Nghiên cứu nhân giống địa lan thanh ngọc (cymbidium ensyolium) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro

LỜI CẢM ƠN Lý thuyết năm đại học vô quý báu quan trọng với ngƣời sinh viên, đặc biệt với sinh viên ngành công nghệ sinh học nhƣ chúng tôi; môn học có kiến thức ứng dụng khác đời sống ngày từ bé tới lớn Vì vậy, để củng cố kiến thức tơi tiến hành thực khóa luận: “Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống Địa lan Thanh ngọc (Cymbidium ensifolium) phƣơng pháp ni cấy in vitro” Trong q trình thực khóa luận, để đạt đƣợc kết tốt ngồi cố gắng thân, bảo, giúp đỡ tận tình thầy cơ, bạn bè động viên gia đình góp phần giúp tơi vƣợt qua khó khăn học tập Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Hồng Gấm Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp - Trƣờng Đại học Lâm nghiệp tận tình hƣớng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi nhất, giúp đỡ tơi suốt thời gian thực hồn thành khóa luận Đồng thời tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô, anh chị cán bạn sinh viên Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp giúp đỡ bảo suốt q trình học tập nghiên cứu để hồn thành khóa luận cách tốt thời gian sớm Cuối cùng, tơi xin kính chúc thầy, cô giáo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, trƣờng Đại học Lâm nghiệp dồi sức khỏe, đạt đƣợc nhiều thành công sống nhƣ nghiệp nghiên cứu giảng dạy Hà Nội, ngày 14 tháng năm 2018 Sinh viên thực Trần Văn Cƣơng i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN TỔNG QU N VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan nhân giống lan phƣơng pháp nuôi cấy in vitro 1.1.1 Khái niệm nuôi cấy in vitro 1.1.2 Cơ sở khoa học nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.1.3 Các điều kiện nuôi cấy in vitro 1.1.4 Môi trƣờng nuôi cấy in vitro 1.1.5 Các giai đoạn nhân giống phƣơng pháp nuôi cấy in vitro lan 10 1.1.6 Ý nghĩa kỹ thuật nuôi cấy in vitro 13 1.2 Tổng quan Địa lan Thanh ngọc 14 1.2.1 Đặc điểm chung Địa lan Thanh ngọc 15 1.3 Lịch sử nghiên cứu thành tựu nuôi cấy in vitro hoa lan 16 1.3.1 Trên giới 16 1.3.2 Ở Việt Nam 17 PHẦN MỤC TI U - N I DUNG - PHƢƠNG PH P TH C HI N 22 2.1 Mục tiêu nghiên cứu: 22 2.2 Nội dung nghiên cứu 22 2.3.Phƣơng pháp nghiên cứu 22 2.3.1.Phƣơng pháp luận 22 2.3.2 Địa điểm điều kiện bố trí thí nghiệm 23 2.3.3 Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm cụ thể 23 2.3.4 Phƣơng pháp thu thập xử lý số liệu 27 2.3.5 Thời gian thực đề tài 27 ii PHẦN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Nghiên cứu ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi cấy đến khả tái sinh phôi hạt Địa lan Thanh ngọc 29 3.1.1 Kết ảnh hƣởng môi trƣờng dinh dƣỡng đến khả tái sinh phôi hạt Địa lan Thanh ngọc 29 3.1.2 Kết ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng đến khả tái sinh phôi hạt 31 3.2 Nghiên cứu ảnh hƣởng chất ĐHST đến khả nhân nhanh thể chồi Địa lan Thanh ngọc 33 3.3 Ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng đến khả nhân nhanh chồi Địa lan Thanh ngọc 35 3.4 Ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng đến khả rễ Địa lan Thanh ngọc 39 PHẦN 43 KẾT LUẬN- TỒN TẠI - KIẾN NGHỊ 43 4.1 Kết luận 43 4.2.Tồn 43 4.3 Kiến nghị 43 T I I U TH M HẢO iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TT CHỮ VIẾT TẮT CHỮ ĐẦY ĐỦ BAP 6-benzylamino purine Kinetin 6-furfurylamino purine IAA Indole-3-acetic acid IBA Indole-3-butyric acid GA3 Acid Gibberellic NAA Naphthyl acetic acid ĐHST Chất điều hòa sinh trƣởng CTTN Cơng thức thí nghiệm 10 ĐC Đối chứng 11 TN Thí nghiệm iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Ảnh hƣởng môi trƣờng dinh dƣỡng đến khả tái sinh phôi hạt 23 Bảng 2.2 Ảnh hƣởng chất ĐHST đến khả tái sinh phôi hạt 24 Bảng 2.3 Ảnh hƣởng chất ĐHST đến khả nhân nhanh thể chồi 25 Bảng 3.1 Ảnh hƣởng môi trƣờng dinh dƣỡng đến khả tái sinh phôi hạt 30 Bảng 3.2: Ảnh hƣởng chất điều hịa sinh trƣởng tới khả tái sinh phơi hạt 31 Bảng 3.3: Ảnh hƣởng chất ĐHST tới khả nhân nhanh thể chồi 33 Bảng 3.4: Ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng đến khả nhân nhanh chồi Địa lan Thanh ngọc 37 Bảng 3.5: Kết ảnh hƣởng chất ĐHST đến khả rễ Địa lan Thanh ngọc 40 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Cây Địa lan Thanh ngọc 14 Hình 3.1: Phơi hạt Địa lan Thanh ngọc tái sinh môi trƣờng MS 30 Hình 3.2: Phơi hạt Địa lan Thanh ngọc mơi trƣờng CT3 32 Hình 3.3: Sự phát triển phôi hạt lan sau tuần ni cấy 32 Hình 3.4: Biểu đồ ảnh hƣởng hàm lƣợng chất điều hòa sinh trƣởng tới hệ số nhân nhanh thể chồi 34 Hình 3.5: Thể chồi Địa lan Thanh ngọc sau tuần môi trƣờng TC2 (A) TC4 (B) 34 Hình 3.6: Sự phát triển thể chồi sau tuần (A) tuần (B) 35 Hình 3.7: Chồi lan hình thành từ thể chồi sau tuần nuôi cấy 36 Hình 3.8: Biểu đồ ảnh hƣởng hàm lƣợng chất điều hòa sinh trƣởng tới khả nhân nhanh chồi Địa lan Thanh ngọc 37 Hình 3.9: Chồi Địa lan Thanh ngọc mơi trƣờng VC5 (A) VC1 (B) sau tuần nuôi cấy 38 Hình 3.10: Chồi lan lúc cấy chuyển (A) sau tuần (B) 39 Hình 3.11: Biểu đồ ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng đến số rễ TB/chồi Địa lan Thanh ngọc 40 Hình 3.12 Chồi Địa lan Thanh ngọc đƣợc rễ môi trƣờng RR3 (A) RR5 (B) 41 Hình 3.13 Sơ đồ tổng quát quy trình nhân giống Địa lan Thanh ngọc phƣơng pháp nuôi cấy in vitro 42 vi ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam đất nƣớc đƣợc thiên nhiên ƣu nhiều, lãnh thổ Việt Nam nằm vùng khí hậu nhiệt đới nhƣng khí hậu Việt Nam lại phân bố thành vùng khí hậu riêng biệt với miền bắc khí hậu cận nhiệt đới ẩm, miền Trung Bắc trung kiểu khí hậy nhiệt đới gió mùa, miền Nam Nam Trung mang đặc điểm kiểu nhiệt đới Xavan Có nói Đơng Nam nói chung Việt Nam nói riêng thiên đƣờng cho chi lan Hồng Thảo sinh trƣởng phát triển Theo Phong lan Việt Nam Trần Hợp nƣớc ta có 137-140 chi gồm 800 lồi lan rừng có nhiều loại lan quý có giá trị kinh tế hoa học cao Trong năm gần thú chơi lan ngƣời khiến cho loại lan bị săn lùng riết khiến cho nhiều loại lan bị đƣa vào sách đỏ có nguy tuyệt chủng cao Ở tự nhiên quần thể lan tái tạo lại gặp điều kiện thuận lợi nhiên phải thời gian lâu Vì việc nhân giống lồi lan vấn đề vơ quan trọng Khi tìm hiểu Địa lan Thanh ngọc (Cymbidium ensifolium) khiến thật ấn tƣợng mùi hƣơng nhẹ khác biệt với loại lan khác Lan Thanh ngọc (Cymbidium ensifolium) loại phong lan nhỏ, 3-4 dài 40-50cm, ngang rộng 2-3 cm Dò hoa cao chừng 30cm, hoa từ 2-9 to khoảng 1-3cm nở vào cuối mùa hạ, đầu mùa thu với hƣơng thơm tuyệt hảo khỏe mạnh có nhiều dị hoa Hoa bền 14 đến 21 ngày, có màu xanh ngọc sở hữu vẻ đẹp dịu dàng, nhã Địa lan Thanh ngọc đƣợc trồng làm cảnh đẹp đƣợc đa số ngƣời chơi lan yêu thích Với giá trị đem lại việc nghiên cứu kỹ thuật nhân giống với mục tiêu tạo số lƣợng giống lớn cung cấp cho thị trƣờng vấn đề cấp thiết Do đó, thời gian làm khóa luận tốt nghiệp, tơi thực đề tài: “Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống Địa lan Thanh ngọc (Cymbidium ensifolium) phƣơng pháp nuôi cấy in vitro” TỔN PHẦN QU N VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan nhân giống lan phƣơng pháp nuôi cấy in vitro 1.1.1 Khái niệm nuôi cấy in vitro Nuôi cấy in vitro thuật ngữ mô tả phƣơng thức nuôi cấy phận thực vật ống nghiệm có chứa mơi trƣờng xác định điều kiện vơ trùng Mơi trƣờng có chất dinh dƣỡng thích hợp nhƣ muối khống, vitamin, hoocmon sinh trƣởng đƣờng [10] 1.1.2 Cơ sở khoa học ni cấy mơ tế bào thực vật 1.1.2.1 Tính toàn tế bào Cuối kỷ XIX đầu kỷ XX, Gottlibeb Haberlant - nhà thực vật học ngƣời Đức đặt móng cho ni cấy mơ tế bào thực vật.Ơng đƣa giả thuyết tính tồn tế bào sách “Thực nghiệm nuôi cấy tách rời” năm 1902 Theo ông: “Tế bào thể sinh vật mang tồn lƣợng thơng tin di truyền (DNA) cần thiết đủ sinh vật hi gặp điều kiện thích hợp, tế bào phát triển thành cá thể hồn chỉnh” Tính tồn tế bào mà Haberlant đƣa sở lý luận phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Hơn 50 năm sau, nhà thực nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật đạt đƣợc thành tựu chứng minh cho khả tồn phát triển độc lập tế bào Kỹ thuật tạo dòng (cloning) tế bào đơn đƣợc phân lập điều kiện in vitro chứng minh thực tế tế bào soma, dƣới điều kiện thích hợp, phân hóa để phát triển thành thể thực vật hồn chỉnh 1.1.2.2 Sự trẻ hóa Thế kỷ XVII - XVIII, ngƣời ta cho dịng vơ tính bị thối hóa theo tuổi trẻ hóa thông qua sinh sản hạt Nhƣng thực tế cho thấy đời sống dịng vơ tính vơ hạn nều nhƣ sống mơi trƣờng thích hợp liên tục đƣợc đổi sinh sản sinh dƣỡng Sự thối hóa chủ yếu tác hại virus mà Khả chồi, rễ thành phần khác khác Vì để chọn mẫu cấy phù hợp phải vào trạng thái sinh lý hay tuổi mẫu Trong nuôi cấy in vitro, mẫu non trẻ có phản ứng với điều kiện môi trƣờng nuôi cấy nhanh, dễ tái sinh, đặc biệt nuôi cấy mô sẹo, phơi.Ngồi mơ non trẻ đƣợc hình thành, sinh trƣởng mạnh, mức độ nhiễm mầm bệnh 1.1.2.3 Sự phân hóa phản phân hóa tế bào Sự phát triển thể trƣởng thành từ tế bào đơn (hợp tử) kết hợp phân chia phân hóa tế bào Sự phân hóa tế bào chuyển hóa tế bào phơi sinh thành mơ chun hóa, đảm nhận chức khác thể Sự phản phân hóa chuyển tế bào chuyên hóa chức trở lại thành tế bào phơi sinh điều kiện ni cấy thích hợp Hai q trình đƣợc biểu thị sơ đồ sau: Biệt hóa tế bào Tế bào phôi sinh Tế bào giãn Tế bào chuyên hóa Phản biệt hóa tế bào Về chất phân hóa phản phân hóa q trình điều hịa hoạt hóa gen Tại thời điểm hai q trình phát triển cá thể có số gen đƣợc hoạt hóa (mà vốn trƣớc bị hạn chế) để tạo tính trạng mới, số gen khác lại bị đình hoạt động Điều xảy theo chƣơng trình đƣợc mã hóa cấu trúc phân tử DNA tế bào Mặt khác cho tế bào nằm khối mô thể thƣờng bị ức chế tế bào xung quanh Khi tách riêng tế bào giảm kích thƣớc khối mô sẹo tạo điều kiện thuận lợi cho hoạt hóa gen tế bào, trình hoạt hóa đƣợc xảy theo cấu trúc định sẵn có gen 1.1.3 Các điều kiện nuôi cấy in vitro 1.1.3.1 Điều kiện vô trùng Môi trƣờng để nuôi cấy mô tế bào thực vật có chứa đƣờng, vitamin, muối khống,… thích hợp cho loại nấm vi khuẩn phát triển Do tốc độ phân bào nấm vi khuẩn lớn nhiều so với tế bào thực vật, môi trƣờng nuôi cấy cần nhiễm vài bào tử nấm vi khuẩn sau vài ngày đến tuần, toàn bề mặt môi trƣờng mô nuôi cấy phủ đầy nhiều loại nấm vi khuẩn Thí nghiệm phải bỏ điều kiện mơ ni cấy không phát triển chết dần - Vô trùng dụng cụ môi trƣờng nuôi cấy: + Khử trùng ƣớt: phƣơng pháp áp dụng hiệu phổ biến vô trùng môi trƣờng nuôi cấy, dụng cụ nuôi cấy, nút nƣớc nhiệt độ 117oC áp suất 1,2-1,5 atm Thiết bị sử dụng nồi hấp vô trùng + Khử trùng khô (sấy khô): Phƣơng pháp dùng cho dụng cụ kim loại, thủy tinh, nút bông, dụng cụ có tính chịu nhiệt Thiết bị dùng khử trùng khơ tủ sấy.Nhiệt độ đảm bảo 160-200oC + Màng lọc: Dùng để loại bỏ tác nhân gây ô nhiễm có kích thƣớc 0,025-10µm khỏi mơi trƣờng ni cấy Đây phƣơng pháp phù hợp với môi trƣờng mà thành phần bị phân hủy nhiệt độ cao nhƣ dung dịch enzyme số chất điều hòa sinh trƣởng Hiện ngƣời ta sử dụng hệ thống bơm khử trùng dung tích lớn để trùng dung dịch nuôi cấy nuôi cấy tế bào trần hay huyền phù tế bào - Vô trùng mẫu cấy: Với loại mẫu cấy khác loại mẫu cấy nhƣng vị trí khác phƣơng pháp khử trùng mẫu cấy khác Phƣơng pháp phổ biến vô trùng mẫu cấy sử dụng hóa chất có khả tiêu diệt vi sinh vật Trong thí nghiệm auxin (N ) đƣợc bổ sung với hàm lƣợng khác 0,3 mg/l 0,2 mg/l, đồng thời kết hợp với BAP nồng độ khác môi trƣờng nuôi cấy MS + 100 ml/l dịch chiết khoai tây + 20 g/l sucrose + 4,5 g/l agar Kết thu đƣợc bảng 3.4 dƣới Bảng 3.4: Ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng đến khả nhân nhanh chồi Địa lan Thanh ngọc ĐC Hệ số nhân nhanh chồi (lần) 1,00 Chồi nhỏ, màu xanh nhạt, ngắn VC1 2,12 Chồi nhỏ, màu xanh nhạt, ngắn VC2 2,21 Chồi nhỏ, màu xanh nhạt VC3 2,80 Chồi mập, màu xanh đậm, đồng VC4 3,1 Chồi mập, màu xanh đậm, đồng VC5 3,80 Chồi mập, màu xanh đậm, đồng VC6 2,50 Chồi nhỏ, màu xanh nhạt VC7 3,30 Chồi nhỏ, xanh nhạt CTTN Đặc điểm chồi H SỐ NHÂN NH NH 3,5 2,5 1,5 0,5 ĐC VC1 VC2 VC3 VC4 VC5 VC6 VC7 CƠNG THỨC THÍ NGHI M Hình 3.8: Biểu đồ ảnh hƣởng hàm lƣợng chất điều hòa sinh trƣởng tới khả nhân nhanh chồi Địa lan Thanh ngọc 37 Trên sở phân tích số liệu thống kê cho cơng thức thí nghiệm hàm Anova ta thấy: Ftính=4.90 > F0,05=2,66 Nhƣ vậy, hàm lƣợng chất điều hòa sinh trƣởng khác có ảnh hƣởng rõ rệt tới khả nhân nhanh chồi Địa lan Thanh ngọc Từ bảng 3.4 cho thấy: công thức VC5 cho hệ số nhân nhanh chồi cao 3,8 lần A B Hình 3.9: Chồi Địa lan Thanh ngọc môi trƣờng VC5 (A) VC1 (B) sau tuần nuôi cấy Nhƣ vậy, qua kết ta thấy hàm lƣợng BAP thích hợp bổ sung vào mơi trƣờng nhân nhanh chồi 0,3mg/l, Kinetin 0,5mg/l, NAA 0,2mg/l GA3 0,2mg/l Ở công thức cho hệ số nhân nhanh chồi cao mà chồi tạo có chất lƣợng tốt, xanh đậm, mập, đồng Trong cơng thức cịn lại chồi tạo nhỏ chất lƣợng hơn.Vậy công thức môi trƣờng thích hợp để nhân nhanh chồi Địa lan Thanh ngọc : MS + 0,3mg/l BAP + 0,5mg/l Kinetin + 0,2mg/l NAA + 0,2mg/l GA3 + 100ml/l dịch chiết khoai tây (1g khoai tây/1ml dịch chiết) + 20g/l sucrose + 4,5g/l agar Quan sát phát triển chồi Địa lan Thanh ngọc thấy chồi lan bắt đầu cấy chuyển có 1-2 mầm, chiều cao từ 138 1,5cm Sau nuôi cấy mơi trƣờng thích hợp chồi lan dần phát triển chiều cao đạt mức 2-4cm, có 3-4 lá, chồi màu xanh đậm, khỏe mạnh A B Hình 3.10: Chồi lan lúc cấy chuyển (A) sau tuần (B) 3.4 Ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng đến khả rễ Địa lan Thanh ngọc Ra rễ chổi lan đủ tiêu chuẩn kích thƣớc số lƣợng khâu quan trọng Trong giai đoạn chồi lan đƣợc kích thích rễ để tạo in vitro hồn chỉnh Vai trị chất điều hịa sinh trƣởng mang tính chất định Auxin Auxin nhóm chất có tác dụng lên tầng phát sinh mẫu nuôi cấy đặc biệt giai đoạn có tác dụng hình thành rễ Ở thí nghiệm chúng em tiến hành cấy chuyển chồi lan đủ tiêu chuẩn chất lƣợng kích thƣớc vào mơi trƣờng có bổ dung thêm chất điều hòa sinh trƣởng nồng độ khác Kết thu đƣợc bảng 3.5 dƣới 39 Bảng 3.5: Kết ảnh hƣởng chất ĐHST đến khả rễ Địa lan Thanh ngọc Chất ĐHST Số chồi (mg/l) CTTN ban Số chồi rễ Tỷ lệ chồi Số rễ Đặc điểm TB/chồi rễ NAA IBA đầu ĐC 0 30 0 - RR1 0,2 30 17 56.67 1,50 ++ RR2 0,3 30 18 60.00 2,10 ++ RR3 0,2 0,3 30 30 100 3,10 +++ RR4 0,2 0,5 30 22 73.33 2,67 ++ RR5 0,1 0,8 30 25 83.33 3,07 + rễ (%) Ghi chú: (+): Rễ xấu, nhỏ, mảnh (++): Rễ trung bình, mảnh (+++): Rễ tốt, mập, xanh đậm 3,5 3,1 Số rễ TB/chồi 3,07 2,67 2,5 2,1 1,5 1,5 0,5 0 ĐC RR1 RR2 RR3 RR4 RR5 CƠNG THỨC THÍ NGHI M Hình 3.11: Biểu đồ ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng đến số rễ TB/chồi Địa lan Thanh ngọc 40 Qua bảng 3.5 kết phân tích phƣơng sai nhân tố số lƣợng rễ TB/chồi: Ftính(=6.12) >F0,05(3.1), nghĩa hàm lƣợng chất điều hòa sinh trƣởng khác có ảnh hƣởng khác rõ rệt đến số rễ TB/chồi Khi sử dụng phối hợp hai chất điều hòa sinh trƣởng NAA IBA công thức RR3 mang lại hiệu cao nhất, tỷ lệ rễ cao đạt 100%.Rễ nhiều, dài xanh đậm mập A B Hình 3.12 Chồi Địa lan Thanh ngọc đƣợc rễ môi trƣờng RR3 (A) RR5 (B) Nhƣ vậy, môi trƣờng tối ƣu cho chồi Địa lan Thanh ngọc rễ là: MS + 0,2mg/l NAA + 0,3mg/l IBA + 100ml/l dịch chiết khoai tây (1g khoai tây/1ml dịch chiết) + 20 g/l sucrose + 4,5g/l agar 41 SƠ ĐỒ QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU TỔNG QUÁT Quả Địa lan Thanh ngọc khử trùng Tái sinh phôi hạt Thể chồi Nhân nhanh thể chồi Tái sinh chồi từ thể chồi Nhân nhanh chồi Chồi Địa lan Thanh ngọc Nhân nhanh chồi ích thích tăng trƣởng chồi Chồi Địa lan Thanh ngọc đủ tiêu chuẩn rễ Ra rễ in vitro Cây Địa lan Thanh ngọc hồn chỉnh Hình 3.13 Sơ đồ tổng quát quy trình nhân giống Địa lan Thanh ngọc phƣơng pháp nuôi cấy in vitro 42 PHẦN KẾT LUẬN- TỒN TẠI - KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Dựa vào kết thu đƣợc từ thí nghiệm chúng tơi kết luận nhƣ sau: - Cơng thức mơi trƣờng thích hợp để tái sinh phôi hạt Địa lan Thanh ngọc CT3: MS + 0,3 mg/l BAP + 0,2 mg/l Kinetin + 0,2 mg/l NAA + 100ml/l dịch chiết khoai tây (1g khoai tây/1ml dịch chiết) + 20g/l sucrose + 4,5g/l agar Công thức mơi trƣờng thích hợp để nhân nhanh thể chồi Địa lan Thanh ngọc môi trƣờng TC2: MS + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 20g/l sucrose + 4,5g/l agar + 0,3 mg/l BAP + 0,2 mg/l Kinetin + 0,2 mg/l NAA thích hợp cho nhân nhanh thể chồi - Cơng thức mơi trƣờng thích hợp để nhân nhanh chồi Địa lan Thanh ngọc VC5: MS + 0,3 mg/l BAP + 0,5 mg/l Kinetin + 0,2 mg/l NAA + 0,2 mg/l GA3 + 100 ml/l dịch chiết khoai tây (1g khoai tây/1ml dịch chiết) + 20g/l sucrose + 4,5g/l agar Cơng thức mơi trƣờng thích hợp để rễ chồi Địa lan Thanh ngọc RR3: MS + 0,2 mg/l NAA + 0,3 mg/l IBA + 100 ml/l dịch chiết khoai tây (1g khoai tây/1ml dịch chiết) + 20 g/l sucrose + 4,5g/l agar 4.2.Tồn Do thời gian thực đề tài hạn chế nên quy trình nhân giống Địa lan Thanh ngọc chƣa đƣợc hồn thiện, nội dung cịn lại nhƣ: nghiên cứu chế độ huấn luyện lan mô từ ống nghiệm ngồi mơi trƣờng, tìm giá thể trồng cấp I cấp II thích hợp nhƣ chế chăm sóc Địa lan Thanh ngọc sau 4.3 Kiến nghị Cần có thời gian điều kiện để tiếp tục hồn thiện nội dung cịn lại quy trình nhân giống Địa lan Thanh ngọc phƣơng pháp nuôi cấy in vitro 43 T I I U TH M HẢO Tiếng việt: Trần Duy Dƣơng (2015), “nghiên cứu đa dạng di truyền xác định thị nhận dạng số nguồn gen hoa lan hoàng thảo (Dendrobium) địa Việt Nam”, uận án tiến sĩ nông nghiệp - Viện Khoa Học Nông Nghiệp Việt Nam Bùi Thị Hiền (2009), “Nghiên cứu số biện pháp kỹ thuật nâng cao suất, chất lượng hoa lan Hoàng thảo lai (Dendrobium hybrid)”, Luận văn Thạc sĩ Nông nghiệp - Trƣờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội Đồng Thị Hệ (2012), “Nghiên cứu hoàn thiện kỹ thuật nhân giống lan Hoàng thảo Vạch vàng (Dendrobium ochraceum de Wild)”, Khóa luận tốt nghiệp – Trƣờng Đại học Lâm nghiệp Phan Thúc Huân (2009), “Hoa lan - nuôi trồng kinh doanh”, NXB Phƣơng Đông Trần Hợp (1998), “Phong lan Việt Nam”, Nhà xuất Nông nghiệp Vũ Thị Huệ (1999) “Nhân giống số loài phong lan địa bằngphương pháp nuôi cấy ống nghiệm”, luận văn Thạc sĩ khoa học âm Nghiệp, ĐH N Bùi Văn im (2015), “Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống lan Hoàng thảo đơn cam (Dendrobium unicum) phương pháp nuôi cấy in vitro” hóa luận tốt nghiệp - Trƣờng Đại học âm nghiệp Nguyễn Thị oan (2010), “Nghiên cứu hoàn thiện kỹ thuật nhân giống lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceusBlume) qua phôi hạt phương pháp nhân giống in vitro” hóa luận tốt nghiệp - Trƣờng Đại học âm nghiệp Lê Thị Mận (2009), “Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống in vitro lồi lan Kim tuyến (Anoectochilus Setaceus Blume)” Khóa luận tốt nghiệp Trƣờng Đại học Lâm nghiệp 10 Nguyễn Thiện Tịch, Đoàn Thị Hoa, Trần Sĩ Dũng, Huỳnh Thị Ngọc Nhân (1996), “Kỹ thuật nuôi trồng hoa lan”, Nhà xuất Nơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh 11 Nguyễn Thiện Tịch (1996), “Kỹ thuật nuôi hoa lan”, Nhà xuất Hà Nội 12 Trần Thị Thanh (2010), “Nghiên cứu hoàn thiện kỹ thuật nhân giống lan Hoàng thảo Đùi gà (Dendrobium Nobile Lindl)” Khóa luận tốt nghiệp - Trƣờng Đại học Lâm nghiệp 13 Nguyễn Đức Thành (2000), “Nuôi cấy mô tế bào thực vật- nghiên cứu vàứng dụng”, Nhà xuất Nông Nghiệp 14 Trần Thanh Tùng, Trƣơng Thị Bích Phƣợng (2009), “Nhân nhanh invitro Mỹ Dung lan (Vanda denisoniana Benson)”, báo cáo khoa học Hội nghị Cơng nghệ sinh học tồn quốc 2009: 452-455 15 Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Thị Nga (2005), “Nghiên cứu xây dựng quytrình kỹ thuật sau in vitro cho Địa lan”, Tạp chí Nơng nghiệp phát triển nông thôn, kỳ tháng năm 2005: 68-71 Website: 16 http://www.hoalanvietnam.org/6B2_lv/1ac/Cymbidiumensifolium.pdf 17 http://www.sdorchids.com/articles/cym_ens_article.htm 18 http://www.orchidspecies.com/cymbensifolium.htm Tiếng Anh: 19 Morel, G.(1960), “Producing virus free cymbidiums Am.Orchid Soc Bull.” 20 Robert D Hall (1999), “Plant cell culture protocols” 21 David du Puy & Phillip Cribb (1988), “The Genus Cybidium”, London PHỤ LỤC Bảng số liệu tỷ lệ tái sinh phôi hạt Địa lan Thanh ngọc qua lần lặp lại thí nghiệm MƠI TRƢỜN ẦN ẦN ẦN MS 100 100 100 Knop 80 70 60 Phụ biểu 1: Phân tích phƣơng sai nhân tố ảnh hƣởng môi trƣờng dinh dƣỡng tới khả tái sinh phôi hạt Anova: Single Factor SUMMARY Groups MS Knop Count Sum 300 210 ANOVA Source of Variation SS Between Groups 1350 Within Groups 200 Total 1550 Average Variance 100 70 100 df MS F P-value F crit 1350 50 27 0,006533 7,708647 Bảng số liệu tỷ lệ tái sinh phôi hạt Địa lan Thanh ngọc công thức mơi trƣờng khác qua lần lặp lại thí nghiệm CTTN ẦN ẦN ẦN ĐC 58 58 60 CT1 60 70 60 CT2 60 70 78 CT3 100 100 100 CT4 65 70 81 Phụ biểu 2: Phân tích phƣơng sai nhân tố ảnh hƣởng hàm lƣợng chất điều hòa sinh trƣởng tới khả tái sinh phôi hạt Địa lan Thanh ngọc Anova: Single Factor SUMMARY Groups ĐC CT1 CT2 CT3 CT4 Count 3 3 Sum 176 190 208 300 216 ANOVA Source of Variation SS df Between Groups 3125,333 Within Groups 366 10 Total Average 58,66667 63,33333 69,33333 100 72 Variance 1,333333 33,33333 81,33333 67 PMS F value F crit 6,93E781,3333 21,34791 05 3,47805 36,6 3491,333 14 CTTN ẦN ẦN ẦN ĐC 3,67 3,33 2,67 TC1 6,33 6,15 6,96 TC2 11,33 10,22 9,67 TC3 8,15 7,33 6,84 TC4 6,23 5,33 4,67 TC5 11 8,67 9,33 Bảng số liệu hệ số nhân nhanh thể chồi Địa lan Thanh ngọc qua lần lặp lại thí nghiệm Phụ biểu 3: Phân tích phƣơng sai nhân tố ảnh hƣởng hàm lƣợng chất điều hòa sinh trƣởng tới khả nhân nhanh thể chồi Địa lan Thanh ngọc Anova: Single Factor SUMMARY Groups ĐC TC1 TC2 TC3 TC4 Count 3 3 Sum 9,67 19,44 31,22 22,32 16,23 ANOVA Source of Variation SS df Between Groups 84,08511 Within Groups 4,411533 10 Total Average 3,223333 6,48 10,40667 7,44 5,41 Variance 0,258533 0,1809 0,715033 0,4381 0,6132 PMS F value F crit 1,77E21,02128 47,65073 06 3,47805 0,441153 88,49664 14 Bảng số liệu hệ số nhân nhanh chồi Địa lan Thanh ngọc qua lần lặp lại thí nghiệm CTTN VC1 VC2 VC2 VC4 VC5 VC6 VC7 ần 2,2 2,23 2,63 3,12 3,4 2,33 3,1 ần 2,12 1,2 2,33 3,23 3,5 2,6 3,3 ần 2,04 2,2 3,44 2,95 3,3 2,57 3,5 Phụ biểu 4: Phân tích phƣơng sai nhân ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng tới khả nhân nhanh chồi Địa lan Thanh ngọc Anova: Single Factor SUMMARY Groups CTTN VC1 VC2 VC2 VC4 VC5 VC6 VC7 Count 3 3 3 3 Sum 6,36 5,63 8,4 9,3 10,2 7,5 9,9 ANOVA Source of Variation SS df Between Groups 7,597829 Within Groups 3,543067 16 Total Average 2,12 1,876667 2,8 3,1 3,4 2,5 3,3 Variance 0,0064 0,343633 0,3297 0,0199 0,01 0,0219 0,04 MS F P-value F crit 1,085404 4,901535 0,004064 2,657197 0,221442 11,1409 23 Bảng số liệu số rễ TB/chồi Địa lan Thanh ngọc qua lần lặp lại thí nghiệm CTTN RR1 RR2 RR3 RR4 RR5 ần 1 2,12 3,22 3,24 3,12 ần 1,3 2,10 3,03 2,22 ần 1,7 2,08 3,05 2,55 3,09 Phụ biểu 5: Phân tích phƣơng sai nhân tố ảnh hƣởng hàm lƣợng chất ĐHST đến khả rễ Địa lan Thanh ngọc SUMMARY Groups CTTN RR1 RR2 RR3 RR4 RR5 Count 3 3 3 ANOVA Source of Variation SS Between Groups 7,190711 Within Groups 2,818867 Total 10,00958 Sum 6,3 9,3 8,01 9,21 Average 1,333333 2,1 3,1 2,67 3,07 Variance 0,123333 0,0004 0,0109 0,2709 0,0039 df MS F 12 1,438142 6,122215 0,004837 3,105875 0,234906 17 P-value F crit ... ensifolium) phƣơng pháp nuôi cấy in vitro? ?? TỔN PHẦN QU N VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan nhân giống lan phƣơng pháp nuôi cấy in vitro 1.1.1 Khái niệm nuôi cấy in vitro Nuôi cấy in vitro thuật ngữ... phƣơng pháp nuôi cấy in vitro lồi lan cịn hạn chế, đặc biệt chƣa có cơng trình nghiên cứu cơng bố việc nhân giống Địa lan Thanh ngọc Vì vậy, việc nghiên cứu kỹ thuật nhân giống phƣơng pháp nuôi cấy. .. điều kiện nuôi cấy in vitro 1.1.4 Môi trƣờng nuôi cấy in vitro 1.1.5 Các giai đoạn nhân giống phƣơng pháp nuôi cấy in vitro lan 10 1.1.6 Ý nghĩa kỹ thuật nuôi cấy in vitro