu nhân giống in vitro cây Thổ nhân sâm (Talinum crassifolium Willd) (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu nhân giống in vitro cây Thổ nhân sâm (Talinum crassifolium Willd) (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu nhân giống in vitro cây Thổ nhân sâm (Talinum crassifolium Willd) (Luận văn thạc sĩ)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN THỊ TRANG

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO

CÂY THỔ NHÂN SÂM (Talinum crassifolium Willd)

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2016

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN THỊ TRANG

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO

CÂY THỔ NHÂN SÂM (Talinum crassifolium Willd)

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGUYỄN THỊ TÂM

THÁI NGUYÊN - 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi thực hiê ̣n dưới

sự hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn Thị Tâm Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng ai công bố trong một công trình nào khác

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Trang

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Tâm, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư Phạm Thái Nguyên đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận văn này

Tôi xin cảm ơn thầy cô giáo và các anh chi ̣ kỹ thuật viên tại phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, Khoa Sinh học trường đại học Sư Phạm Thái Nguyên đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình làm luận văn thạc sĩ

Trong thời gian thực hiện luận văn thạc sĩ tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, Viện Nghiên cứu và Phát triển Lâm Nghiệp - Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, tôi luôn nhận được sự giúp đỡ của Ban lãnh đạo Viện, các

kỹ thuật viên tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học đã tận tình giúp đỡ hướng dẫn tôi làm các thí nghiệm của luận văn thạc sĩ

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Khoa ho ̣c sự sống và các thầy cô giáo, cán bộ trong Khoa, đặc biệt là sự quan tâm, giúp đỡ của các anh chị kỹ thuật viên phòng thí nghiệm khoa Khoa ho ̣c sự sống

Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè luôn bên cạnh ủng hộ, khuyến khích, động viên tạo động lực để tôi hoàn thành luận văn này

Trong quá trình làm luận văn không tránh khỏi những sai sót, tôi mong nhận được sự đóng góp quý báu từ phía thầy cô và bạn bè để tôi có thể làm tốt hơn

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Trang

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục các từ và chữ viết tắt v

Danh mục bảng vi

Danh mục hình vii

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Giới thiệu về cây Thổ nhân sâm 4

1.1.1 Đặc điểm phân loại và hình thái cây Thổ nhân sâm 4

1.1.2 Đặc điểm phân bố cây Thổ nhân sâm 5

1.1.3 Đặc điểm sinh thái, trồng trọt cây Thổ nhân sâm 5

1.1.4 Thành phần hóa học và giá trị dược liệu của cây Thổ nhân sâm 6

1.2 Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật 8

1.2.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 9

1.2.2 Vai trò của một số chất kích thích sinh trưởng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 11

1.3 Các giai đoạn trong quy trình nhân giống vô tính in vitro 15

1.3.1 Giai đoạn I - Cấy gây 15

1.3.2 Giai đoạn II - Nhân nhanh 15

1.3.3 Giai đoạn III - Chuẩn bị và đưa ra ngoài đất 16 1.4 Một số thành tựu nhân giống cây dược liệu bằng phương pháp nuôi

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Vật liệu, hoá chất, thiết bị, địa điểm nghiên cứu 21

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 21

2.1.2 Hoá chất, thiết bị 21

2.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 21

2.2 Phương pháp nghiên cứu 21

2.2.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy 21

2.2.2 Phương pháp nuôi cấy in vitro 22

2.2.3 Đưa cây ra môi trường tự nhiên 24

2.3 Điều kiện thí nghiệm 26

2.4 Phương pháp xử lý số liệu 26

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 Kết quả nghiên cứu khử trùng hạt 27

3.1.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% đến hiệu quả khử trùng 27

3.1.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch javel 60% đến hiệu quả khử trùng 28

3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh và sự sinh trưởng của chồi Thổ nhân sâm trong ống nghiệm 31

3.2.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP đến khả năng nhân chồi Thổ nhân sâm 31

3.2.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP kết hợp kinetin đến khả năng nhân chồi Thổ nhân sâm 34

3.2.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IBA tới khả năng nhân chồi Thổ nhân sâm 36

3.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ chồi cây Thổ nhân sâm 38

3.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống, sinh trưởng và phát triển của cây con in vitro ngoài vườn ươm 39

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

PHỤ LỤC 47

DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DNA : Deoxyribonucleic acid

BAP : 6 - benzyl amino purine

IAA : 3 - indol acetic acid

IBA : 3 - indol butyric acid

Kinetin : 6 - furfuryl- aminopurine

NAA : α - naphthalene acetic acid

2,4 - D : 2,4 - dichlorophenoxy acetic acid

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả khử trùng hạt Thổ nhân sâm bằng HgCl2 0,1% 28 Bảng 3.2 Kết quả khử trùng hạt Thổ nhân sâm bằng javen 60% 29 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của hàm lượng BAP đến khả năng nhân chồi Thổ

nhân sâm 32 Bảng 3.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP kết

hợp kinetin đến khả năng nhân chồi Thổ nhân sâm 34 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của hàm lượng BAP kết hợp với IBA đến khả

năng nhân nhanh chồi Thổ nhân sâm 36 Bảng 3.6 Ảnh hưởng của của IBA đến khả năng ra rễ chồi Thổ nhân sâm 38 Bảng 3.7 Kết quả ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống, sinh trưởng

và phát triển của cây con in vitro ngoài vườn ươm 40

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cây Thổ nhân sâm ngoài tự nhiên 4

Hình 3.1: Kết quả khử trùng hạt bằng HgCl2 0,1% và dung dịch javel 60% 30 Hình 3.2: Ảnh hưởng của hàm lượng BAP đến khả năng nhân nhanh

chồi Thổ nhân sâm 33 Hình 3.3: Ảnh hưởng của hàm lượng BAP kết hợp kinetin đến khả

năng nhân nhanh chồi Thổ nhân sâm 36 Hình 3.4: Ảnh hưởng của hàm lượng BAP kết hợp với IBA đến khả

năng nhân chồi cây Thổ nhân sâm 37 Hình 3.5: Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ của chồi Thổ nhân sâm 39 Hình 3.6: Cây con trồng trong các giá thể khác nhau sau 30 ngày 41

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Theo lịch sử y học cổ truyền của Trung Quốc từ 3000 năm trước Công nguyên, nhân sâm đã được nói đến như là một thần dược trong “Thần nông bản thảo” của vua Thần Nông

Sâm là tên gọi khái quát chỉ một số loại cây thân thảo mà củ và rễ được

sử dụng làm thuốc từ rất lâu đời tại nhiều nước châu Á, thuộc nhiều chi họ khác nhau nhưng chủ yếu là các loại thuộc chi Sâm [2]

Cây nhân sâm có tên khoa học là Panax Gingseng C.A Mey Củ sâm

có rất nhiều hình dạng, tư thế giống con người, do đó được gọi là nhân sâm

Nhân sâm thuộc họ Araliaceae là một loại dược phẩm quý hiếm có ở nhiều

nơi như: Nhật Bản, Trung Quốc, Hoa Kỳ và đặc biệt ở Hàn Quốc Dân Hàn Quốc coi nhân sâm là tặng phẩm của trời đất Đông y coi nhân sâm là vị thuốc đứng đầu các vị thuốc theo thứ tự: Sâm, Nhung, Quế, Phụ Có rất nhiều loại sâm, để phân biệt thường người ta gọi thêm tên địa phương hoặc màu sắc vào tên gọi [2]

Ở Việt Nam có các giống sâm như: Sâm Ngọc Linh, Sâm Bố Chính, Đảng Sâm, Tây Dương Sâm [2]

Thổ nhân sâm (Talinum crassifolium Willd) còn được gọi là Thổ cao ly sâm hay Đông dương sâm, sâm thảo, thuộc họ rau sam - Portulacaceae [2]

Thổ nhân sâm gồm nhiều thành phần hóa học khác nhau, trong đó có saponin tetracyclic nhóm Damavan gọi chung là gingsenosid Ngoài ra, còn có saponin với aglicon là acid oleanolic, các vitamin B1, vitamin B2, phytosterol, tinh dầu, đường, tinh bột Thổ nhân sâm có tác dụng bổ dưỡng toàn thân, suy nhược thần kinh, cơ thể hao tổn, tăng sức lực cho người già,

người mới ốm dậy, kém ăn mất ngủ, hay quên Theo một số nghiên cứu, do nhân sâm chứa nhiều chất chống oxy hóa nên có thể phòng ngừa một số bệnh như: Ung thư, bệnh tim mạch, thần kinh, chống căng thẳng, tăng sức đề kháng chống lại nhiễm trùng Tác dụng của nhân sâm rất tốt nhưng phải biết dùng phù hợp với từng đối tượng và theo liều lượng khuyến cáo Đông y coi Thổ nhân sâm là nhân sâm của người nghèo vì nó chứa nhiều công dụng giống nhân sâm mà giá thành rẻ và sẵn có trong tự nhiên [2]

Hiện nay, với những kinh nghiệm sử dụng dược liệu của người dân và việc khai phá rừng một cách ồ ạt đã làm cho nguồn tài nguyên thực vật suy giảm nghiêm trọng trong đó có những cây thuốc quý hiếm

Chính vì vai trò quan trọng của cây Thổ nhân sâm nên việc nhân giống chúng là rất cần thiết Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi lựa

chọn đề tài: “Nghiên cứu nhân giống in vitro cây Thổ nhân sâm” (Talinum

crassifolium Willd)

2 Mục tiêu nghiên cứu

Xác định được môi trường thích hợp cho nhân giống cây Thổ nhân sâm trong ống nghiệm

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Nghiên cứu khử trùng hạt tạo mẫu sạch ban đầu trong ống nghiệm 3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh và sự sinh trưởng của chồi Thổ nhân sâm trong ống nghiệm

3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ chồi Thổ nhân sâm trong ống nghiệm

3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống, sinh trưởng và

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

4.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu xác định được môi trường thích hợp cho nhân giống cây Thổ nhân sâm bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật, đánh giá được tác động của các chất kích thích sinh trưởng, thành phần môi trường nuôi cấy và thời gian khử trùng mẫu cấy, bổ sung thêm dữ liệu cho việc nghiên cứu các loại cây dược liệu khác

4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu đảm bảo cung cấp được số lượng lớn cây giống có chất lượng cao, đồng đều cho sản xuất không phụ thuộc vào mùa vụ

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về cây Thổ nhân sâm

1.1.1 Đặc điểm phân loại và hình thái cây Thổ nhân sâm

Thổ nhân sâm có tên khoa học là: Talinum crassifolium Willd (Talinum patens L., Talinum panicuiatum Gaertn) Ngoài ra, cây Thổ nhân sâm còn một số

tên gọi khác: Sâm cao ly, Thổ sâm cao ly, Giả nhân sâm, Sâm thảo,Sâm đất [31]

Thổ nhân sâm thuộc giới thực vật (Plantae), ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta), lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida), bộ Cẩm Chướng (Caryophyllales),

họ Rau Sam (Portulacaceae), chi Sâm mùng tơi (Talinum) [34]

Thổ nhân sâm là cây thân thảo, sống hằng năm, cao 30-50 cm, thân hình trụ nhẵn, phân cành ngay từ gốc [8]

Lá mọc so le, dày gần như không có cuống hoặc cuống rất ngắn, hình bầu dục hoặc hình trứng, gốc thuôn, đầu tù hoặc hơi nhọn, gân lá mờ, hai mặt nhẵn gần như cùng màu, phiến lá dày, lá dài 5 - 7cm, rộng 2,5 - 3,5cm [8]

Cụm hoa là một chùy kép mọc ở đầu cành, gồm nhiều hoa nhỏ đường kính ước 6mm, tràng 5 cánh hoa màu tím đỏ nhạt, đài có hai răng nhỏ, tràng năm cánh nhọn, nhị nhiều, bầu thượng hình cầu [8]

Quả nhỏ, hình cầu, khi chín màu đỏ nâu; hạt dẹt, rất nhỏ, màu đen nhánh, trên mặt hơi nổi vân Củ gần giống củ nhân sâm [8]

Mùa ra hoa tháng 6-7, có quả tháng 9-10 [8]

Hình 1.1: Cây Thổ nhân sâm ngoài tự nhiên [31]

1.1.2 Đặc điểm phân bố cây Thổ nhân sâm

Thổ nhân sâm có nguồn gốc từ Trung Mỹ, du nhập vào Việt Nam khoảng năm 1909, sau đó mọc hoang khắp nơi, ra hoa quanh năm [8]

Thổ nhân sâm cũng mọc hoang và được trồng làm cảnh ở một số tỉnh của Trung Quốc như: Triết Giang, Giang Tô, An Huy, Quảng Tây, Quảng Đông, Tứ Xuyên, người ta gọi cây này với tên Thổ nhân sâm, Thổ cao ly sâm, v.v… và cũng dùng làm thuốc bổ thay sâm [6], [8]

Ở Việt Nam, Thổ nhân sâm là cây trồng tự nhiên để làm thuốc, lấy rau

ăn và trồng làm cảnh Cây gặp nhiều ở các tỉnh: Thái Nguyên, Bắc Kạn, Hà Giang, Tuyên Quang, Hòa Bình, Lạng Sơn, Cao Bằng, Hải Phòng, Nghệ An…[6]

1.1.3 Đặc điểm sinh thái, trồng trọt cây Thổ nhân sâm

Thổ nhân sâm ưa đất ẩm nhưng nhiều ánh nắng, rất dễ trồng, có thể thu hoạch lá quanh năm Khi thu hoạch thì cắt nhánh để đâm chồi, cho ra lứa rau sâm khác Ngoài ra, rau sâm còn được trồng trong các chậu kiểng vì cây cho

ra hoa bé xinh, phớt hồng rất đẹp [8]

Thổ nhân sâm có thể trồng từ rễ củ hoặc từ hạt Có thể trồng trong vườn, trong chậu cảnh hay thùng xốp Cây mọc khỏe, sau 2 - 3 tháng có thể hái ngọn và lá làm rau ăn, sau một năm có thể thu hoạch củ, nếu để lâu năm

củ sẽ to hơn Lá và cành non dùng để nấu với thịt, tôm… Nấu canh rau vị thơm mát dễ chịu gần giống rau mùng tơi [13]

 Nguồn giống từ hạt

Hạt giống sau khi thu hái được xử lý bằng nước ấm (2 sôi + 3 lạnh) ngâm trong nước khoảng 6 - 8 giờ, vớt ra để ráo, dùng que nhọn chọc lỗ sâu 1cm rồi cho hạt vào (2 - 3 hạt/lỗ), lấp kín đất, dùng lưới che nắng cho luống gieo [13]

 Nguồn giống từ hom

Chọn hom: hom được lấy từ thân hoặc củ cây mẹ, lấy từ đoạn gốc đến hết phần bánh tẻ của thân, hạn chế lấy phần ngọn quá non, dễ bị thối gốc khi giâm

Dùng dao hay kéo sắc để cắt hom Hom được cắt từ thân có chiều dài khoảng 10 - 20cm và ít nhất trên mỗi hom có 3 - 4 mắt lá, tỉa bớt lá trên hom còn chừa khoảng 1/3 lá, đem giâm vào luống Thường xuyên tưới ẩm Sau khi giâm 15 - 20 ngày hom giâm bắt đầu ra rễ thì đem trồng [13]

Cách trồng bằng hạt: Cây không kén đất, đất nào cũng mọc được trừ những nơi ngập úng Đất cày bừa lên thành luống cao 20 - 25cm, bón lót 10 -

15 tấn/ha phân chuồng, rạch thành hàng cách nhau 20cm Hạt gieo theo hàng, sau tỉa bớt, giữa các cây cách nhau khoảng cách 10 - 15cm Đất trồng pha trộn theo tỷ lệ: 80% đất thịt + 10% tro trấu hoặc rơm mục + 10% phân chuồng ủ

hoai Thường xuyên tưới nước giữ ẩm cho đất, đặc biệt vào mùa nắng hạn

Thường xuyên làm cỏ, xới xáo, vun gốc, bón thúc bằng nước phân chuồng, nước giải hoặc đạm pha loãng Kết hợp nhổ cỏ dại và phòng trừ sâu xám ăn lá

và chồi non Thổ nhân sâm ra hoa quả hàng năm, mùa ra hoa tháng 6 - 7, mùa

ra quả tháng 9 - 10 Khi quả chín cần thu hoạch kịp thời nếu không quả sẽ bị tách làm hạt bị rụng Đem phơi cả quả, khi khô đập lấy hạt rồi phơi hạt trong nắng yếu cho khô Hạt tốt là những hạt có màu đen nhánh, bóng Bảo quản trong lọ sành, để nơi khô ráo [13]

Thổ nhân sâm thường dùng củ Loại cây một năm đã có thể thu hoạch rễ

củ, nhưng tốt nhất là sau ba năm Nếu dùng ngay cắt rễ con bỏ đầu để cả vỏ thái miếng sấy nhẹ lửa (60 - 700C) cho khô Nếu để lâu, đồ chín, bỏ rễ con, để

cả củ (hoặc thái miếng), sấy nhẹ lửa cho khô Lúc mới đào rễ có màu hồng đẹp Đem phơi hay sấy khô và để lâu sẽ có màu đen xám Khi dùng thái mỏng, tẩm nước gừng hoặc nước đường, đồ chín Lá thu hoạch quanh năm [13]

1.1.4 Thành phần hóa học và giá trị dược liệu của cây Thổ nhân sâm

Nghiên cứu về thành phần hóa học trong cây Thổ nhân sâm, người ta

đã phát hiện có các chất phitosterol, saponin, flavonoid, tannin, steroid và các chất vô cơ kali, natri, canxi, magie, sắt Rễ chứa I-hexacosanol, I-octacosanol, I-triacontanol, campestrol, stigmasterol, jo-sitostero, rễ còn có dẫn xuất phenolic [6]

Theo y học hiện đại, người ta đã nghiên cứu chất octacosanol trong cây Thổ nhân sâm có tác dụng chống siêu vi gây bệnh Herp, các viêm nhiễm ngoài

da, hỗ trợ chữa bệnh Parkinson, bệnh tim và làm hạ Cholesterol máu [31]

Theo y học cổ truyền, Thổ nhân sâm có vị ngọt, tính bình, có tác dụng

bổ trung ích khí, nhuận phế sinh tân [10]

Thổ nhân sâm thường dùng chữa suy nhược ốm yếu, thể hư ra nhiều

mồ hôi, tỳ hư tiêu chảy, đái dầm, kinh nguyệt không đều, thiếu sữa…[6]

Theo kinh nghiệm, nhân dân ta thường dùng lá Thổ nhân sâm nấu ăn cho mát, để giải nhiệt, dễ tiêu hóa, nhuận tràng Lá Thổ nhân sâm giã nát dùng ngoài để chữa các vết loét, ung nhọt Củ dùng làm thuốc bổ, chữa suy nhược cơ thể, chữa ho, người ra nhiều mồ hôi, đái dầm, kinh nguyệt không đều, thiếu sữa, ngày dùng 20 - 30g sắc uống trong ngày Có thể dùng rễ Thổ nhân sâm thái nhỏ, hãm với nước sôi làm trà uống hàng ngày [31]

Trên thế giới nhiều nước dùng Thổ nhân sâm làm thuốc bổ Tại Indonesia còn dùng chữa các bệnh về gan thận và làm thuốc tăng kích dục Tại Dominique nước cốt sắc từ lá Thổ nhân sâm dùng chữa đau cổ [31]

* Một số bài thuốc theo kinh nghiệm dân gian

Bài 1: Chữa tiểu tiện nhiều, hỗ trợ đái tháo đường

Thổ nhân sâm 60g, kim anh tử 60g, các vị trên cho vào ấm đổ 550 ml nước, sắc nhỏ lửa còn 250 ml nước chia 2 lần uống trong ngày, 5 ngày một liệu trình [6]

Bài 2: Bổ khí huyết - chữa khí huyết yếu, người xanh gầy, thở yếu, hồi hộp, ít ngủ, kém ăn, mệt mỏi

Thổ nhân sâm 40g, sắc nước uống trong ngày, cho vào ấm đổ 400ml nước, sắc nhỏ lửa còn 150 ml nước chia 2 lần uống trong ngày, 10 ngày một liệu trình [6]

Bài 3: Chữa đại tiện lỏng do tỳ hư

Thổ nhân sâm 30g, đại táo 15g, cho vào ấm đổ 550 ml nước, sắc uống thay trà trong ngày [6]

Bài 4: Hỗ trợ điều trị ho lâu ngày

Thổ nhân sâm, hà thủ ô trắng, thông thảo, mỗi vị 20g, gà một con nhỏ tương đương với 400g Cách chế biến: Cho các nguyên liệu trên rửa sạch cho vào nồi hầm gà thêm khoảng 80 phút đến khi nước canh có màu trắng sữa, khi

gà chín nhừ, hớt bỏ bớt mỡ, múc gà ra một bát to, đổ hết nước hầm lên, bổ sung thêm muối và hạt tiêu [6]

Bài 5: Chữa mồ hôi trộm

Thổ nhân sâm 60g, dạ dày lợn nửa cái Cách chế biến: Dạ dày làm sạch

để ráo, cho vào nồi hầm Thổ nhân sâm, khi dạ dày chín nhừ bổ sung thêm muối và hạt tiêu [6]

Bài 6: Người mới ốm dậy, sau phẫu thuật

Sườn lợn 300g, hoàng kỳ 200g, Thổ nhân sâm 200g Xương sườn lợn luộc qua rồi vớt bỏ bọt, hoàng kỳ sắc kỹ lấy nước, đun nhỏ lửa và om kỹ, khi đạt độ nhừ cho Thổ nhân sâm vào đun tiếp 5 - 10 phút, nêm gia vị vừa đủ ăn với cơm, mỗi tuần có thể ăn 2 - 3 bữa [6]

Bài 7: Chữa táo bón

Lá Thổ nhân sâm, rau đay, mùng tơi, liều vừa đủ nấu canh cua ăn thường xuyên [6]

1.2 Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật được hình thành và phát triển từ những năm 80 của thế kỉ XX và được ứng dụng chủ yếu trong các lĩnh vực: Nhân

giống vô tính in vitro, nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng để tạo cây sạch bệnh, bảo quản nguồn gen in vitro, tạo phôi vô tính và hạt nhân tạo…[7]

Kỹ thuật nuôi cấy mô đã được trên 600 công ty lớn trên thế giới áp dụng và đã nhân được khoảng 500 triệu cây giống trong 1 năm ở các công

ty giống cây trồng khác nhau Dự kiến trên thị trường cây giống, kỹ thuật nuôi cấy mô thu được khoảng 15 tỉ USD/năm và tốc độ tăng trưởng của thị trường này hàng năm vào khoảng 15% [7]

Trong những năm gần đây, quy trình nhân giống bằng kỹ thuật nuôi

cấy in vitro được nhiều cơ sở khoa học nghiên cứu và hoàn thiện trên các

đối tượng khác nhau như: Cây rừng, cây lương thực, thực phẩm, cây ăn quả, hoa, cây cảnh, cây dược liệu…[7]

Rừng Việt Nam chiếm diện tích lớn nhưng hiện nay đã bị chặt phá

do nhiều nguyên nhân khác nhau Góp phần vào cung cấp nguồn giống cây rừng phục vụ cho công tác phủ xanh đất trống đồi núi trọc của nhà nước,

hàng loạt quy trình nhân giống in vitro các loại cây rừng được nghiên cứu

nhằm tạo ra lượng lớn cây giống có chất lượng tốt [7]

Thuật ngữ nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy từ nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi

sinh vật, trên môi trường nhân tạo trong điều kiện vô trùng Cho đến nay,

nuôi cấy mô tế bào thực vật được xem là giải pháp công nghệ quan trọng trong công nghệ sinh học nói chung Trên môi trường nhân tạo, từ các mô hoặc các cơ quan thực vật ban đầu có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh và chỉ trong một thời gian ngắn có thể tạo ra một lượng lớn cây trồng có cấu trúc di truyền và các đặc điểm sinh học giống hệt nhau [7]

1.2.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.2.1.1 Tính toàn năng (Totipotence) của tế bào

Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật đó là tính toàn năng của tế bào do Haberlandt nêu ra vào năm 1902 Haberlandt lần đầu tiên đã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật

đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì tính toàn năng của tế bào

là mỗi tế bào riêng rẽ đó phân hóa, sẽ mang toàn bộ thông tin di truyền cần thiết và đủ của cơ thể sinh vật Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Đó là tính toàn năng của tế bào [16]

1.2.1.2 Sự phân hóa và phản phân hóa

Cơ thể thực vật hình thành là một chính thể thống nhất bao gồm nhiều

cơ quan chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau Tuy nhiên, tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử) Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa) Sau đó,

từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau [3]

Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào

mô chuyên hóa, đảm bảo các chức năng khác nhau Quá trình phân hóa tế bào

có thể biểu thị:

Tế bào phôi sinh → Tế bào dãn → Tế bào phân hoá có chức năng riêng biệt Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ, quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào, ngược lại với sự phân hóa tế bào

tế bào phôi sinh tế bào dãn tế bào chuyên hóa

Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa,

ức chế các gen Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen được hoạt hóa (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ta tính trạng mới, còn một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử ADN của mỗi tế bào

khiến cho quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hòa Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của khối mô sẽ tạo điều kiện cho sự hoạt hóa các gen của tế bào [3]

1.2.2 Vai trò của một số chất kích thích sinh trưởng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

Chất điều hòa sinh trưởng là chất có vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh các quá trình sinh trưởng, phát triển và các hoạt động sinh lí của cơ thể Các chất điều hòa sinh trưởng của thực vật bao gồm các phytohoocmon và chất điều hòa sinh trưởng tổng hợp nhân tạo Chất điều hòa sinh trưởng của thực vật được chia làm 2 nhóm có tác dụng đối kháng về sinh lý, đó là các chất kích thích sinh trưởng và các chất ức chế sinh trưởng Các chất được sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật chủ yếu thuộc nhóm các chất kích thích sinh trưởng gồm: Auxin, giberelin, cytokinin [23]

1.2.2.1 Auxin

Năm 1880, người ta đã phát hiện ra bao lá mầm của cây lúa rất nhạy cảm với ánh sáng Nếu chiếu sáng một phía thì gây ra quang hướng động, nhưng nếu che tối hoặc bỏ đỉnh sinh trưởng thì hiện tượng trên không xảy ra Đỉnh ngọn bao lá mầm là nơi tiếp nhận kích thích ánh sáng, đã sinh ra một chất nào đấy liên quan đến hiện tượng trên

Năm 1935, các nhà khoa học cũng tách được chất có hoạt tính tương tự

chất kích thích sinh trưởng từ nấm Rhyzopus và xác định được bản chất hóa

học là IAA, gọi là auxin [33]

Auxin là nhóm chất kích thích sinh trưởng chủ yếu và quan trọng của tất cả các loài thực vật từ bậc thấp tới bậc cao Thuộc nhóm auxin gồm có: IAA, NAA, IBA và 2,4 - D [23]

IAA được tổng hợp ở tất cả các thực vật bậc cao, tảo, nấm, và cả vi khuẩn Ở thực vật bậc cao, IAA được tổng hợp chủ yếu ở đỉnh chồi ngọn và được vận chuyển xuống dưới [23]

Auxin có tác dụng sinh lý đến quá trình sinh trưởng của tế bào, hoạt động của tầng phát sinh, sự hình thành rễ, hiện tượng ưu thế ngọn, tính hướng của thực vật, sự sinh trưởng của quả và tạo quả không hạt,… [23]

Auxin kích thích sự sinh trưởng giãn của tế bào, đặc biệt giãn theo chiều ngang của tế bào làm tế bào to về chiều ngang, vì vậy làm cho các bộ phận của cây to về chiều ngang Hiệu quả đặc trưng của auxin là tác động lên sự giãn của thành tế bào: IAA gây ra sự giảm pH trong thành tế bào, hoạt hóa enzyme phân hủy các polisacarit liên kết giữa các sợi xenluloz làm cho chúng lỏng lẻo và tạo điều kiện cho thành tế bào giãn ra dưới tác dụng của áp suất thẩm thấu của không bào trung tâm Ngoài ra auxin cũng kích thích lên thành

tế bào đặc biệt là các xenluloz, pectin, hemixenluloz… [23]

Auxin còn ảnh hưởng đến sự phân chia tế bào Tuy nhiên ảnh hưởng của auxin lên sự giãn và sự phân chia tế bào phụ thuộc vào mối tác động tương hỗ với các phytohoocmon khác (giberelin, cytokinin) Auxin còn có tác dụng hoạt hóa quá trình sinh tổng hợp các chất như protein, xenluloz, pectin và kìm hãm sự phân giải chúng, nhờ thế có thể kéo dài tuổi thọ của các cơ quan, đồng thời làm tăng quá trình vận chuyển nước, muối khoáng, chất hữu cơ ở trong cây, đặc biệt về các cơ quan sinh sản và cơ quan dự trữ của cây [23]

Auxin gây ra tính hướng động của cây (tính hướng quang và tính hướng địa) Bằng phương pháp sử dụng nguyên tử đánh dấu cho thấy IAA phóng xạ được phân bố nhiều hơn ở phần khuất sáng cũng như ở phần dưới của bộ phận nằm ngang và gây nên sự sinh trưởng không đều ở hai phía cơ quan, do đó gây

ra hiện tượng tính hướng động của các cơ quan, bộ phận của cây [23]

Auxin gây hiện tượng ưu thế ngọn, hiện tượng ưu thế ngọn là một hiện tượng phổ biến ở trong cây Khi chồi ngọn hoặc rễ chính sinh trưởng sẽ

ức chế sinh trưởng của chồi bên và rễ bên Ðây là một sự ức chế tương quan

vì khi loại trừ ưu thế ngọn bằng cách cắt chồi ngọn và rễ chính thì cành bên

và rễ bên được giải phóng khỏi ức chế và lập tức sinh trưởng Hiện tượng này được giải thích rằng auxin được tổng hợp chủ yếu ở ngọn chính và vận chuyển xuống dưới làm cho các chồi bên tích luỹ nhiều auxin nên ức chế sinh trưởng Khi cắt ngọn chính, lượng auxin tích luỹ trong chồi bên giảm sẽ kích thích chồi bên sinh trưởng Auxin kích thích sự hình thành rễ của cây Sự hình thành rễ phụ của các cành giâm, cành chiết có thể chia làm ba giai đoạn: Giai đoạn đầu là phản phân hóa tế bào trước tầng phát sinh, tiếp theo

là xuất hiện mầm rễ và cuối cùng mầm rễ sinh trưởng thành rễ phụ chọc thủng vỏ và ra ngoài Ðể khởi xướng sự phản phân hóa tế bào mạnh mẽ thì cần hàm lượng auxin khá cao Các giai đoạn sinh trưởng của rễ cần ít auxin hơn và có khi còn gây ức chế [23]

Nguồn auxin này có thể là nội sinh, có thể xử lý ngoại sinh Vai trò của auxin cho sự phân hóa rễ thể hiện rất rõ trong nuôi cấy mô Trong kỹ thuật nhân giống vô tính, sử dụng auxin để kích thích sự ra rễ là cực kỳ quan trọng [23]

Auxin kích thích sự hình thành, sự sinh trưởng của quả và tạo quả không hạt [23]

Auxin kìm hãm sự rụng lá, hoa, quả của cây, vì nó ức chế sự hình thành tầng rời ở cuống lá, hoa, quả vốn được cảm ứng bởi các chất ức chế sinh trưởng Vì vậy, phun auxin ngoại sinh có thể giảm sự rụng lá, tăng sự đậu quả

và hạn chế rụng nụ, quả non làm tăng năng suất Cây tổng hợp đủ lượng auxin

sẽ ức chế sự rụng hoa, quả, lá [23]

Trong nuôi cấy mô auxin thường được dùng để kích thích sự phân chia

tế bào và sinh trưởng của mô sẹo Những auxin thường được dùng trong nuôi cấy là IBA, IAA, 2,4 - D [23]

1.2.2.2 Cytokinin

Năm 1963, người ta đã tách được cytokinin tự nhiên ở dạng kết tinh từ hạt ngô gọi là zeatin và có hoạt tính tương tự kinetin Sau đó, người ta đã phát hiện cytokinin có ở trong tất cả các loại thực vật khác nhau và là một nhóm phytohoocmon quan trọng ở trong cây Trong các loại cytokinin thì 3 loại sau đây là phổ biến nhất: kinetin, 6-benzin- aminopurin và zeatin tự nhiên [23]

Tính chất đặc trưng của cytokinin là kích thích sự phân chia tế bào mạnh mẽ Vì vậy, người ta xem chúng như là các chất hoạt hóa sự phân chia

tế bào, nguyên nhân là do cytokinin hoạt hóa mạnh mẽ quá trình tổng hợp axit nucleic và protein dẫn đến kích sự phân chia tế bào [23]

Cytokinin ảnh hưởng rõ rệt lên sự hình thành và phân hóa cơ quan của thực vật, đặc biệt là sự phân hóa chồi Người ta đã chứng minh rằng sự cân bằng giữa tỷ lệ auxin (phân hóa rễ) và cytokinin (phân hóa chồi) có ý nghĩa

quyết định trong quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy in vitro cũng

như trên cây nguyên vẹn Nếu tỷ lệ auxin cao hơn cytokinin thì kích thích sự

ra rễ, còn tỷ lệ cytokinin cao hơn auxin thì kích thích ra chồi Ðể tăng hệ số nhân giống, người ta thường tăng nồng độ cytokinin trong môi trường nuôi cấy ở giai đoạn tạo chồi Ở trong cây, cytokinin được tổng hợp chủ yếu ở rễ nên rễ phát triển mạnh thì hình thành nhiều cytokinin và kích thích chồi trên mặt đất hình thành nhiều [23]

Cytokinin kìm hãm quá trình già hóa của các cơ quan và của cây nguyên vẹn Nếu như lá tách rời được xử lý cytokinin thì duy trì được hàm lượng protein và chlorophil trong thời gian lâu hơn và lá tồn tại màu xanh lâu hơn Hiệu quả kìm hãm sự già hóa, kéo dài tuổi thọ của các cơ quan có thể chứng minh khi cành giâm ra rễ thì rễ tổng hợp cytokinin nội sinh và kéo dài thời gian sống của lá lâu hơn Hàm lượng cytokinin nhiều làm cho lá xanh lâu

do nó tăng quá trình vận chuyển chất dinh dưỡng về nuôi lá Trên cây nguyên vẹn khi bộ rễ sinh trưởng tốt thì làm cho cây trẻ và sinh trưởng mạnh, nếu bộ

rễ bị tổn thương thì cơ quan trên mặt đất chóng già [23]

Cytokinin trong một số trường hợp ảnh hưởng lên sự nảy mầm của hạt

và của củ Vì vậy, nếu xử lý cytokinin có thể phá bỏ trạng thái ngủ nghỉ của hạt, củ và chồi ngủ [32]

Ngoài ra, cytokinin còn có mối quan hệ tương tác với auxin, cytokinin làm yếu hiện tượng ưu thế ngọn, làm phân cành nhiều Cytokinin còn ảnh hưởng lên các quá trình trao đổi chất như quá trình tổng hợp axit nucleic, protein, chlorophil, ảnh hưởng đến các quá trình sinh lý của cây [23]

Trong môi trường nuôi cấy mô, cytokinin cần cho sự phân chia tế bào, kích thích phát sinh chồi nách, kìm hãm ảnh hưởng ưu thế của chồi đỉnh, tăng cường phát sinh chồi phụ [32]

1.3 Các giai đoạn trong quy trình nhân giống vô tính in vitro

Theo Nguyễn Hoàng Lộc (2007), quy trình nhân giống vô tính in vitro

được thực hiện theo ba giai đoạn [5]

1.3.1 Giai đoạn I - Cấy gây

Đưa mẫu vật từ bên ngoài vào nuôi cấy vô trùng phải bảo đảm những yêu cầu: Tỉ lệ nhiễm thấp, tỉ lệ sống cao, tốc độ sinh trưởng nhanh

Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ cho tỉ lệ sống cao và môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ đạt được tốc độ sinh trưởng nhanh [5]

1.3.2 Giai đoạn II - Nhân nhanh

Ở giai đoạn này, người ta kích thích tạo cơ quan phụ hoặc các cấu trúc khác mà từ đó cây hoàn chỉnh có thể phát sinh

Trong giai đoạn này cần nghiên cứu các tác nhân kích thích phân hóa

cơ quan, đặc biệt là chồi như: (1) Bổ sung riêng rẽ hoặc tổ hợp chất kích thích sinh trưởng phù hợp Tăng tỉ lệ auxin/cytokinin sẽ kích thích mô nuôi cấy tạo

rễ và ngược lại sẽ kích thích phát sinh chồi (2) Đảm bảo điều kiện nhiệt độ, ánh sáng phù hợp

Mục tiêu quan trọng nhất của giai đoạn này là xác định được phương thức nhân nhanh nhất bằng môi trường dinh dưỡng và điều kiện khí hậu tối ưu [5]

1.3.3 Giai đoạn III - Chuẩn bị và đưa ra ngoài đất

Chuẩn bị và đưa ra ngoài đất là giai đoạn quan trọng bao gồm việc tạo

rễ, huấn luyện thích nghi với thay đổi nhiệt độ, độ ẩm, sự mất nước, sâu bệnh

và chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng hoàn toàn Quá trình thích nghi ở đây là quá trình thay đổi những đặc điểm sinh lí và giải phẫu của bản thân cây non đó Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi là 2 - 3 tuần, trong thời gian này cây phải được chăm sóc và bảo vệ trước những yếu tố bất lợi như mất nước nhanh làm cho cây bị héo khô, nhiễm vi khuẩn và nấm gây nên hiện tượng thối nhũn, cháy lá do nắng [5]

1.4 Một số thành tựu nhân giống cây dược liệu bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô thực vật được áp dụng ngày càng rộng rãi trên thế giới và

trong nước Trên thế giới, hiện nay có hàng loạt các công ty về nhân giống in

vitro cây trồng thương mại với quy mô lớn Kỹ thuật nuôi cấy mô đã thực sự

mở ra một cuộc cách mạng trong nhân giống thực vật [18]

Ở Việt Nam, từ những năm 1960 công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực

vật đã du nhập vào nước ta bắt đầu tại miền Nam Đến đầu những năm 1970

đã có tại miền Bắc Hiện nay, các hướng nghiên cứu nuôi cấy mô và tế bào thực vật phát triển mạnh Nhân giống thương mại với quy mô lớn đã được áp dụng như nhân nhanh giống đu đủ [20], nhân nhanh giống khoai tây sạch bệnh [19],…Ngoài ra còn sử dụng để nhân nhanh các loài cây trồng, các loài hoa như hoa Loa Kèn [22], hoa Đồng Tiền [12]

Đối với tài nguyên cây thuốc, việc bảo tồn có ý nghĩa hết sức quan trọng Cây thuốc không chỉ có giá trị trực tiếp để chữa bệnh và chăm sóc sức khỏe, nếu biết bảo tồn và khai thác hợp lí thì đó còn là nguồn thu nhập trong phạm vi gia đình và cộng đồng địa phương Hiện nay, nhiều loại cây thuốc quý hiếm đang đứng trước nguy cơ tuyệt chủng Với những ưu điểm nổi trội

của nhân giống in vitro, nhiều nhà nghiên cứu đã công bố nhiều thành tựu

nhân giống cây thuốc quý, nghiên cứu kỹ thuật nhân giống vô tính cây Lô hội

bằng phương pháp nuôi cấy in vitro của tác giả Nguyễn Thị Kim Thanh và Dương Huyền Trang (2008) đã cho thấy, để tạo vật liệu khởi đầu in vitro cây

Lô hội nên sử dụng mẫu ở vụ xuân, khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 7 phút cho hiệu quả khử trùng cao (68,5%) Môi trường MS bổ sung BAP 2,5mg/l cho hệ số nhân chồi cao (5,3 lần/ 3 tuần), chất lượng chồi tốt Bổ sung than hoạt tính 1,5 - 2g/l cho khả năng ra rễ đạt cao nhất, tỷ lệ ra rễ đạt 100%, chất lượng rễ tốt Giá thể thích hợp cho cây là cát mịn, tỷ lệ sống cao (81,4%) cây sinh trưởng phát triển tốt [17]

Nhóm nghiên cứu Lê Tiến Vinh và CS (2014) đã nghiên cứu quy trình

nhân giống in vitro cây Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge), kết quả cho

thấy: Trên môi trường MS + GA3 1,0 mg/l đã nhận được 40,43% hạt Đan sâm nảy mầm sau 2 tuần Đoạn thân (kích thước 2-3 cm và có một cặp lá) cắt

từ cây Đan sâm nảy mầm được sử dung làm vật liệu nhân nhanh Hệ số nhân chồi đạt cao nhất (5,05 chồi/mẫu) sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường MS + BAP, NAA, IAA, IBA 0,5 mg/l đều có ảnh hưởng tích cực đến sự hình thành

rễ của chồi in vitro Môi trường ra rễ thích hợp nhất là môi trường MS có bổ

sung IAA 0,75 mg/l, cho tỷ lệ ra rễ đạt 100%, số rễ trung bình đạt 6,19 rễ/cây

sau 4 tuần nuôi cấy Cây in vitro trên môi trường ra rễ 30 ngày là thích hợp để

chuyển ra ngoài vườn ươm Trên giá thể chứa 50% xơ dừa và 50% cát, tỷ lệ sống đạt 100%, cây sinh trưởng phát triển tốt [21]

Tam thất là cây dược liệu quý có tác dụng hóa ứ, cầm máu, tiêu sưng, giảm đau Tác giả Vũ Thị Bạch Phượng và CS (2013) đã tiến hành nghiên cứu

nuôi cấy in vitro nguồn nguyên liệu có hoạt tính kháng oxi hóa của cây Thổ tam thất và xác định được rễ in vitro của cây Thổ tam thất có hoạt tính kháng

oxi hóa cao nhất, trong rễ in vitro có chứa nhóm hợp chất saponin và

flavonoid, đồng thời xác định được NAA 2,0 mg/l thích hợp cho sự tạo rễ ở cây Thổ tâm thất [9]

Nhóm tác giả Nguyễn Thanh Tùng và CS (2010) nghiên cứu nhân

giống in vitro cây Qua lâu (Trichosanthes kirilowii), đã cho thấy, hạt Qua lâu

được khử trùng bằng javel trong 5 phút, sau đó cấy lên môi trường MS cơ bản

bổ sung kinetin 1,5 mg/l Sau 4 tuần nuôi cấy, tỷ lệ hạt không nhiễm có nảy

mầm đạt 87,9% Đỉnh sinh trưởng và chồi bên in vitro được cấy lên môi

trường nhân nhanh có bổ sung BAP, kinetin, NAA và nước dừa riêng rẽ hay kết hợp Kết quả nhân chồi tốt nhất đạt được khi nuôi cấy chồi bên trên môi trường MS bổ sung BAP 1,0 mg/l và 20% nước dừa (19,87 chồi/chồi bên)

Chồi in vitro tạo rễ trên môi trường 1/2 MS không bổ sung chất kích thích sinh

trưởng (5,67 rễ/chồi) Cây in vitro đạt tiêu chuẩn được chuyển ra đất sau 4

tuần nuôi cấy Cây con được trồng trên giá thể đất thịt và cát (1:1) cho tỷ lệ sống sót cao nhất đạt 77,5% [15]

Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất hữu cơ và bạc nitrat (AgNO3)

lên sự sinh trưởng và phát triển của cây sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro của

Nguyễn Việt Cường và CS (2013) cho thấy dịch chiết chuối ở nồng độ 10 g/l, tảo spirulina ở nồng độ 5 mg/l và nước dừa ở tỉ lệ 5% tăng cường sự sinh trưởng và phát triển của sâm Ngọc Linh Dịch chiết khoai tây ức chế khả năng

sinh trưởng của sâm Ngọc Linh in vitro Riêng AgNO3 làm tăng khả năng sinh

trưởng và phát triển in vitro của cây sâm Ngọc Linh ở nồng độ 2,0 mg/l [1]

Nhóm nghiên cứu của Ngô Thanh Tài (2013) đã tiến hành nghiên cứu tác động của ánh sáng đèn LED lên khả năng tăng sinh mô sẹo và sự hình thành cây hoàn chỉnh từ phôi vô tính cây sâm Ngọc Linh và nhận thấy mô sẹo tăng sinh cao nhất khi được nuôi cấy dưới ánh sáng đèn LED vàng, ánh sáng đèn LED đỏ

và LED xanh dương được kết hợp với tỉ lệ 6R + 4B thích hợp cho sự hình thành

cây con từ phôi vô tính cây sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro [11]

Sharma G.J và CS (2005) đã dùng cồn 70% để khử trùng bề mặt thân rễ cây địa liền và cây ngải máu, sau đó, sử dụng NaClO 1% hoặc HgCl2 0,2% trong 15 phút để diệt nấm và vi khuẩn bám trên mẫu [29]

Dương Tấn Nhựt và CS (2011) tiến hành khử trùng lá cây Sâm Ngọc Linh bằng Cồn 70% trong 30 giây và HgCl2 trong 5 phút thu được tỷ lệ mẫu sạch cao [25]

Behera k.k và CS (2010) sử dụng BAP 2 mg/l và NAA 0,5 mg/l để cảm ứng chồi cây nghệ vàng [24]

Jala a và CS (2012) nghiên cứu trên cây Giảo cổ lam cho thấy khi kết hợp BAP 1 mg/l và NAA 0,1 mg/l cho hệ số nhân chồi cao nhất đạt 6,8 chồi/mẫu sau 80 ngày nuôi cấy [26]

Sen a và CS (2010) khi chuyển cây nghệ in vitro sang đất vườn và

cát với tỷ lệ 1:1 cho kết quả 93% cây vi giống sinh trưởng và phát triển bình thường trong môi trường tự nhiên [28]

Shahinozzaman m và CS (2013) chuyển cây con tái sinh in vitro

sang chậu nhựa có chứa hỗn hợp đất vườn và phân ủ với tỷ lệ 1:1 và được

làm thích nghi Kết quả cho thấy cây con in vitro cho tỷ lệ sống cao [30]

Nayak s và CS (2010) nghiên cứu nhân giống trên cây Địa liền cho thấy, ở trong môi trường MS kết hợp BAP (1,0 - 5,0 mg/l) cho kết quả nhân chồi tốt nhất ở BAP 1,0 mg/l với hệ số nhân chồi là 5,0 ± 0,3 chồi và chiều cao chồi là 10,2 ± 0,3 cm Khi bổ sung BAP từ 1,0 - 3,0 mg/l và IBA

từ 0,5 - 1,0 mg/l cho hệ số nhân chồi cao nhất ở BAP 1,0 mg/l và IBA 0,5 mg/l với 11,5 ± 0,5 chồi và chiều cao chồi là 10,8 ± 0,6 cm [27]

Đối với cây Thổ nhân sâm hiện nay các tài liệu nghiên cứu còn rất hạn chế Việc nghiên cứu, bảo tồn và phát triển các loại dược liệu nhất là dược liệu hoang dại trong thiên nhiên là rất cần thiết, đồng thời là một trong những lĩnh vực phát triển mạnh đi cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học thực vật Hy vọng trong thời gian tới sẽ có các nghiên cứu tìm hiểu sâu hơn

để có thể xác định được đầy đủ hàm lượng của các hợp chất hóa học, tác dụng dược liệu của cây Thổ nhân sâm Từ đó làm cơ sở cho việc phát triển, bảo tồn

và ứng dụng nhiều hơn của cây Thổ nhân sâm trong y học

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu, hoá chất, thiết bị, địa điểm nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu

Vật liệu nghiên cứu: Hạt Thổ nhân sâm thu ngoài tự nhiên tại huyện Ba

- Hóa chất khử trùng: HgCl2 (Biobasic, Canada); Javen, cồn…

- Chất điều hòa sinh trưởng: BAP, kinetin, IBA (Sigma, Đức)

- Hóa chất khác: đường sucrose, agar (Hạ Long, Việt Nam)…

* Thiết bị

Dụng cụ và thiết bị dùng trong thí nghiệm: Bình tam giác 250ml, 500 ml, bông, giấy làm nút, giấy thấm, bộ đồ cấy: dao cấy, que cấy, đĩa cấy, tủ cấy vô trùng (Esco, Đức), nồi hấp khử trùng (Nuarie, Mỹ), tủ sấy (Memmer, Đức)…

2.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Thí nghiệm được thực hiện từ tháng 8/2015 - tháng 4/2016 tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật, Viện Nghiên cứu và Phát triển Lâm

nghiệp - Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy

- Sử dụng môi trường MS bố sung agar 6g/l + đường sucrose 30g/l

- Các chất kích thích sinh trưởng sử dụng thuộc nhóm auxin và cytokinin

bổ sung vào môi trường nuôi cấy với hàm lượng khác nhau tùy từng thí nghiệm

- Giá trị PH của môi trường nuôi cấy trước khi sử dụng là: 5,6 - 5,8

- Thể tích môi trường nuôi cấy trong mỗi bình nuôi cấy là 50 - 70 ml/bình

- Môi trường được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121ºC, áp suất 1,1 atm

* Khử trùng hạt bằng HgCl 2 0,1%

Hạt sau khi khử trùng sơ bộ được khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong khoảng thời gian 2, 3, 4, 5 phút, sau đó tráng lại bằng nước cất vô trùng 3 - 5 lần Với công thức đối chứng hạt không được lắc trong cồn 70 % và HgCl20,1% Sau khi khử trùng, hạt được cấy lên môi trường MS bổ sung đường sucrose 30 g/l, agar 6,0 g/l, pH = 5,8

Các công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 5 lần nhắc lại, 150 hạt/công thức

+ Tỉ lệ hạt nảy mầm không nhiễm

+ Tỉ lệ hạt nhiễm

+ Tỉ lệ hạt chết

+ Hình thái mầm

2.2.2.2 Nghiên cứu môi trường nuôi cấy

Sau khi vào mẫu hạt thành công, thu được các cây con nảy mầm từ hạt Các đoạn thân mang chồi nách của các cây con nói trên được sử dụng làm vật liệu cấy trên môi trường nhân nhanh Để tìm ra môi trường nuôi cấy tối ưu cho nhân nhanh và tạo rễ Thổ nhân sâm, chúng tôi đã bố trí các thí nghiệm thăm dò môi trường nuôi cấy Tất cả các công thức môi trường nuôi cấy đều

sử dụng nền môi trường MS cơ bản có bổ sung đường sucrose 30 g/l + agar 6,0 g/l và chất kích thích sinh trưởng có nồng độ thay đổi

(1) Môi trường nhân chồi

Thăm dò ảnh hưởng của nồng độ BAP, tổ hợp BAP + kinetin, tổ hợp BAP + IBA đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng của chồi

Các đoạn thân mang chồi nách được cấy lên môi trường nhân chồi bổ sung BAP với nồng độ 0,5 mg/l; 1,0 mg/l; 1,5 mg/l; 2,0 mg/l; 2,5 mg/l

Nồng độ BAP thích hợp nhất trong thí nghiệm trên sẽ được kết hợp với kinetin với nồng độ 0,25 mg/l; 0,5 mg/l; 1,0 mg/l; 2,0 mg/l

BAP kết hợp với IBA với nồng độ: 0,5 mg/l; 1,0 mg/l; 1,5mg/l Đối chứng là môi trường MS cơ bản không bổ sung kích thích sinh trưởng Các công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn Mỗi công thức bố trí 5 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 10 mẫu, cấy 5 - 7 chồi/ bình Kết quả được đánh giá sau 8 tuần nuôi cấy Theo dõi các chỉ số sau:

+ Khả năng bật chồi: Số chồi/ mẫu

+ Chiều cao chồi

+ Chất lượng chồi: