Bước đầu nghiên cứu nhân giống dây thìa canh (gymnema sylvestre) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro

LỜI CẢM ƠN Với mong muốn tìm hiểu phƣơng pháp tối ƣu cho việc nhân giống Dây thìa canh, đồng thời áp dụng lí thuyết hiểu biết nuôi cấy mô tế bào thực vật–một ứng dụng Công nghệ sinh học vào thực tế đƣợc học qua bốn năm đào tạo Đƣợc đồng ý nhà trƣờng, phân công Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp - Trƣờng Đại học Lâm nghiệp Việt Nam đồng ý hƣớng dẫn giảng viên PGS TS Nguyễn Văn Việt em tiến hành thực khoá luận tốt nghiệp“Bƣớc đầu nhân giống Dây thìa canh (Gymenema sylvestre) kỹ thuật ni cấy in vitro” Trong q trình thực khố luận để đạt đƣợc kết tốt cố gắng trình học tập thân bảo ân cần thầy cô, động viên giúp đỡ gia đình, bạn bè góp phần quan trọng giúp em vƣợt qua khó khăn học tập Em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Văn Việt KS Đồn Thị Thu Hƣơng tận tình hƣớng dẫn, bảo suốt q trình thực khố luận Em xin cảm ơn thày cô, anh chị Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp-Trƣờng Đại học Lâm nghiệp tạo điều kiện giúp đỡ em suốt q trình thực khố luận Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè ngƣời thân động viên, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập, nghiên cứu khoa học hồn thành khố luận tốt nghiệp cuối khố Tuy cố gắng để hồn thiện đề tài nghiên cứu này, song thời gian kiến thức có hạn nên báo cáo khố luận khơng tránh khỏi khiếm khuyết, kính mong thầy đóng góp bổ sung để báo cáo khoá luận em đƣợc hoàn thiện Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Sinh viên thực Kiều Thị Hạnh i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN I TỔNG QUAN VỀ CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU I Giới thiệu Dây thìa canh 1.1 Nguồn gốc hệ thống phân loại 1.1.2 Đặc điểm hình thái 1.1.3 Tác dụng dược lý 1.2 Tổng quan nuôi cấy in vitro 1.2.1 Khái niệm nuôi cấy in vitro 1.2.2 Sơ lược phát triển nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.2.3.Cơ sở khoa học nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.2.4 Các điều kiện nuôi cấy in vitro 1.2.5 Môi trường nuôi cấy 11 1.2.6 Các giai đoạn quy trình nhân giống in vitro 15 1.2.7 Ý nghĩa kỹ thuật nhân giống in vitro 17 1.2.8 Tại Việt Nam 18 PHẦN II 20 MỤC TIÊU- NỘI DUNG – PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 20 2.1.1 Mục tiêu chung 20 2.1.2.Mục tiêu cụ thể 20 2.2 Nội dung nghiên cứu 20 2.3 Đối tƣợng, vật liệu nghiên cứu 20 2.4.1 Phương pháp luận 20 ii 2.4.2.Phương pháp thực nghiệm 21 2.4.3 Phương pháp xử lý số liệu 24 2.4.4.Phương pháp thống kê xử lý số liệu 24 PHẨN III 25 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 Kết khử trùng tạo mẫu in vitro 25 3.1.1 Ảnh hưởng hoá chất thời gian khử trùng đến kết tạo mẫu in vitro 25 3.2 Nghiên cứu ảnh hƣởng môi trƣờng dinh dƣỡng đến khả nhân nhanh chồi 27 3.3 Nghiên cứu ảnh hƣởng nồng độ BAP đến khả nhân nhanh chồi 29 3.4 Nghiên cứu ảnh hƣởng nồng độ chất điều hòa sinh trƣởng đến khả nhân nhanh chồi 31 PHẦN IV 34 KẾT LUẬN-TỒN TẠI-KIẾN NGHỊ 34 4.1 Kết luận 34 4.2 Tồn 34 4.3 Kiến nghị 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO iii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Ảnh hƣởng hoá chất thời gian khử trùng đến kết tạo mẫu in vitro 21 Bảng 2.2 Ảnh hƣởng môi trƣờng dinh dƣỡng đến khả nhân nhanh chồi.24 Bảng 2.3 Ảnh hƣởng nồng độ BAP đến khả nhân nhanh chồi 23 Bảng 2.4 Ảnh hƣởng nồng độ chất điều hòa sinh trƣởng đến khả nhân nhanh chồi 23 Bảng 3.1 Kết ảnh hƣởng hoá chất thời gian khử trùng đến kết tạo mẫu in vitro 25 Bảng 3.2 Kết ảnh hƣởng môi trƣờng dinh dƣỡng đến khả nhân nhanh chồi 28 Bảng 3.3 Ảnh hƣởng nồng độ BAP đến khả nhân nhanh chồi 30 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng nồng độ chất điều hòa sinh trƣởng đến khả nhân nhanh chồi 31 iv DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cành có hoa Dây thìa canh Hình 3.1 Một số hình ảnh mẫu nảy chồi 27 Hình 3.2 Một số hình ảnh tái sinh chồi Dây thìa canh 29 Hình 3.3 Một số hình ảnh Dây thìa canh giai đoạn nhân nhanh chồi 33 DANH MỤC BIỂU Biểu 3.1 Ảnh hƣởng cồn 70 thời gian khử trùng đến khả nảy mầm 26 Biểu 3.2 Ảnh hƣởng thời gian khử trùng Javen đến khả nảy mầm Error! Bookmark not defined Biểu đồ 3.3 Ảnh hƣởng môi trƣờng dinh dƣỡng đến khả nhân nhanh chồi 28 Biểu 3.4 Ảnh hƣởng nồng độ BAP đến khả nhân nhanh chồi 30 Biểu 3.5 Ảnh hƣởng tổ hợp chất điều hoà sinh trƣởng đến khả nhân nhanh chồi …………………………………….………… 33 v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Ký hiệu Giải thích BAP 6-Benzyl amino purine CTTN Cơng thức thí nghiệm DNA Deoxyribo Nucleic acid GA3 Gibberellic acid IBA Indol butyric acid Ki 6-furfuryl amino purine MS Murashige Skoog NAA Napthlacetic acid NaClO Nƣớc Javen vi ĐẶT VẤN ĐỀ Dây thìa canh (Gymnema sylvestre) đƣợc đánh giá dƣợc liệu quan trọng cho sức khoẻ chiến lƣợc phát triển thảo dƣợc Việt Nam Dây thìa canh có chứa tổ hợp nhiều acid gymnemic, hoạt chất thuộc nhóm saponin triterpenoid Acid gymnemic có tác dụng kích thích sản sinh tế bào Beta tuyến tụy, giúp thể tái thiết lập đƣợc khả cân đƣờng huyết tự nhiên; ức chế hấp thu đƣờng ruột; ức chế gan tân tạo Glucose vào máu, đồng thời kích thích enzyme chịu trách nhiệm tiêu thụ, sử dụng đƣờng mô Nhờ hoạt chất đem lại hiệu giảm đƣờng huyết Trong điều kiện thực tế nƣớc ta Dây thìa canh đƣợc nhân giống phƣơng pháp hữu sinh nhƣ giâm củ, gieo hạt phƣơng pháp nhân giống vơ tính nhƣ giâm hom, giâm cành nuôi cấy mô tế bào, nhƣng chủ yếu là: Giâm hom, gieo hạt, nuôi cấy mô tế bào Đặc biệt phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào cấy tế bào rút ngắn đƣợc thời gian nhân nhanh tạo đƣợc số lƣợng lớn Thìa canh thời gian ngắn giữ đảm bảo hàm lƣợng hoạt chất ổn định, không nhiễm bệnh ƣu việt so so với phƣơng pháp truyền thống Hiện nhu cầu ngƣời nguồn dƣợc liệu ngày tăng nhiên loài tự nhiên bị giảm số lƣợng chất lƣợng khai thác mức, điều kiện ngày bất lợi môi trƣờng tự nhiên, việc nghiên cứu nhân giống bảo tồn cần thiết, cấp bách việc lƣu giữ nguồn gen quý Xuất phát từ thực tiễn lựa chọn đề tài: Bƣớc đầu nghiên cứu nhân giống Dây thìa canh(Gymnema sylvestre) kỹ thuật ni cấy in vitro PHẦN I TỔNG QUAN VỀ CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU I Giới thiệu Dây thìa canh 1.1 Nguồn gốc hệ thống phân loại Hình 1.1 Cành có hoa Dây thìa canh (Gymnema sylvestre) (Nguồn: Trần Văn Ơn, 2006) Tên Việt Nam: Dây thìa canh, Dây muôi, Lõa ti rừng Tên khoa học: Gymnema sylvestre Chi: Gymnema Họ: Apocynaceae Bộ: Gientianales Lớp : Cây thân thảo 1.1.2 Đặc điểm hình thái Thìa canh thân leo, cao từ 6-10m Thân non màu xanh, phủ lông mịn; thân già màu nâu, có lỗ vỏ, đƣờng kính lỗ vỏ 0,5-1mm Tồn thân có nhựa mủ màu trắng hay vàng Lá mọc đối Cuống 1,5-4cm, có lơng tơ dày đặc; phiến hình bầu dục, trứng hay trứng ngƣợc, dài 6-7cm, rộng 2,5-5cm, gốc thuôn, mép nguyên, nhọn; có 4-6 cặp gân phụ, rõ mặt dƣới Hoa nhỏ, màu trằng vàng, xếp thành xim dạng tán nách lá, dài 8mm, rộng 12-15mm Đài chia 5,các thuỳ dài 1mm, có lơng mịn rìa lơng Tràng hoa vàng, hình chng, nhẵn mặt ngồi, dài 1,2-8mm Cột nhị nhuỵ hình trụ, dài khoảng 1,5mm, rộng 0,8-1mm Bộ nhị có bao phấn ngắn; khối phấn gồm thuỳ, dài khoảng 0,2mm, liên kết với nhờ trung đới màu vàng nâu Bộ nhuỵ có vịi với đầu rộng hình nón,vƣợt q bao phấn Quả đại dài 5-6cm, rộng dƣới, đƣơng kính chỗ lớn khoảng 1,5cm Hạt dẹp, dài 3mm có mào lơng trắng, dài khoảng 3-3,5mm, thƣờng có khoảng 40 hạt Cây hoa tháng 7, có tháng 8; tái sinh hạt Cây ƣa sáng,sinh trƣởng nhanh, ƣa khí hậu nóng ẩm,thƣờng mọc bờ bụi, hàng rào Phân bố nƣớc có khí hậu nhiệt đới ẩm Ấn Độ, Nam Trung Quốc, Indonesia, Việt Nam Ở nƣớc ta có trồng Thái nguyên, Nam Định 1.1.3 Tác dụng dược lý Thành phần hóa học có hoạt tính sinh học dây thìa canh axit gymnemic, hoạt chất thuộc nhóm saponin triterpenoid Ngồi ra, cịn chứa thành phần khác nhƣ flavone, anthraquinone, hentri-acontane, pentatriacontane, α β- chlorophylls, phytin, resins, d-quercitol, axít tartaric, axit formic, axit butyric, lupeol… Dịch chiết cho thấy có thành phần ancaloid 1.1.3.1 Tác dụng hạ ổn định đường huyết Đến có khoảng 70 nghiên cứu ngồi nƣớc Dây thìa canh, bao gồm nghiên cứu động vật ngƣời, nghiên cứu cho thấy tác dụng giảm đƣờng huyết rõ rệt Dây thìa canh Kết nghiên cứu đề tài đƣợc cơng bố tạp chí Dƣợc học – Bộ y tế số 391 tháng 11/2008 cho thấy Dây thìa canh Việt Nam cho tác dụng hạ đƣờng huyết nhanh Tác dụng hạ đƣờng huyết Dây thìa canh có điểm tƣơng đồng nhƣ insulin nhanh: đỉnh cao hạ đƣờng huyết 2h trì đến 4h; mức độ hạ đƣờng huyết tƣơng đƣơng thời điểm 2h 4h Ngoài số nghiên cứu khác cho thấy tác dụng giảm cholesterol máu, giảm béo phì hiệu Nhƣ Dây thìa canh sử dụng điều trị cho bệnh nhân tiểu đƣờng tuýp tuýp 2, phối hợp với thuốc điều trị khác để kiểm soát làm giảm đƣờng huyết, ổn định kéo dài hàm lƣợng đƣờng huyết, phòng ngừa biến chứng, giảm cholesterol lipit máu, nâng cao đời sống tình dục bệnh nhân tiểu đƣờng nam giới 1.1.3.2.Tác dụng hạ lipid máu, giảm mỡ cholesterol máu Dịch chiết Dây thìa canh có tác động lên chuyển hóa lipid, làm giảm có ý nghĩa chất béo tiêu hóa đƣợc, làm tăng tiết Sterol trung tính Sterol acid qua phân, ngồi cịn làm giảm tổng lƣợng Cholesterol toàn phần mức Triglycerid huyết tƣơng 1.1.3.3 Làm tăng tiết insulin tuyến tụy tăng cường hoạt lực insulin Acid gymnemic có tác dụng kích thích sản sinh tế bào Beta tuyến tụy, nhờ tăng sản sinh Insulin, tăng hoạt lực Insulin, giúp thể tái thiết lập đƣợc khả cân đƣờng huyết tự nhiên 1.1.3.4 Tác dụng làm ức chế hấp thu đường glucose ruột Các nhà khoa học phát dây thìa canh có chứa tế bào vị giác peptide gumarin Các tế bào khơng bị kích thích đƣờng Có tác dụng khiến lƣỡi không hấp thu đƣợc glucose, cảm giác muốn ăn Từ đó, ngƣời bệnh giảm thiểu lƣợng đƣờng hấp thu ruột Khi vào đến ruột, axit gymnemic lấp đầy thụ thể ruột ngăn không cho đƣờng glucose đƣờng từ ruột vào máu Axit gymnemic ức chế gan lọc bỏ glucose vào máu Đồng thời kích thích enzyme mơ để giảm đƣờng huyết hiệu 1.1.3.5 Lá làm kích thích tim hệ thống tuần hoàn, gây tiết nước tiểu Lá có tính chất nhuận tràng có dẫn xuất anthraquinon; cịn có tính gây nơn Trên hệ tim mạch nhiều Flavonoid có tác dụng làm bền thành mạch giảm sức thẩm thấu ứng dụng chữa trị rối loạn chức tĩnh hồng cầu quanh mạch máu, giãn hay suy yếu tĩnh mạch; làm tăng biên độ co bóp tim tăng thể tích phút tim giúp kích thích tim Trong có hợp chất anthraquinoen làm tăng lƣợng nƣớc tiểu thúc đẩy nhu động niệu quản, niệu natri niệu kali tăng đáng kể Bảng 3.3 Ảnh hƣởng nồng độ BAP đến khả nhân nhanh chồi CTTN BAP (mg/l) Số mẫu cấy (mẫu) CT1 0,0 30 Tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi (%) 40 CT2 0,1 30 CT3 0,3 CT4 CT5 Số chồi TB/mẫu (chồi) Chất lƣợng chồi 0,56 + 63,33 0,8 + 30 73,33 1,06 ++ 0,5 30 86,66 1,53 +++ 0,7 30 70 1,06 ++ Ghi chú: Chất lượng chồi (các chồi nhỏ, không đều): + Chất lượng chồi trung bình (các chồi cao,thân nhỏ, nhỏ, không đều): ++ Chất lượng chồi tốt (chồi cao, thân mập, to, chồi đồng đều): +++ 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 CT1 CT2 CT3 CT4 Ct5 Biểu 3.4 Ảnh hƣởng nồng độ BAP đến khả nhân nhanh chồi Dựa vào kết phân tích phƣơng sai nhân tố ảnh hƣởng nồng độ BAP đến khả nhân nhanh chồi ta có: Fcrit (3,378) < Ftính (19,578) chứng tỏ kết khác biệt cơng thức thí nghiệm có nghĩa 30 Dựa vào bảng 3.3 có chênh lệch tỷ lệ mẫu tái sinh chồi số chồi trung bình mẫu Tại nồng độ BAP 0,5mg/l cho kết tốt với tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi 86,66%; tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi thấp CT1(40%) Số chồi trung bình/mẫu có khác rõ rệt cơng thức thí nghiệm.Với cơng thức đối chứng(CT1) cho kết nhất, trung bình 0,56 chồi/mẫu; CT4 cho hệ số chồi trung bình/mẫu cao nhất(1,53 chồi/mẫu) Nhƣ vậy, cơng thức đối chứng tái sinh chồi nhƣng tỷ lệ thấp hoocmon nội sinh có nồng độ không đủ lớn nên tỷ lệ tái sinh chồi, số lƣợng chồi thấp Từ kết trên, thấy cần thiết bổ sung BAP vào môi trƣờng ni cấy cho q trình tái sinh chồi; cơng thức môi trƣờng tối ƣu để nuôi cấy tái sinh chồi Dây thìa canh CT4 (MS+ 30g/l succrose+ 6g/l agar+ 0,5mg/l BAP) 3.4 Nghiên cứu ảnh hƣởng nồng độ chất điều hòa sinh trƣởng đến khả nhân nhanh chồi Chúng lựa chọn đƣợc môi trƣờng tốt bổ sung BAP thí nghiệm trên, sau bố trí thí nghiệm có kết hợp NAA với dải nồng độ từ 0,1 – 0,3 mg/l bổ sung kinetin để nghiên cứu khả nhân nhanh chồi nuôi cấy Bảng 3.4 Ảnh hƣởng nồng độ chất điều hòa sinh trƣởng đến khả nhân nhanh chồi CTTN Chất điều hòa sinh trƣởng (mg/l) BAP CT1 CT2 0.5 CT3 CT4 Ghi chú: Kinetin NAA Số mẫu TN (chồi) 0,5 0,3 0,2 0,1 0,2 0,3 0,4 30 30 30 30 Tỷ lệ tạo cụm Số chồi chồi TB/mẫu (%) 96,66 1,93 83,33 1,6 70 1,13 60 1,03 Chất lƣợng chồi +++ ++ ++ ++ Chất lượng chồi (các chồi nhỏ, không đều): + Chất lượng chồi trung bình (các chồi cao,thân nhỏ, nhỏ, không đều): ++ Chất lượng chồi tốt (chồi cao, thân mập, to, chồi đồng đều): +++ 31 120 100 80 60 40 20 CT1 CT2 CT3 CT4 Biểu 3.5 Ảnh hƣởng tổ hợp chất điều hoà sinh trƣởng đến khả nhân nhanh chồi - Kết phân tích phƣơng sai ta có: Ftính (16,022) > Fcrit (4,066), chứng tỏ CTTN khác có ảnh hƣởng khác đến tái sinh chồi Theo số liệu bảng 3.4 cho thấy khác biệt lớn việc phối hợp chất điều hoà sinh trƣởng với so với việc sử dụng riêng rẽ Sau ni cấy khoảng tuần, CT1 có tỷ lệ mẫu tái sinh chồi cao nhất(96,66%), số chồi trung bình/mẫu 1,93 cơng thức cịn lại Khi nồng độ kinetin tăng dần công thức bảng 3.4 cho thấy kết ngƣợc lại tỷ lệ nồng độ kinetin Ở cơng thức có nồng độ kinetin cao nhát CT5(0,4mg/l) kết Nhƣ vậy, thí nghiệm chúng tơi lựa chọn đƣợc cơng thức tổ hợp BAP, kinetin, NAA thích hợp hợp để tạo cụm chồi mẫu cấy in vitro Dây thìa canh là: MS+ 0,5mg/l BAP+ 1mg/l Kinetin+ 0,1mg/l NAA+ 6g/l agar+ 30g/l succrose 32 b a c d Hình 3.3 Một số hình ảnh Dây thìa canh giai đoạn nhân nhanh chồi Ghi chú: a) Nhân nhanh chồi CT1; b) Nhân nhanh chồi CT2 c) Nhân nhanh chồi CT3; d) Nhân nhanh chồi CT4 33 PHẦN IV KẾT LUẬN-TỒN TẠI-KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Đề tài nhân giống Dây thìa canh kỹ thuật ni cấy in vitro đạt đƣợc thành công định: Công thức khử trùng tạo mẫu xử lý với cồn 70º phút, kết đạt đƣợc 100% mẫu 93,3% mẫu nảy mầm NaClO 5% phút kết đạt đƣợc 100% mẫu sạch; 96,67% mẫu nảy mầm Môi trƣờng dinh dƣỡng cho nhân nhanh chồi MS đạt số chồi trung bình mẫu 1,5 chồi/mẫu; chiều cao trung bình/chồi 1,6cm Cơng thức nhân nhanh chồi là: MS+ 0,5mg/l BAP+ 30g/l sucrose+6g/l agar, đạt kết 86,66% mẫu tạo cụm chồi; chiều cao trung bình/chồi: 1,53 cm Cơng thức tái sinh chồi với tổ hợp chất điều hoà sinh trƣởng: MS+ 0,5mg/l BAP+ 1mg/l Kinetin+ 0,1mg/l NAA+ 6g/l agar+ 30g/l succrose,đạt 96,66% mẫu tạo cụm chồi số mẫu trung bình/ mẫu 1,93 chồi 4.2 Tồn Do thời gian thực đề tài có hạn nên có số tồn sau: Mới bƣớc đầu nghiên cứu nên quy trình nhân giống Dây thìa canh chƣa thực đƣợc hồn chỉnh Chƣa nghiên cứu đƣợc nhiều loại hoá chất khử trùng khác để tạo mẫu hiệu Chƣa nghiên cứu đƣợc giai đoạn kích thich tăng trƣởng chồi tạo rễ 4.3 Kiến nghị Tiêp tục nghiên cứu hồn thiện quy trình nghiên cứu nhân giống Dây thìa canh kỹ thuật nuôi cấy in vitro 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Nguyễn Thị Lý Anh (1990) Nhân giống trồng in vitro, khoa CNSH-ĐH Nơng Nghiệp I Hà Nội Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997) Công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng Nhà xuất Hà Nội Dƣơng Mộng Hùng, Lê Đình Khả (2003) Giáo trình rừng Nhà xuất nơng nghiệp Phạm Thanh Hƣơng, Trần Văn Ơn (2015) Nghiên cứu đa dạng di truyền loài Gymnema latifolium Wall.ex Wight dựa trình tự vùng phiên mã nội AND ribosom nhân Nguyễn Thị Loan (2010) Nghiên cứu hoàn thiện kỹ thuật nhân giống lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) qua phôi hạt phƣơng pháp nhân giống in vitro Khoá luận tốt Nghiệp-Trƣờng Đại học Lâm nghiệp Nguyễn Hồng Lộc (2011) Ni cấy mơ tế bào thực vật NXB Đại học Huế Tạ Phúc Lợi (2014) Nghiên cứu hoàn thiện kỹ thuật nhân giống Ba Kích Tím (Morinda officinalis How) phƣơng pháp ni cấy in vitro Khóa luận tốt nghiệp- Đại học Lâm nghiệp Vũ Thị Phƣơng, Đặng Ngọc Hùng, Ma Thị Tiệp (2014) Nghiên cứu nhân giống Thìa canh (Gymnema sylvestre) phƣơng pháp gieo hạt giâm hom cành sở nghiên cứu bảo tồn phát triển dƣợc liệu tam thái yên Tạp chí Khoa học & Công nghệ tr 127 - 133 Vũ Hoài Sâm, Nguyễn Quang Hải, Dƣơng Thị Phúc Hậu, Nguyễn Văn Khiêm (2014).Nghiên cứu nhân giống in vitro Dây thìa canh ni cấy chồi đỉnh.Tạp chí dƣợc liệu số tr.44-50 10 Nguyễn Trung Thành, Paek Kee Yoeup (2008) Nhân nhanh rễ bất định nhân sâm Triều Tiên (Panax gíneng C.A Meyer): ảnh hƣởng số nhân tố lý hoá lên tăng trƣởng sinh khối sản phẩm trao đổi chất ginsenoside Tạp chí Khoa học Đại học Quốc Gia Hà Nội, 27, tr.30-36 11 Nguyễn Thiện Tịch (1996) Kỹ thuật nuôi cấy hoa lan Nhà xuất Hà Nội 12 Nguyễn Quang Trạch cộng (2003) Bài giảng Công nghệ sinh học thực vật Nxb Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội 13 Phạm Hà Tùng, Phạm Thanh Hƣơng, Trần Văn Ơn (2015).Nghiên cứu đa dạng di truyền loài Gymnemalatifolium Wall.ex Wight dựa trình tự vùng phiên mã nội AND ribosom nhân 14 Nguyễn Văn Uyển tác giả (1993) Nuôi cấy mô thực vật phục vụ công tác trồng Nxb Nơng Nghiệp, TP Hồ Chí Minh 15 Đỗ Văn Vịnh (2005) Công nghệ tế bào thực vật ứng dụng NXB Nông nghiệ 16.Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2005).Côngnghệ sinh học(Tập 2) Nhà xuất Giáo Dục Tài liệu tiếng anh 17 Adrian S.,Nigel S., Mark F (2008) Plant biotechnology-The genetic manipulation of plants Oxford University Chapter 2, pp.37-52 18 Trevor A T.(2007) History of plant tissue culture Molecular Biotecghnology,37(2),pp.169-180 19 Razdan M.K.(2003) Introduction to plant tissu culture, Science Pub Inc.,pp.3753 20 Yong E C,Yang C C., Yoon E S., Choi K T(1998) Plant regeneration via adventitious bud formation from cotyledon explants of Panax ginseng C A.Meyer Plant Cell Reports 17, pp.731-736 Phụ biểu Phụ biểu 1: Môi trƣờng MS Các thành phần môi trƣờng Hàm lƣợng (mg/l) Axit nicotinic 0,5 Cacl2 440 CoCl2 0,025 CuSO47H2O 0,025 FeSO4.7H2O 27,8 Glycine H3BO5 6,2 KH2PO4 170 KNO3 1900 MgSO4.7H2O 370 MnSO4.H2O 22,3 Myo-Inositol 100 Na2EDTA 37,3 Na2MoO4 0,25 NH4NO3 1650 Pryrydoxine HCL 0,5 Thiamine HCl 0,1 ZnSO4 8,6 Phụ biểu 2: Môi trƣờng MS* Thành phần môi trƣờng CaCl2 CoCl2 CuSO4 FeSO4.7H2O Glycine H3BO5 KH2PO4 KI KNO3 MgSO4.7H2O MnSO4 Myo-inositol Na2EDTA Na2MoO4.2H2O NH4NO3 Nicotinic acid Pyridoxyl HCl Thiamin HCl ZnSO4 Hàm lƣợng (mg/l) 440 0,025 0,025 27,84 6,2 170 0,83 950 370 16,9 100 37,24 0,25 825 0,5 0,5 0,4 8,6 Phụ biểu 3: Môi trƣờng WPM( Woody plant medium) Thành phần môi trƣờng Acid nicotinic B1 B6 CaCl2.2H2O Ca(NO3)2.4H2O CuSO4 5H2O Glycine H3PO3 KH2PO4 K2NO4 MgSO4.7H2O MnSO4.7H2O Myo-inositol Na2EDTA Na2MoO4.2H2O NH4NO3 FeSO4.7H2O ZnSO4.7H2O Hàm lƣợng mg/l 0,1 96 556 0,25 2,0 6,2 170 990 370 22,3 100 37,5 0,25 400 27,8 8,6 Phụ biểu Ảnh hƣởng thời gian khử trùng cồn 70 đến khả nảy mầm CTKT Thời gian khử trùng(phút) Lần lặp Số lƣợng mẫu Tb Tb Tb tb 30 30 30 30 Tỷ lệ mẫu sạch(%) Số Tỷ lƣợng lệ(%) 27 90 28 93,34 29 96,66 93,3 30 100 30 100 30 100 100 30 100 30 100 30 100 100 30 100 30 100 30 100 30 100 Tỷ lệ mẫu nảy mầm(%) Số Tỷ lƣợng lệ(%) 27 80 28 93,34 29 96,66 93,3 26 86,66 29 96,66 29 96,66 93,3 25 83,33 20 66,66 27 90 83,33 20 67 22 73 18 60 66,67 Kết kiểm tra tỷ lệ mẫu nảy mầm cồn 70o Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count 3 3 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups SS 1291,283 595,889 Total 1887,172 Sum Average Variance 270 90 77,7556 279,98 93,32667 33,33333 239,99 79,99667 144,5222 200 66,66667 42,33333 df MS F P-value F crit 430,4278 5,778631 0,021137 4,066181 74,48613 11 Phụ biểu 5: Ảnh hƣởng thời gian khử trùng Javen 5% CTKT Thời gian khử trùng(phút) Lần lặp Số lƣợng mẫu 1 3 30 Tỷ lệ mẫu sạch(%) Số Tỷ lƣợng lệ(%) 16 53,33 12 40 14 46,67 14 46,67 12 40 Tb 46,67 2 30 60 18 60 19 63,33 19 63,33 20 66,67 20 66,67 66,33 30 80 24 80 28 93,33 28 93,33 26 86,67 26 86,67 86,67 30 Tb 100 29 96,67 30 100 28 93,33 30 100 30 100 30 100 Anova: Single Factor ANOVA Count 3 3 Sum 130 190 260 290 Average 43,33333 63,33333 86,66667 96,66667 86,67 30 Kết kiểm tra tỷ lệ mẫu nảy mầm Javen 5% SUMMARY Groups 63,33 24 Tb 43,33 18 Tb Tỷ lệ mẫu nảy mầm(%) Số Tỷ lƣợng lệ(%) 13 43,33 Variance 11,12223 11,12223 44,42223 11,12223 96,7 Source of Variation Between Groups Within Groups 5158,333 Pvalue F crit 1,79E3 1719,444 88,41589 06 4,066181 155,5779 19,44723 SS Total 5313,911 df MS F 11 Phụ biểu 06: Ảnh hƣởng nồng độ BAPđến khả nhân nhanh chồi Nồng độ BAP (mg/l) 0.1 0.3 0.5 0.7 Lần lặp Tb Tb Tb Tb Tb Số lƣợng chồi(chồi) 30 30 30 30 30 Số chồi trung bình/mẫu 0,68 0,5 0,5 0,56 0,9 0,78 0,72 0,8 0,8 1,2 1,18 1,06 1,65 1,49 1,45 1,53 0,9 1,13 1,15 1,06 Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count 3 3 Sum Average 1,68 0,56 2,4 0,8 3,18 1,06 4,59 1,53 3,18 1,06 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups SS 1,56504 0,201 df 10 Total 1,76604 14 Variance 0,0108 0,0084 0,0508 0,0112 0,0193 MS F P-value 0,39126 19,46567 0,000104 0,0201 F crit 3,47805 Phụ biểu 07: Ảnh hƣởng nồng độ kinetin NAA đến khả nhân nhanh chồi CTTN Nồng độ BAP Nồng độ kinetin Nồng độ NAA 1 0,1 0,5 0,2 0,3 0,3 0,2 0,4 0,5 Số lần lặp Tb Tb Tb Tb Số lƣợng chồi 30 30 30 30 Số chồi trung bình/mẫu 2,1 1,92 1,77 1,93 1,8 1,5 1,5 1,6 1 1,39 1,13 0,9 1,2 1,03 Kết phân tích phƣơng sai nhân tố ảnh hƣởng nồng độ kinetin NAA đến khả nhân nhanh chồi Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total 3 3 SS 1,5782 0,262667 1,840867 Sum Average Variance 5,79 1,93 0,0273 4,8 1,6 0,03 3,39 1,13 0,0507 3,1 1,033333 0,023333 df MS F P-value F crit 0,526067 16,02234 0,00096 4,066181 0,032833 11 ... Tiêp tục nghiên cứu hồn thiện quy trình nghiên cứu nhân giống Dây thìa canh kỹ thuật ni cấy in vitro 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Nguyễn Thị Lý Anh (1990) Nhân giống trồng in vitro, ... VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU I Giới thiệu Dây thìa canh 1.1 Nguồn gốc hệ thống phân loại Hình 1.1 Cành có hoa Dây thìa canh (Gymnema sylvestre) (Nguồn: Trần Văn Ơn, 2006) Tên Việt Nam: Dây thìa canh, Dây muôi,... chồi; - Nghiên cứu ảnh hƣởng nồng độ chất điều hoà sinh trƣởng đến khả nhân nhanh chồi; 2.3 Đối tƣợng, vật liệu nghiên cứu - Đối tƣợng nghiên cứu: Dây thìa canh (Gymnema sylvestre) - Vật liệu nghiên