Nghiên cứu quá trình nhân giống Xoan ta (Melia azedarach L.) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro và ex vitro từ vật liệu khác nhau

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH – KTNN ==  == NGUYỄN THỊ KIM ANH NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH NHÂN GIỐNG XOAN TA (MELIA AZEDARACH L.) BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN VITRO VÀ EX VITRO TỪ VẬT LIỆU KHÁC NHAU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Di truyền – Công nghệ sinh học HÀ NỘI – 2019 TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH – KTNN ==  == NGUYỄN THỊ KIM ANH NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH NHÂN GIỐNG XOAN TA (MELIA AZEDARACH L.) BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN VITRO VÀ EX VITRO TỪ VẬT LIỆU KHÁC NHAU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Di truyền – Công nghệ sinh học Ngƣời hƣớng dẫn khoa học TS PHAN THỊ THU HIỀN TS NGUYỄN VĂN PHONG HÀ NỘI – 2019 LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Phan Thị Thu Hiền giảng viên Khoa Sinh - KTNN Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội TS Nguyễn Văn Phong cán Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp trƣờng Đại học Lâm Nghiệp tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài Tơi xin cảm ơn tới Ban Giám hiệu trƣờng ĐHSP Hà Nội 2, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN trƣờng ĐHSP Hà Nội 2, Các thầy cô cán Viện Nghiên Cứu Khoa học ứng dụng trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2, Các anh chị cán nhân viên Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp tạo điều kiện để tơi hồn thành khóa luận Trong thời gian thực đề tài nhận đƣợc giúp đỡ tận tình T.S Nguyễn Xuân Thành - Viện trƣởng Viện Nghiên Cứu Khoa học ứng dụng trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2, Th.S Ong Xuân Phong toàn thể thầy cô cán Viện Nghiên Cứu Khoa học ứng dụng trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội giúp đỡ, đóng góp ý kiến để tơi hồn thành đề tài khóa luận, nhân tơi xin gửi lời cảm ơn Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán Phòng thí nghiệm sinh lí thực vật, Phòng thí nghiệm Di truyền học - trƣờng ĐHSP Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi thiết bị, phƣơng tiện để tơi hồn thành khóa luận Cảm ơn gia đình bạn bè ln động viên, góp ý cho tơi q trình học tập hồn thành đề tài Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2019 Sinh viên NGUYỄN THỊ KIM ANH LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Tất số liệu, kết nghiên cứu khóa luận trung thực chƣa đƣợc công bố Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2019 Sinh viên NGUYỄN THỊ KIM ANH DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BAP : 6-Benzyl amoni purin Cs : Cộng IBA : Indol -3- butyric acid Kinetin : 6-fufuryl amino purin MS : Murashige Skoog mg/l, g/l : Miligam/lít, gam/lít NAA : Napthlacetic acid Nxb : Nhà xuất µM : Micromol DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Ảnh hƣởng thời gian khử trùng dùng javen 5% đến khả tạo mẫu sạch……………………………………………… 14 Bảng 3.2: Ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng đến khả tạo mơ sẹo từ vật liệu mầm…………………………………………… 16 Bảng 3.3: Ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng đến khả tạo mô sẹo từ vật liệu thân mầm xoan ta………………………………… 17 Bảng 3.4: Ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng đến khả tái sinh chồi………………………………………………………… 19 Bảng 3.5: Ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng IBA đến khả tạo rễ từ mô sẹo………………………………………………………… 21 Bảng 3.6: Ảnh hƣởng loại giá thể đến khả sống Xoan ta…………………………………………………………… 21 Bảng 3.7: Ảnh hƣởng tuổi chồi lấy hom đến khả rễ hom Xoan ta…………………………………………………………… 23 Bảng 3.8: Ảnh hƣởng nồng độ IBA đến kết giâm hom Xoan ta…… 24 Bảng 3.9: Ảnh hƣởng nồng độ NAA đến kết giâm hom Xoan ta…… 25 Bảng 3.10: Ảnh hƣởng loại giá thể đến kết giâm hom Xoan ta…… 27 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Rừng Xoan ta Hình 1.2: Cành, hoa, Xoan ta Hình 3.1: Mẫu đƣợc tạo từ hạt Xoan ta 15 Hình 3.2: Mơ sẹo đƣợc hình thành sau tuần ni cấy 18 Hình 3.3: Chồi tái sinh từ mô sẹo sau 3-4 tuần nuôi cấy 20 Hình 3.4: Tạo rễ huấn luyện đƣa mô bầu đất 22 Hình 3.5: Chồi lấy hom 30 ngày tuổi 23 Hình 3.6: Giâm Xoan ta giá thể 100% cát sơng 27 Hình 3.7: Xoan ta đƣợc giâm hom nồng độ IBA 12,5 mg/l 26 MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục đích nghiên cứu Nội dung nghiên cứu 3.1 Nghiên cứu trình nhân giống Xoan ta từ mơ sẹo phƣơng pháp nuôi cấy in vitro 3.2 Nghiên cứu trình nhân giống ex vitro băng phƣơng pháp giâm hom Xoan ta Ý nghĩa khoa học thực tiễn NỘI DUNG Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan đối tƣợng, lĩnh vực nghiên cứu 1.1.1 Giới thiệu giống Xoan ta 1.1.2 Cơ sở việc nhân giống in vitro Xoan ta 1.1.3 Nuôi cấy mô tế bào 1.2 Những cơng trình nghiên cứu giống Xoan ta đƣợc tiến hành phƣơng pháp nuôi cấy mô 1.2.1 Các cơng trình nghiên cứu nhân giống Xoan ta giới 1.2.2 Các cơng trình nghiên cứu nhân giống Xoan ta Việt Nam 1.2.3 Các cơng trình nghiên cứu nhân giống ex vitro CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 2.2 Phạm vi nghiên cứu, địa điểm thời gian 2.2.1 Phạm vi nghiên cứu 2.2.2 Địa điểm nghiên cứu 2.2.3 Thời gian nghiên cứu 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1 Bố trí thí nghiệm 2.3.2 Nội dung nghiên cứu 3.1 Nghiên cứu trình nhân giống Xoan ta từ mô sẹo phƣơng pháp nuôi cấy in vitro 14 3.1.1 Tạo mẫu giống Xoan ta 14 3.1.2 Tạo mô sẹo từ vật liệu Xoan ta 16 3.1.3 Tái sinh chồi từ vật liệu mô sẹo Xoan ta 19 3.1.4 Tạo rễ huấn luyện đƣa mô bầu đất 21 3.2 Nghiên cứu trình nhân giống ex vitro phƣơng pháp giâm hom Xoan ta 22 3.2.1 Ảnh hƣởng tuổi chồi lấy hom đến khả rễ Xoan ta 22 3.2.2 Ảnh hƣởng loại nồng độ chất điều hòa sinh trƣởng đến kết giâm hom Xoan ta 24 3.2.3 Ảnh hƣởng loại giá thể đến kết giâm hom Xoan ta 26 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 28 Kiến nghị 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO 30 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Xoan ta (Melia azedarach L.) thân gỗ, sớm rụng lá, thuộc họ xoan (Meliaceae), có nguồn gốc Ấn Độ, miền Nam Trung Quốc Australia [4] Xoan ta đƣợc phân bố nhiều nƣớc nhƣ Việt Nam, Lào, Campuchia [4] Riêng Việt Nam từ Bắc vào Nam hầu nhƣ tỉnh canh tác Xoan ta, chúng đƣợc trồng thành rừng để lấy gỗ, che bóng, phòng hộ [4] Xoan ta trồng quan trọng chiến lƣợc phát triển lâm nghiệp, đƣợc trồng vùng sinh thái lâm nghiệp, có vùng : Vùng Đồng sông Hồng, vùng Trung du, vùng Tây Bắc, vùng Nam Trung bộ, vùng Tây Nguyên, vùng Đông Nam [4] Hiện Xoan ta đƣợc khuyến khích trồng ngày đƣợc mở rộng diện tích [4] Xuất phát từ nhu cầu sản xuất thực tiễn chúng tơi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu q trình nhân giống Xoan ta (Melia azedarach L.) phƣơng pháp nuôi cấy in vitro ex vitro từ vật liệu khác nhau” Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu q trình nhân giống Xoan ta từ mơ sẹo phƣơng pháp nuôi cấy in vitro, ex vitro từ nguyên liệu thực vật khác Nội dung nghiên cứu 3.1 Nghiên cứu trình nhân giống Xoan ta từ mô sẹo phương pháp nuôi cấy in vitro Khả tạo mẫu Xoan ta Khả tạo phôi soma từ vật liệu Xoan ta Khả tái sinh chồi từ vật liệu phôi soma Xoan ta Khả tạo rễ huấn luyện đƣa mô bầu đất - Các thí nghiệm đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp Bùi Văn Thắng cs [5] có cải biến để chọn môi trƣờng tái sinh chồi thích hợp Kết bảng 3.2 cho thấy: Khi bổ sung chất điều hòa sinh trƣởng vào mơi trƣờng ni cấy kích thích khả tạo mô sẹo từ vật liệu mầm tốt, tất công thức cho tỉ lệ tạo mô sẹo cao công thức đối chứng Ở công thức đối chứng khơng bổ sung chất điều hòa sinh trƣởng, khơng có mẫu tạo đƣợc mơ sẹo, bổ sung chất điều hòa sinh trƣởng BAP mg/l, NAA tăng dần 1-1,5 mg/l khả cảm ứng tạo mô sẹo tăng theo Tuy nhiên, số lƣợng chất lƣợng mô sẹo thay đổi theo hàm lƣợng NAA, nồng độ tăng lên tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo tăng lên từ 43,33% đến 93,33% Khi giảm nồng độ BAP xuống 0,5, NAA từ 1-1,5 mg/l, kết cho thấy tỉ lệ hình thành mơ sẹo giảm mạnh, thấp CT4 (26,67%), chất lƣợng mô sẹo thay đổi chuyển từ xanh, cứng sang vàng, xốp (Bảng 3.2) Kết nghiên cứu cho thấy công thức: CT2, CT3 cho tỉ lệ mô sẹo cao nhiên chất lƣợng mơ sẹo có ảnh hƣởng lớn đến khả tái sinh chồi, mơi trƣờng CT2 rõ màu sắc trắng, xanh, cứng cơng thức thích hợp để tạo mơ sẹo (Hình 3.2) Vật liệu từ thân mầm Xoan ta Thân mầm Xoan ta đƣợc cắt thành đoạn nhỏ có chiều dài 0,5 cm, đƣợc cấy lên mơi trƣờng tạo mô sẹo Kết đƣợc theo dõi ghi lại bảng 3.3 Bảng 3.3: Ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng đến khả tạo mơ sẹo từ vật liệu thân mầm xoan ta Thí nghiệm BAP NAA (mg/l) (mg/l) Tỉ lệ tạo mô sẹo (%) Đặc điểm mô sẹo TB (%)±SD ĐC 0 00,00 ± 0,00 CT1 1,0 1,0 46,67 ± 0,23 Trắng, xanh, xốp CT2 1,0 1,5 96,67 ± 0,55 Trắng, xanh, cứng CT3 0,5 86,67 ± 0,34 Trắng, xanh, xốp CT4 0,5 1,5 33,33 ± 0,18 Trắng, vàng, xốp 17 Kết thu đƣợc bảng 3.3 cho thấy: Thân Xoan ta nuôi cấy môi trƣờng tạo mô sẹo 30 ngày cho kết tốt so với vật liệu từ mầm Tỉ lệ tạo mô sẹo đạt từ 33,33-96,67%, màu sắc đặc điểm mô sẹo thay đổi nhanh Khi môi trƣờng không bổ sung chất điều hòa sinh trƣởng khơng xuất mơ sẹo Khi tăng chất điều hòa sinh trƣởng, khả tạo mô sẹo tăng đạt tỉ lệ cao CT2 96,67% Đặc điểm cho mơ sẹo thay đổi, tăng chất điều hòa sinh trƣởng NAA từ 1-1,5 mg/l, BAP 0,5 mg/l chất lƣợng mơ sẹo giảm theo màu sắc từ trắng, xanh, xốp sang trắng, vàng, xốp Ở đây, quan sát tỉ mỉ hầu hết công thức nuôi cấy mô sẹo xốp So với kết Hồ Văn Giảng cs, Đỗ Xuân Đồng cs đạt tỉ lệ tƣơng ứng thấp với nguồn vật liệu từ thân mầm, điều rõ chất lƣợng tỉ lệ tạo mơ sẹo phụ thuộc vào độ già thân, thân mầm già khó tạo mơ sẹo [5,6] Nhƣ vậy, chất lƣợng mô sẹo tốt, tỉ lệ tạo mô sẹo cao CT2 đạt 96,67% màu sắc màu trắng, xanh, xốp (Hình 3.2) A B C Hình 3.2: Mơ sẹo đƣợc hình thành sau tuần nuôi cấy A, B: Mô sẹo từ vật liệu thân mầm sau 10 ngày; C: Mô sẹo từ vật liệu mầm sau 10 ngày 18 3.1.3 Tái sinh chồi từ vật liệu mô sẹo Xoan ta Khả tái sinh chồi phụ thuộc vào nhiều yếu tố, chất điều hòa sinh trƣởng đóng vai trò quan trọng để chồi phát triển nhiều tốt Vì vậy, việc nghiên cứu cơng thức thí nghiệm thay đổi chất điều hòa sinh trƣởng cần thiết để xác định đƣợc cơng thức thích hợp chất cho khả tái sinh chồi tốt Sử dụng mơ sẹo lục hóa đem ni cấy mơi trƣờng tái sinh tạo chồi để kiểm tra khả tái sinh mô sẹo: MS + 30 g/l sucroza + 6,8 g/l aga + chất điều hòa sinh trƣởng, pH = 5,8 Điều chỉnh nồng độ chất điều hòa sinh trƣởng thích hợp để tái sinh chồi, sau 3-4 tuần ni cấy thu thập xử lí số liệu kết thu đƣợc bảng 3.4 Bảng 3.4: Ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng đến khả tái sinh chồi CTTN BAP NAA Kinetin (mg/l) (mg/l) (mg/l) Tỉ lệ tái sinh(%) TB (%)±SD ĐC 0 CT1 0,2 0,2 23,33 ± 0,33 CT2 0,2 0,5 46,67 ± 0,51 CT3 0,2 0,2 0,5 73,33 ± 0,48 CT4 0,3 0,2 0,5 96,67 ± 0,32 CT5 0,3 0,5 53,33 ± 0,23 CT6 0,3 0,2 33,33 ± 0,45 00,00 Kết thu đƣợc từ bảng 3.4 cho thấy, môi trƣờng dinh dƣỡng bổ sung chất điều hòa sinh trƣởng với hàm lƣợng khác cho kết mô sẹo tái sinh chồi khác nhau, tất công thức cho tỉ lệ mô sẹo tái sinh cao công thức đối chứng, công thức dùng để tái sinh mô sẹo cho kết mô sẹo tạo chồi Ở công thức đối chứng khơng bổ sung chất điều hòa sinh trƣởng, tỉ lệ mô sẹo tái sinh thấp, vật liệu tái sinh mô sẹo nên không bổ 19 sung chất điều hòa sinh trƣởng mơ sẹo khơng thể kích thích tái sinh tạo thành chồi Khi bổ sung chất điều hòa sinh trƣởng BAP 0,2 mg/l, bổ sung thay đổi lần lƣợt NAA 0,2 mg/l Kinetin 0,5 mg/l khả tái sinh mô sẹo thay đổi lần lƣợt 23,33% 46,67% Tỉ lệ tái sinh mô sẹo mức trung bình Nhƣng lần lƣợt cho chất, khả tái sinh thay đổi rõ rệt lên tới 73,33% (bảng 3.4) Khi tăng hàm lƣợng BAP lên 0,3 mg/l bổ sung thay lần lƣợt NAA 0,2 mg/l Kinetin 0,5 mg/l tỉ lệ tái sinh mô sẹo thay đổi từ 33,33% lên 53,33% Khi có chất tỉ lệ tái sinh mơ sẹo 96,67% (Hình 3.3) Tất cơng thức bổ sung chất điều hòa sinh trƣởng thích hợp với khả tạo chồi Cơng thức có chứa tất chất BAP, NAA, Kinetin cho tỉ lệ tái sinh mô sẹo cao so với cơng thức lại Nhƣ nghiên cứu này, bổ sung thay đổi lần lƣợt tỉ lệ chất điều hòa sinh trƣởng vào mơi trƣờng tái sinh mơ sẹo khả mơ sẹo tái sinh thay đổi rõ rệt, nhƣng mức trung bình, nhƣng bổ sung hỗn hợp cho tỉ lệ tái sinh cao Công thức tối ƣu để tái sinh mơ sẹo tạo chồi CT4 có thành phần: MS + 30 g/l sucroza + 6,8 g/l aga + 0,3 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA + 0,5 mg/l Kinetin, pH = 5,8 Tỉ lệ tạo chồi 96,67% Chồi tái sinh từ mô sẹo mọc khỏe mạnh, xanh tốt, tạo non hồn chỉnh A B C Hình 3.3: Chồi tái sinh từ mơ sẹo sau 3-4 tuần nuôi cấy A, B: Chồi tái sinh sau tuần nuôi cấy; C: Chồi tái sinh sau tuần nuôi cấy 20 3.1.4 Tạo rễ huấn luyện đưa mô bầu đất Chồi Xoan ta tái sinh từ mô sẹo đƣợc chuyển sang môi trƣờng rễ để tạo hoàn chỉnh trồng vào bầu huấn luyện ngồi mơi trƣờng tự nhiên Trong nghiên cứu sử dụng công thức cho rễ với thành phần: MS + 30 g/l sucroza + 6,8 g/l aga, pH = 5,8 có bổ sung thêm chất điều hòa sinh trƣởng IBA với nồng độ khác thu đƣợc kết bảng 3.5 Bảng 3.5: Ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng IBA đến khả tạo rễ từ mô sẹo CTTN IBA (mg/l) Tỉ lệ chồi rễ(%) TB (%)±SD Số rễ TB/chồi ĐC 00,00 CT1 0,3 23,33 ± 0,17 2,3 CT2 0,4 46,67 ± 0,34 4,7 CT3 0,5 95,17 ± 0,45 5,3 CT4 0,6 86,67 ± 0,33 5,2 CT5 0,7 53,33 ± 0,38 5,3 Từ bảng kết ta thấy CT3 tỉ lệ chồi rễ 95,17% với số rễ trung bình/chồi 5,3 rễ môi trƣờng MS bổ sung 0,5 mg/l IBA tối ƣu (Hình 3.4A, B) Sau rửa agar trồng giá thể đất đất mùn với tỉ lệ khác Ta thu đƣợc kết nhƣ bảng 3.6 Bảng 3.6: Ảnh hƣởng loại giá thể đến khả sống Xoan ta Thí nghiệm Loại giá thể Tỉ lệ sống TB (%) TB (%)±SD 21 ĐC 100% đất 11,33 ± 0,15 CT1 đất : đất mùn 43,33 ± 0,27 CT2 đất : đất mùn 78,33 ± 0,31 CT3 đất : đất mùn 49,67 ± 0,56 Từ bảng 3.6 ta thấy loại giá thể thích hợp cho tạo mơ hồn chỉnh giá thể chứa đất : đất mùn với tỉ lệ sống trung bình 78,33% (Hình 3.4C) A B C Hình 3.4: Tạo rễ huấn luyện đƣa bầu đất A: Sau 10 ngày tạo rễ; B: Cho bầu ƣơm; C: Đƣa rèn luyện 3.2 Nghiên cứu trình nhân giống ex vitro phƣơng pháp giâm hom Xoan ta 3.2.1 Ảnh hưởng tuổi chồi lấy hom đến khả rễ Xoan ta Độ non già hom có ảnh hƣởng lớn đến khả rễ hom Xoan ta Nếu hom non già hom khả rễ, cần lựa chọn đƣợc tuối hom thích hợp để tạo đƣợc hom khỏe mạnh, sinh trƣởng phát triển tốt Trong nghiên cứu này, tiến hành chồi lấy hom có độ tuổi khác nhau: 10, 20, 30, 40, 50 ngày tuổi đƣợc xử lí nồng độ IBA 12,5 mg/l, giâm hom loại giá thể chứa 100% cát sông sau tuần giâm hom thu đƣợc kết bảng 3.7 22 Bảng 3.7: Ảnh hƣởng tuổi chồi lấy hom đến khả rễ hom Xoan ta Thí nghiệm Độ tuổi chồi lấy hom Tỉ lệ hom rễ TB (%) Tỉ lệ hom sống TB (%) TB (%)±SD Số rễ hom TB (cái) Chiều dài rễ TB (cm) TB (%)±SD (ngày tuổi) ĐC 0 0 TN1 10 13,33 ± 0,14 6,67 ± 0,09 1,21 2,70 TN2 20 30,00 ± 0,25 11,67 ± 0,33 2,00 3,00 TN3 30 68,33 ± 0,41 51,67 ± 0,23 3,33 3,36 TN4 40 53,33 ± 0,34 23,33 ± 0,13 2,67 3,22 TN5 50 23,33 ± 0,12 6,67 ± 0,11 2,67 3,21 Kết thí nghiệm cho thấy tỉ lệ hom sống tỉ lệ hom rễ thấp dần tuổi hom non hay già (nhỏ 10 lớn 50 ngày tuổi) Vì tuổi hom non khả nƣớc nhiều hom già khả hóa gỗ cao làm ảnh hƣởng đến chức sinh lí Kết bảng 3.7 cho thấy, chồi hom 30 ngày tuổi độ tuổi thích hợp cho q trình giâm hom, tỉ lệ hom rễ cao đạt 68,33%, tỉ lệ hom sống đạt 51,67% tƣơng ứng số rễ trung bình hom đạt 3,33 với chiều dài trung bình rễ đạt 3,36 cm (Hình 3.5) A B Hình 3.5: Chồi lấy hom 30 ngày tuổi A: Cành Xoan ta cắt từ 30 ngày tuổi; B: Cành giâm sau tuần 23 3.2.2 Ảnh hưởng loại nồng độ chất điều hòa sinh trưởng đến kết giâm hom Xoan ta Chất điều hòa sinh trƣởng có vai trò quan trọng việc tạo rễ sống sót q trình giâm hom Xoan ta Tùy loại nồng độ chất điều hòa sinh trƣởng lại cho tỉ lệ hom sống tỉ lệ hom rễ khác Lựa chọn đƣợc loại nồng độ chất điều hòa sinh trƣởng tối ƣu có vai trò định kết trình giâm hom Xoan ta Do vậy, tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng loại nồng độ chất điều hòa sinh trƣởng đến kết giâm hom Xoan ta thu đƣợc kết bảng 3.9 3.10 Bảng 3.8: Ảnh hƣởng nồng độ IBA đến kết giâm hom Xoan ta Thí nghiệm Nồng độ (mg/l ) Tỉ lệ hom rễ TB (%) TB (%)±SD Tỉ lệ hom sống Số rễ Chiều TB (%) hom TB dài rễ (cái) TB (cm) TB (%)±SD ĐC 0 0 TN1 2,5 0 0 TN2 18,33 ± 0,33 4,32±0,13 2,28 3.00 TN3 7,5 23,33 ± 0,21 6,67±0,15 2,33 3,21 TN4 10 46,67 ± 0,45 11,67 ± 0,21 3,24 TN5 12,5 68,33 ± 0,65 51,67 ± 0,48 3,33 3,36 TN6 15 43,33 ± 0,23 20,33 ± 0,13 2,67 3,33 Số liệu thu đƣợc từ bảng cho thấy đối chứng tỉ lệ hom rễ tỉ lệ hom sống thấp hầu nhƣ khơng có khả sống nhƣ rễ Các hom đƣợc xử lí chất kích thích nồng độ ln có tỉ lệ hom sống tỉ lệ hom rễ cao Khi mơi trƣởng có bổ sung thêm mg/l IBA ta thấy tỉ lệ hom rễ 18,33% tỉ lệ hom sống 4,32 % Nhƣ vậy, chất điều hòa sinh trƣởng có vai trò định khả sống khả rễ hom Xoan ta Các chất khác cho tỉ lệ sống tỉ lệ rễ khác Kết thí nghiệm cho thấy, sử dụng IBA nồng độ 12,5 mg/l cho tỉ lệ hom sống tỉ lệ hom rễ cao đạt 68,33% 51,67% tƣơng ứng 24 chiều dài rễ đạt 3,36 cm số rễ trung bình hom đạt tới 3,33 công thức tối ƣu (bảng 3.9) Khi sử dụng chất điều hòa sinh trƣởng NAA ta thu đƣợc kết bảng 3.10 Bảng 3.9: Ảnh hƣởng nồng độ NAA đến kết giâm hom Xoan ta Thí Nồng độ nghiệm (mg/l) Tỉ lệ hom rễ TB (%) Tỉ lệ hom sống TB (%) TB (%)±SD Số rễ hom TB (cái) Chiều dài rễ TB (cm) TB (%)±SD ĐC 0 0 TN1 2,5 0 0 TN2 13,33 ± 0,12 6,67± 0,05 0 TN3 7,5 30,00 ± 0,18 11,67 ± 0,09 2,00 3,00 TN4 10 53,33 ± 0,56 23,33 ± 0,28 3,33 3,22 TN5 12,5 78,33 ± 0,46 23,33 ± 0,31 2,67 3,22 TN6 15 43,33 ± 0,29 6,67 ± 0,12 2,67 3,21 Qua số liệu cho thấy đối chứng tỉ lệ hom rễ tỉ lệ hom sống thấp hầu nhƣ khơng có khả sống nhƣ rễ Các hom đƣợc xử lí chất kích thích nồng độ ln có tỉ lệ hom rễ tỉ lệ hom sống cao Tỉ lệ hom rễ 13,33% tỉ lệ hom sống 6,67% Nhƣ vậy, chất điều hòa sinh trƣởng có vai trò định khả sống khả rễ hom Xoan ta Các chất khác cho tỉ lệ sống tỉ lệ rễ khác Kết thí nghiệm cho thấy, nồng độ 12,5 mg/l, sử dụng chất điều hòa sinh trƣởng NAA cho tỉ lệ hom sống tỉ lệ hom 25 rễ 78,33% 23,33% tƣơng ứng số rễ trung bình hom 2,67 chiều dài rễ trung bình 3,22 cm Vì tỉ lệ hom sống dùng chất điều hòa sinh trƣởng NAA thấp so với việc dùng IBA nên chúng tơi lựa chọn loại chất điều hòa sinh trƣởng IBA nồng độ thích hợp 12,5 mg/l để tiến hành giâm (Hình 3.7) A B Hình 3.7: Xoan ta đƣợc giâm hom nồng độ IBA 12,5 mg/l A: Hom Xoan sau ngày giâm; B: hom Xoan sau 14 ngày giâm 3.2.3 Ảnh hưởng loại giá thể đến kết giâm hom Xoan ta Giá thể có vai trò định trình giâm hom Xoan ta, giá thể với thành phần phù hợp cho tỉ lệ hom sống tốt nhƣ tỉ lệ hom rễ nhiều Vì vậy, việc chọn loại giá thể phù hợp công việc cần thiết quan trọng Giá thể phải đảm bảo thơng thống, dễ nƣớc, giữ đƣợc hom tốt Trong nghiên cứu này, tiến hành thí nghiệm loại giá thể khác nhau: (1) 100% đất tầng màu, (2) 70% đất + 30% trấu, (3) 50% đất tầng màu + 30% trấu + 20% cát sông, (4) 50% đất tầng màu + 50% cát sông, (5) 100% cát sông Hom sử dụng thí nghiệm hom Xoan ta 30 ngày tuổi loại chất điều hòa sinh trƣởng đƣợc sử dụng IBA với nồng độ 12,5 mg/l Sau 30 ngày tiến hành điều tra thu đƣợc kết bảng 26 Bảng 3.10: Ảnh hƣởng loại giá thể đến kết giâm hom Xoan ta Thí nghiệm Loại giá thể Tỉ lệ hom rễ TB (%) Tỉ lệ hom sống TB (%) TB (%)±SD TB (%)±SD Số rễ Chiều dài hom TB rễ TB (cái) (cm) ĐC 0 0 TN1 (1) 13,33 ± 0,09 6,67 ± 0,21 0 TN2 (2) 23,33 ± 0,12 11,67 ± 0,34 2,00 3,00 TN3 (3) 23,33 ± 0,33 6,67 ± 0,12 3,00 3,33 TN4 (4) 53,33 ± 0,45 23,33 ± 0,32 2,67 3,22 TN5 (5) 68,33 ± 0,49 51,67 ± 0,41 3,33 3,36 Kết thí nghiệm cho thấy, loại giá thể khác ảnh hƣởng đến tỉ lệ hom rễ tỉ lệ hom sống khác Giá thể tơi xốp, thông thống tỉ lệ hom sống rễ cao Ở thí nghiệm 5, cơng thức giá thể gồm 100% cát sơng đƣợc làm xử lí qua nấm bệnh công thức cho tỉ lệ hom rễ tỉ lệ hom sống cao đạt 68,33% 51,67% tƣơng ứng số rễ hom trung bình 3,33 cái, chiều dài rễ trung bình 3,36 cm (Hình 3.6) A B Hình 3.6: Giâm Xoan ta giá thể 100% cát sông A: Hom Xoan ta giâm; B: Xoan ta sau ngày giâm hom 27 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã tạo đƣợc mẫu với công thức khử trùng xử lí với Javen 5% thời gian 40 phút chia làm lần (20+20) môi trƣờng nuôi cấy: MS + 30 g/l sucroza + 6,8 g/l aga, pH = 5,8 cho tỉ lệ mẫu đạt 86,67% Đã thiết lập đƣợc công thức tạo mô sẹo gồm: MS + 30 g/l sucroza + 6,8 g/l aga + 1,5 mg/l NAA + mg/l BAP, pH = 5,8 phù hợp với loại vật liệu mầm thân mầm đạt chất lƣợng tốt với tỉ lệ tạo mô sẹo từ mầm 93,33% từ thân mầm 96,67% Đã thiết lập đƣợc cơng thức tái sinh chồi có thành phần: MS + 30 g/l sucroza + 6,8 g/l aga + 0,3 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA + 0,5 mg/l Kinetin, pH = 5,8 với tỉ lệ tạo chồi cao 96,67% Chồi khỏe mạnh, tái sinh tốt, tái sinh tạo hồn chỉnh Đã tạo đƣợc rễ đƣa Xoan ta bầu đất, công thức cho rễ với thành phần: MS + 30 g/l sucroza + 6,8 g/l aga + 0,5 mg/l IBA, pH = 5,8 với tỉ lệ chồi rễ 95,17%, số rễ trung bình/chồi 5,3 rễ Giá thể thích hợp để huấn luyện đất : đất mùn Đã tìm đƣợc tuổi thích hợp chồi lấy hom Xoan ta 30 ngày tuổi Tìm đƣợc loại nồng độ chất điều hòa sinh trƣởng thích hợp đến kết giâm hom Xoan ta IBA 12,5 mg/l Đã lựa chọn đƣợc loại giá thể thích hợp cho giâm hom 100% cát sơng Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu hồn thiện q trình tạo mơ sẹo để tạo vật liệu chuyển gen để tăng hiệu sản xuất thực nghiệm giảm chi phí Xoan ta kỹ thuật nuôi cấy in vitro 28 Hồn thiện q trình nhân giống Xoan ta kĩ thuật ex vitro tạo số lƣợng giống lớn phục vụ cho phát triển Lâm nghiệp tƣơng lai 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu nƣớc: [1] Trần Hữu Biển, Ôn Thị Kim Tú (2018), kết nghiên cứu nhân giống vơ tính hom lồi Giáng hƣơng (Pterocarpus macrocarpus Kurz) Tạp chí KHLN số năm 2018, 43 [2] Lê Văn Bình, Hồ Hữu Nghị, Lê Thị Muội (1993), Công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng, Nxb Nông nghiệp [3] Lê Mộng Chân, Lê Thị Huyền (2000), thực Vật Rừng, Nxb Nông Nghiệp [4] Trƣơng Tất Đơ (2005), ―Nghiên cứu thăm dò số đặc điểm sinh trƣởng khả gây trồng Xoan ta vùng Tây Nguyên‖ [5] Đỗ Xuân Đồng, Bùi Văn Thắng, Hồ Văn Giảng, Nơng Văn Hải, Chu Hồng Hà (2008), ―Nghiên cứu hệ thống tái sinh Xoan Ta thông qua phôi soma từ thân mầm phục vụ chuyển gen‖ Tạp chí Công nghệ Sinh học, (2) : 227-232 [6] Hồ Văn Giảng, Hà Văn Huân, Vũ Kim Dung, Chu Hoàng Hà, Bùi Văn Thắng (2011), ―Tạo giống Xoan ta sinh trƣởng nhanh kĩ thuật chuyển gen‖ Tạp chí Nơng nghiệp PTNT : 11-14 [7] Đoàn Thị Mai (2001), tài liệu chuyển giao kĩ thuật nhân giống sinh dưỡng cho rừng [8] Đoàn Thị Mai, Nguyễn Thị Mỹ Hƣơng, Lƣơng Thị Hoan (2015), ―Nghiên cứu quy trình nhân giống Xoan ta phƣơng pháp giâm hom ghép cành‖, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam [9] Nguyễn Hồng Nghĩa (2003), nhân giống vơ tính trồng rừng dòng vơ tính, Nxb Nơng nghiệp [10] Nguyễn Văn Phong, Nguyễn Thanh Thủy Vân (2016), ―Nghiên cứu hệ thống tái sinh xoan ta in vitro từ chồi xoan trội‖ Tạp chí Nơng nghiệp PTNN số 11/2016 : 58-64 30 [11] Nguyễn Văn Phong (2017), ―Nghiên cứu cảm ứng tạo mô sẹo Xoan ta tam bội làm vật liệu chuyển gen‖ Tạp chí Nơng nghiệp PTNT tháng 6/2017 : 190-195 [12] Đỗ Ngọc Quỹ, Nguyễn Văn Niệm (1980), kĩ thuật giâm chè, Nxb Nông nghiệp Hà Nội [13] Bùi Văn Thắng, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2013), ―Chuyển gen codeA mã hóa choline oxidase vào Xoan ta tăng cƣờng khả chịu hạn‖ Tạp chí khoa học cơng nghệ Lâm Nghiệp số 2-2013 Tài liệu nƣớc ngoài: [14] Husain, M K and M Anis (2009), "Rapid in vitro multiplication of Melia azedarach L.(a multipurpose woody tree)." Acta Physiologiae Plantarum 31(4) : 765-772 [15] Nirsatmanto, A and K Gyokusen (2007), "Genetic Transformation of Melia Azedarach L., Using Agrobacterium Mediated Transformation." Indonesian Journal of Forestry Research 4(1) : 1-8 [16] Van Thanh, N., J Xiangning, H Van Huan, N T Hau and H Van Giang (2010), "Vector construction and transformation of 4CL1 gene into Chinaberrytree (Melia azedarach L.)." VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology 26(3) [17] Vila, S., A Gonzalez, H Rey and L Mroginski (2005), "Plant regeneration, origin, and development of shoot buds from root segments of Melia azedarach L.(Meliaceae) seedlings." In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant 41(6) : 746 [18] Shekhawat NS, Yadav J, Arya V, Singh RP (2000), Micropropagation of Anogeissus latifolia (Roxb Ex DC) Wall Ex Gull & Perr—a tree of fragile ecosystem J Sustain For 11:83–96 31 ... pháp nuôi cấy in vitro ex vitro từ vật liệu khác nhau Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu q trình nhân giống Xoan ta từ mô sẹo phƣơng pháp nuôi cấy in vitro, ex vitro từ nguyên liệu thực vật khác. .. Nội dung nghiên cứu 3.1 Nghiên cứu q trình nhân giống Xoan ta từ mơ sẹo phương pháp nuôi cấy in vitro Khả tạo mẫu Xoan ta Khả tạo phôi soma từ vật liệu Xoan ta Khả tái sinh chồi từ vật liệu phôi... HÀ NỘI KHOA SINH – KTNN ==  == NGUYỄN THỊ KIM ANH NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH NHÂN GIỐNG XOAN TA (MELIA AZEDARACH L.) BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN VITRO VÀ EX VITRO TỪ VẬT LIỆU KHÁC NHAU KHÓA LUẬN