Luận văn sư phạm Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây xoan ta ( Melia Azedarach L,) phục vụ chuyển Gen

Trờng ĐHSP H Nội Khoá luận tốt nghiệp Mở đầu Lý chọn đề tài Xoan ta (Melia azedarach L.) thân gỗ, sớm rụng lá, thuộc hä xoan (Meliaceae), cã ngn gèc ë Ên ®é, miỊn nam Trung Quốc Australia Xoan ta đợc phân bố nhiều nớc nh Việt Nam, Lào, Campuchia Riêng Việt Nam từ Bắc vào Nam hầu nh tỉnh còng thÊy sù hiƯn diƯn cđa c©y xoan ta, chóng mọc tự nhiên đợc trồng thành rừng [18] Xoan ta trồng quan trọng chiến lợc phát triển lâm nghiệp, đợc trồng số vùng sinh thái lâm nghiệp, có vùng: vùng Đồng sông hồng, vùng Trung du, vùng Tây bắc, vùng Nam trung bộ, vùng Tây nguyên, vùng Đông nam [18] Xoan ta đứng đầu danh mục trồng đợc u tiên phát triển theo định số 16/2005/ QĐBNN ngày 15/03/2005 trởng Nông nghiệp Phát triển Nông thôn [26] Xoan ta loài gỗ lớn cao đến 30m, đờng kính gần 100cm Gỗ xoan có lõi màu hồng hay nâu nhạt, dác xám trắng, gỗ nhẹ, vân thớ đẹp, đợc ngâm tẩm loại gỗ bền khó bị mối mọt, gỗ xoan thờng đợc dùng để xây dựng, trang trí nội thất, điêu khắc [18] Vì loài mang nhiều giá trị kinh tế nên xoan khuyến khích trồng ngày mở rộng diện tích Để đáp ứng nhu cầu sản xuất cần đa giống có đặc điểm nh kháng bệnh, chống chịu điều kiện bất lợi môi trờng, có chất lợng gỗ tốt, sinh trởng phát triển nhanh Công nghệ chuyển gen dần trở thành nhân tố mang tính chìa khoá để giải vấn đề Tuy nhiên, để thực đợc việc chuyển gen phải có hệ thống tái sinh hoàn chỉnh Với mục đích tạo xoan ta có chất lợng gỗ tốt, khả sinh trởng, phát triển nhanh nhờ chuyển gen trớc tiên cần phải thiết lập đợc hệ thống tái sinh xoan ta invitro đạt hiệu suất cao Vì tiến hành đề tài: Nghiên cứu hệ thống tái sinh xoan ta (Melia azedarach L.) phơc vơ chun gen” Mục đích nghiên cứu DiệpThị Lan Lớp K31A Trờng ĐHSP H Nội Khoá luận tốt nghiệp Tạo hệ thống tái sinh xoan ta invitro hoàn chỉnh phục vụ chuyển gen cách tạo đa chồi từ thân mầm, mầm Nội dung nghiên cứu Chuẩn bị môi trờng nuôi cấy khác để đánh giá: Khả cảm ứng tạo cụm chồi từ mầm Khả cảm ứng tạo cụm chồi từ thân mầm Khả kích thích kéo dài chồi Khả tạo rễ Sau tìm môi trờng thích hợp cho tái sinh ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Đây hớng nghiên cứu ứng dụng công nghệ gen vào cải tiến giống xoan ta Việc xây dựng hệ thống tái sinh xoan ta hoàn chỉnh bớc đột phá quan trọng quy trình chọn tạo giống cung cấp cho đơn vị trồng rừng, nhằm phát triển rừng nguyên liệu có suất cao phẩm chất gỗ tốt Nội dung DiệpThị Lan Lớp K31A Trờng ĐHSP H Nội Khoá luận tốt nghiệp Chơng Tổng quan tài liệu 1.1 Các đặc điểm tự nhiên xoan ta Là thân gỗ phân bố nhiều nớc giới nh− ViƯt Nam, Trung Qc, Lµo ë ViƯt Nam chúng mọc tự nhiên đợc trồng thành rừng [19] Xoan ta loại thờng rụng vào mùa đông, thân thẳng, tán tha, vỏ màu nâu xám Hoa nhỏ, đều, lỡng tính, có mùi thơm hắc với cánh hoa có màu tím nhạt tím hoa cà, mọc thành cụm (hình 1) Hình 1: ảnh cành xoan mang hoa nở [23] Quả hạch có màu vàng nhạt chín, treo suốt mùa đông có nhân màu trắng (hình 2) [21] DiệpThị Lan Lớp K31A Trờng ĐHSP H Nội Khoá luận tốt nghiệp Hình 2: ảnh cành xoan mang [23] Lá dài đến 50 cm mọc so le, cuống với lần phức mọc đối, chét mép có ca [21] Hệ rễ ngang phát triển, thờng ăn nông lan rộng, rễ cọc ăn sâu Xoan thờng phân cành sớm, khả đâm chồi nhanh nên lợi dụng tái sinh chồi đợc [23] ` Xoan nguyên sản vùng nhiệt đới nhiệt đới châu Xoan −a s¸ng, sinh tr−ëng nhanh, sau trång tõ 6-8 năm thu hoạch đợc Xoan a khí hậu nóng ẩm có mùa: mùa ma mùa khô, lợng ma hàng năm từ 1000 mm trở lên, vùng chịu đợc hạn với lợng ma hàng năm 500 mm [23] Xoan sinh trởng nhiều loại đất khác nhng thích hợp đất pha cát, đất phù sa ven sông có độ phì cao sâu ẩm Xoan chịu đợc muối, lợng muối đất từ 0,4-0,5%, đất chua có độ PH 5-6, kiềm Những nơi đất bạc màu, khô hạn úng nớc không thích hợp với xoan [23] Xoan có khả tái sinh (mọc lại từ gốc cũ thu hoạch) từ 3-4 lần [18] DiệpThị Lan Lớp K31A Trờng ĐHSP H Nội Khoá luận tốt nghiệp Cây trồng - năm bắt đầu cho Chọn mẹ từ 10 - 20 tuổi mọc từ hạt, có thân thẳng, phân cành cao, tán đều, cành ngang, không sâu bệnh để thu hái hạt làm giống [23] Khi gieo ngâm hạt nớc ấm khoảng 450C 8h Nhiệt độ thích hợp cho nảy mầm 16-220C, lợng ma trung bình từ 1700-2000 mm [19], [20] Xoan thờng phân cành sớm, để thúc đẩy sinh trởng, phát triển nhanh đờng kính, chiều cao tạo đoạn thân sử dụng dài, cần tiến hành chăm sóc nh: làm cỏ, xới đất, vun gốc kết hợp với bón phân đầy đủ cho đồng thời thực tỉa cành nhân tạo từ 1,5 - tuổi Sau tuổi không nên tỉa tha lúc cành lớn việc tỉa tha dễ làm bị rỗng ruột [23] Xoan đâm chồi mạnh, chồi thân chồi rễ tạo chồi sau khai thác Kinh nghiệm nhân dân cho biết gỗ mọc từ chồi thờng thẳng, mọc từ hạt mọc từ chồi rễ [23] 1.2 ý nghĩa kinh tế xoan Gỗ xoan thuộc nhóm gỗ V, có lõi màu hồng hay nâu nhạt, dác xám trắng, gỗ nhẹ mềm tỉ trọng 0,565, lực kéo ngang thớ 22kg/cm2, nén dọc thớ 339kg/cm2 [18] Gỗ xoan nhẹ nhng bền bị mối mọt, mềm dễ bào nhẵn, ca xẻ trạm trổ, nhng có nhợc điểm dễ nứt Nếu đợc ngâm nớc từ - tháng trở nên bền khó bị mối mọt gỗ xoan thờng đợc dùng xây dựng nhà cửa, đóng đồ gia dụng, trang trí nội thất dùng điêu khắc [23] Than củi xoan cung cấp lợng nhiệt lớn Ngoài lá, rễ xoan dùng làm phân xanh, thuốc sát trùng, hạt ép dầu chữa số bệnh, trồng xoan để che bóng phòng hộ [18] Với đặc điểm sinh hoá nh nh có giá trị nhiều mặt nên xoan loài trồng lâm nghiệp có nhiều tiềm phát triển réng r·i 1.3 T×nh h×nh trång xoan ë n−íc ta Theo định Bộ nông nghiệp phát triển nông thôn Việt Nam số 16/2005/QĐ- BNN ngày 15/03/2005 DiệpThị Lan Lớp K31A Trờng ĐHSP H Nội Khoá luận tốt nghiệp Danh mục loài chủ yếu cho trồng rừng sản xuất theo vùng sinh thái lâm nghiệp.Trong vùng trồng xoan nh: vùng Tây bắc gồm tỉnh Lai Châu, Điện Biên, Sơn La, Hòa Bình; vùng Trung du (TD) gồm tỉnh: Lo Cai, Yên Bái, H Giang, Tuyên Quang, Phú Thọ, Vĩnh Phúc; vùng đồng sông Hông (ĐBSH) gồm 10 tỉnh: Hải Phòng, Hải Dơng, Bắc Ninh, Hng Yên, Hà Nội, Hà Tây, Thái Bình, Nam Định, Hà Nam, Ninh Bình; vïng B¾c Trung Bé (BTB) gåm tØnh: Thanh Hãa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên HuÕ; vïng Nam Trung Bé (NTB) gåm tØnh: Qu¶ng Nam, Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận; vùng Tây Nguyên (TN) gồm tỉnh: Lâm Đồng, Đắk Nông, Đắc Lắc, Gia Lai, Kon Tum; vùng Đông Nam Bộ gồm tỉnh: Bà Rịa - Vũng Tàu, Đồng Nai, Bình Dơng, Bình Phớc, Tây Ninh, Tp Hå ChÝ Minh; vïng T©y Nam Bé (TNB) gåm 12 tỉnh: Long An, Bến Tre, Đồng Tháp, Sóc Trăng, Vĩnh Long, Cần Thơ,Tiền Giang, Bạc Liêu, Cà Mau, Kiên Giang, An Giang, Trà Vinh [26] 1.4 Các phơng pháp kü tht øng dơng c¶i tiÕn di trun gièng xoan 1.4.1 Các kỹ thuật truyền thống Phơng pháp truyền thống nh gieo hạt, hom rễ nhng khả cung cấp với số lợng lớn, mùa vụ trồng gặp nhiều khó khăn Mặt khác phơng pháp nhân giống hạt có nhiều nhợc điểm nh: Thời gian bảo quản ngắn khoảng - tháng Cây sinh trởng phát triển không đồng có phân li di truyền Khả kháng sâu bệnh thấp [18] 1.4.2 Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật Ta thấy xoan có nhiều tiềm phát triển rộng khắp tỉnh Khi diện tích trồng xoan tăng đồng nghĩa với việc tăng nguồn giống Để khắc phục nhợc điểm nhân giống hạt hom rễ nên thời gian qua trung tâm ứng dụng tiến khoa học công nghệ ứng dụng thành công kỹ thuật nhân giống vô tính xoan phơng pháp nuôi cấy mô tế bào nhằm giải khó khăn [18] DiệpThị Lan Lớp K31A Trờng ĐHSP H Nội Khoá luận tốt nghiệp Tính u việt xoan cấy mô là: đảm bảo đặc tính di truyền, thoái hoá, có khả sinh trởng phát triển nhanh, có độ đồng cao, đảm bảo lợng lớn trồng thời vụ [18] Có thể nói bớc đột phá quan trọng nhằm giải khó khăn nhiều mặt, đồng thời sản xuất cung ứng giống cho đơn vị trồng rừng kỹ thuật, phát triển rừng nguyên liệu, đảm bảo chất lợng, nâng cao suất trồng [18] 1.5 Cơ sở kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.5.1 Tính toàn tế bào Nuôi cấy mô tế bào thực vật phạm trù khái niệm chung cho tất loại nuôi cấy nguyên liệu (tế bào, mô, phôi ) thực vật hoàn toàn vi sinh vật môi trờng dinh dỡng nhân tạo ®iỊu kiƯn v« trïng [1] C«ng nghƯ nu«i cÊy m« tế bào thực vật công nghệ quan trọng công nghệ sinh học, tảng để nghiên cứu ứng dụng công nghệ khác lÜnh vùc c«ng nghƯ sinh häc thùc vËt [1] Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật đợc tiến hành nớc ta từ năm 1960 miền Nam năm 1970 miền Bắc Tuy nhiên từ cuối năm 1980 trở lại công nghệ mô tế bào phát triển mạnh mẽ nhanh chóng, nhiều phòng thí nghiệm, nghiên cứu đợc xây dựng triển khai hầu khắp tỉnh thành nớc [ 22] Cơ sở nuôi cấy mô tế bào thực vật tính toàn tế bào, điều lần đợc haberlandt (1902) đề cập, ông cho rằng: tế bào thể đa bào tiềm tàng khả phát triển thành cá thể hoàn chỉnh Theo quan điểm sinh học đại tế bào riêng rẽ phân hoá mang toàn thông tin di truyền toàn thể Trong điều kiện thích hợp, tế bào phát triển thành thể hoàn chỉnh, tính toàn tế bào Tính toàn sở phơng pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật, sở ngời ta tạo đợc thể thực vật hoàn chỉnh từ tế bào riêng rẽ [1] Hiện nay, ngời ta thực đợc khả tạo đợc thể thực vật hoàn chỉnh từ tế bào riêng rẽ [1] DiệpThị Lan Lớp K31A Trờng ĐHSP H Nội Khoá luận tốt nghiệp 1.5.2 Sự phân hoá phản phân hóa tế bào Cơ thể thực vËt tr−ëng thµnh lµ mét tỉng thĨ thèng nhÊt bao gồm nhiều quan khác nhau, có chức khác đợc hình thành từ nhiều loại tế bào khác Tuy nhiên, tất loại tế bào bắt nguồn từ tế bào hợp tử ban đầu Tế bào hợp tử lúc đầu phân chia thành khối tế bào cha chuyên hóa Các tế bào cha chuyên hóa tiếp tục phân chia thành tế bào chuyên hoá đặc trng cho mô, quan có chức khác Đó tợng phân hoá tế bào Tuy nhiên, tế bào chuyên hóa thành tế bào chuyên biệt lại không hoàn toàn biến đổi Trong điều kiện thích hợp định chúng trở thành dạng tế bào nh tế bào ban đầu, nghĩa dạng tế bào cha chuyên hoá Hiện tợng gọi tợng phản phân hóa tế bào [1] Sự phân hoá phản phân hóa tế bào trình hoạt hóa, ức chế hoạt động gen Trong giai đoạn phát triển định cây, số gen trạng thái ức chế không hoạt động đợc hoạt hóa tính trạng biểu Ngợc lại số gen lại bị ức chế đình hoạt động Quá trình hoạt hóa, ức chế diễn theo chơng trình đợc lập sẵn cấu trúc gen tế bào, giúp cho sinh trởng, phát triển thể tế bào thực vật đợc hài hòa Sự hoạt động hài hoà tế bào mô quan phụ thuộc vào tế bào nằm khối mô, quan thể Khi tách riêng tế bào, làm giảm kích thớc khối mô tạo điều kiện cho việc hoạt hóa gen tế bào [1] Kĩ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực chất điều khiển phát triển phát sinh hình thái tế bào thực vật cách có định hớng dựa vào phân hóa phản phân hóa tế bào thực vật Để điều khiển phát sinh hình thái tế bào, ngời ta bổ sung vào môi trờng nuôi cấy hai nhóm điều hoà sinh tr−ëng thùc vËt lµ auxin vµ cytokinin Tû lƯ hàm lợng nhóm chất điều hoà sinh trởng môi trờng nuôi cấy mô khác định hớng cho phát sinh hình thái (phát sinh chồi, rễ mô sẹo) mô nuôi cấy khác Trong môi trờng nuôi cấy, tỷ lệ nồng độ auxin/cytokinin (đại diện IAA/KIN) thấp nuôi cấy phát sinh theo hớng tạo chồi, tỷ lệ cao mô nuôi cấy DiệpThị Lan Lớp K31A Trờng ĐHSP H Nội Khoá luận tốt nghiệp tạo mô sẹo Mô sẹo dạng tế bào cha phân hoá phân chia liên tục có khả hình thành phôi, chồi hoàn chỉnh [1] 1.6 Nuôi cấy mô xoan 1.6.1 Lợc sử nuôi cấy mô xoan Nuôi cấy mô tế bào thực vật đợc tiến hành nhiều đối loại nh: lạc, đậu tơng, cà chua, hoa loa kèn, xoan đạt đợc kết định để phục vụ cho nhiỊu mơc ®Ých cđa ng−êi vÝ dơ nh− phục vụ cho chuyển gen, nhân giống để bảo tồn giống quý [3], [4], [5], [7], [8] Nông Văn Hải, Lê Xuân Đắc, Hà Hồng Hải, Đào Thị Thu Hà, Nguyễn Thanh Danh, Lê Thị Xuân, Lê Trần Bình xây dựng đợc thành công quy trình nhân nhanh invitro Màng tang để bảo tồn giống quý [4] Nguyễn Thị Phơng Thảo, Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Thị Mai nghiên cứu nhân nhanh giống hoa loa kèn kỹ thuật nuôi cấy invitro nhằm tạo nhiều giống cung ứng cho nhà sản xuất [8] Đối với đối tợng đậu tơng Nguyễn Thị Nh, Đỗ Tiến Phát, Lê Thị Muội, Đinh Thị Phòng nghiên cứu đợc hệ thống tái sinh qua phôi soma giống ĐT12 Hiệu suất tái sinh đạt 39% số phôi trung bình 7,5 Đây bớc đầu để nghiên cứu việc chuyển gen nhằm nâng cao suất chất lợng sản phẩm từ đậu tơng[5] Ngoài ngời ta nghiên cứu quy trình tái sinh lạc, cà chua phục vụ chuyển gen [3], [7] Xoan đối tợng lâm nghiệp quan trọng đợc nghiên cứu nhiều Cho đến có nhiều công trình nhiều nhà khoa học nghiên cứu tái sinh xoan phơc vơ chun gen nh−: Ahmad vµ céng sù 1990, Thakur vµ céng sù 1998, Vila vµ céng sù 2003-2005, Sharry cộng 2006 [10], [13], [15], [16] Năm 1998 Thakur cộng nghiên cứu tạo cụm chồi từ mầm đạt tỉ lệ tạo đa chồi 74% 7-9 tuần nuôi cấy [15] Năm 2005 Vila cộng nghiên cứu tái sinh chồi từ rễ xoan ta víi viƯc sư dơng 0,44 μM BAP cho tØ lƯ tạo cụm chồi 66,8% chất điều hoà sinh trởng tỉ lệ tạo cụm chồi 40,3% [16] DiệpThị Lan Lớp K31A Trờng ĐHSP H Nội Khoá luận tốt nghiệp Năm 2006 Sharry Teixeira dasilva sử dụng BAP kết hợp với NAA việc cảm ứng tạo chồi tạo đợc 160-200 chồi/g mẫu cấy [16] Việt Nam, theo báo cáo năm 2007 Hồ Văn Giảng trờng Đại học Lâm nghiệp tuyển chọn đợc 15 trội có sản lợng gỗ cao lấy mẫu nuôi cấy mô Đang xác định tiêu chất lợng có liên quan đến sản lợng chất lợng gỗ Đã tạo đợc mẫu invitro xoan ta, bớc đầu xác định đợc loại vật liệu nuôi cấy tạo phôi soma cụm chồi, tái sinh đợc phôi soma cụm chồi Hiện tiến hành nghiên cứu tiếp để hoàn thiện quy trình kĩ thuật tái sinh xoan ta thông qua phôi soma đa chồi [25] Năm 2007 theo báo cáo Đoàn Thị Mai Viện khoa học Lâm nghiệp Việt Nam tiến hành thí nghiệm nhân giống sinh dỡng nuôi cấy mô cho 36 dòng, bớc đầu tìm đợc môi trờng thích hợp cho dòng, hệ số nhân chồi đạt từ 5,5 9,2 chồi/ cơm chåi [24] Nghiªn cøu rƠ chåi xoan ta Sharry vµ Teixeira dasilva (2006), sư dơng IBA ë nång ®é thÊp 0,049μM tØ lƯ chåi rƠ chØ ®¹t 17% nh−ng sư dơng NAA ë nång ®é thÊp 0,054M tỉ lệ rễ thu đợc 100% sau tuần nuôi cấy [13] 1.6.2 ảnh hởng thành phần môi trờng đến nuôi cấy mô xoan Thành phần vô bao gồm muối khoáng (cả đa lợng vi lợng) đợc đa vào môi trờng nuôi cấy Nhu cầu muối khoáng tế bào mô thực vật tách rời không khác nhiều so với yêu cầu đợc trồng điều kiện tự nhiên Trong thành phần muối khoáng đa lợng nguyên tố phải cung cấp nitơ, kali, photpho[2] Nitơ vô đợc đa vào môi trờng dạng nitrat (NO3-) amon ( NH4+ ) Đa số môi trờng có chứa dạng nitrat nhiều amon Theo Narayanas Wamy (1994) hàm lợng nitrat nhiều môi trờng khoảng 25M amon từ - 20 M [2] Trong môi trờng MS amon đợc cung cấp dạng muối NH4NO3,, môi trờng B5 Gramborg có amon dạng muối (NH4)2SO4 - gốc nitrat đợc đa vào môi trờng dới dạng muối nitrat canxi, nitrat kali nitrat amon Khi môi trờng chứa nitơ dạng dễ gây kiềm hoá môi trờng DiệpThị Lan 10 Lớp K31A Trờng ĐHSP H Nội Khoá luận tốt nghiệp Bảng 1: Thành phần môi trờng MS (theo Murashige Skoog) STT Thành phần Nồng ®é Muèi kho¸ng NH4N03 1650 mg/lit KN03 1900 mg/lit CaCl2.2H20 440 mg/lit MgS04.7H20 370 mg/lit KH2P04 170 mg/lit H3B03 6,2 mg/lit MnS04.4H20 22,3 mg/lit ZnS04.7H20 8,6 mg/lit KI 0.83 mg/lit 10 Na2Mo04.2H20 0,25 mg/lit 11 CuS04.5H20 0,025 mg/lit 12 CoCl2.6H20 0,025 mg/lit 13 Na2EDTA 37,3 mg/lit 14 FeS04.7H20 27,8 mg/lit C¸c chất hữu vitamin 15 Myo - Inositol 100 mg/lit 16 Nicotinic acid 0,5 mg/lit 17 Vitamin B1 0,5 mg/lit 18 Vitamin B6 0,1 mg/lit 19 Glycine 2,0 mg/lit 20 sucrose 30 g/lit 21 Agar g/lit pH 5,6 B B DiệpThị Lan 16 Lớp K31A Trờng ĐHSP H Nội Khoá luận tốt nghiệp 2.2 Phơng pháp nghiên cứu Khử trùng môi trờng dụng cụ nuôi cấy nhiệt độ 1210C, áp suất 1,5 atm 15 phút Nuôi cấy điều kiện nhiệt độ 25 20C cờng độ ánh sáng 3000 lux với thời gian chiếu sáng 16h/ngày Tái sinh cụm chồi nuôi cấy mô tế bào thực vật gồm bớc theo sơ đồ [27] Cây giống vờn giống đầu dòng Khử trùng Môi trờng MS Chồi ống nghiệm Cấy chuyển Môi trờng nhân chồi Cụm chồi Môi trờng nhân chồi Môi trờng vơn thân Cây chuẩn bị rễ Môi trờng rễ Cây hoàn chỉnh Ươm vờn ơm Nhà huấn luyện DiệpThị Lan 17 Lớp K31A Trờng ĐHSP H Nội Khoá luận tốt nghiệp Chúng tiến hành tái sinh cụm chồi từ mầm, thân mầm theo bớc nh sau: Vô trùng mẫu Tạo cụm chồi Kéo dài chồi Kéo dài rễ hoàn thiện invitro Đa nhà lới 2.2.1 Khử trùng mẫu chuẩn bị nguyên liệu tạo chồi Hạt đợc sát khuẩn bề mỈt b»ng ethanol Khư trïng b»ng javen 60% 30 phút (lắc mạnh) Loại bỏ javen rửa nớc cất vô trùng lần Hạt sau khử trùng đợc nuôi cấy môi trờng dinh dỡng MS bổ sung thêm sucrose với mật độ 15 hạt/bình tam giác 250 ml 2.2.2 Cảm ứng tạo cụm chồi Sau tuần nuôi cấy hạt nảy mầm, phân mầm đợc cắt bỏ viền cắt đôi, phần thân mầm cắt thành đoạn nhỏ có kích thớc -5 mm cấy lên môi trờng MS bổ sung thêm vitamin B5 (Gamborg cộng 1968) vµ 3% sucrose + 0,44 - 13,32 μM, 6BAP+ + 0,46 M KIN nuôi cấy tuần 2.2.3 Kích thích kéo dài chồi Các chồi đợc tái sinh từ cụm chồi cấy chuyển sang môi trờng kích thích kéo dài chồi MS bổ sung thêm vitamin B5 + 3% sucrose + 0,44 - 2,22 μM BAP + 0,3 M GA3 nuôi cấy tuần 2.2.4 Khả tạo rễ hoàn thiện invitro Các chồi đạt chiều dài 20 30 mm đợc cấy lên môi trờng tiền cảm ứng tạo rễ MS bổ sung thêm 2% sucrose + 12,30 mM IAB nuôi cấy ngày sau cấy sang môi trờng MS có bổ sung thêm 1% sucrose, không bổ sung chất điều hoà sinh trởng Nuôi tiếp tuần để kéo dài rễ 2.2.5 Đa nhà lới Cây mô hoàn chỉnh đợc đa nhà lới, trồng giá thể trấu hun 100%, trÊu hun pha c¸t tØ lƯ 1:1, c¸t 100% vòng tuần đầu ánh sáng trực xạ Tất môi trờng nuôi cấy đợc chuẩn độ pH = 5,8 bổ sung thêm agar DiệpThị Lan 18 Lớp K31A Trờng ĐHSP H Nội Khoá luận tốt nghiệp 2.2.5 Phơng pháp xử lí số liệu thực nghiệm Số liệu đợc xử lí đánh giá theo phơng pháp toán thống kê máy tính nhờ phần mềm Excel - 2003 với thông số trung bình số học, độ lƯch chn, hƯ sè biÕn ®éng, sai sè cđa trung bình số học, sai số hiệu trung bình số học, tiêu chuẩn độ tin hiệu Trung bình sè häc: = X n n ∑ X (X − i= i δ y δ x δ = C V = m m d td = δ = X ) n − * 0 X δ n = m d m + m 2 d DiƯpThÞ Lan 19 Líp K31A Tr−êng ĐHSP H Nội Khoá luận tốt nghiệp Chơng 3: Kết thảo luận 3.1 Khả cảm ứng cụm chồi từ mầm Nghiên cứu ảnh hởng chất điều hoà sinh trởng BAP KIN, NAA lên khả cảm ứng tạo cụm chồi từ mầm xoan ta, kết thu đợc ghi bảng nh sau: Bảng 2: ảnh hởng chất điều hoà sinh trởng đến khả cảm ứng tạo cụm chồi từ mảnh mầm sau tuần nuôi cấy Phần trăm BAP KIN NAA Mảnh (M) (M) (μM) cÊy t¹o chåi - - - 0/92 0 0,44 - - 0/97 0 2,22 - - 5/89 5,6 1,5 ± 0,2 4,44 - - 81/90 90,0 6,8 ± 0,1 6,66 - - 86/90 91,5 6,2 ± 0,4 90/96 93,8 5,8 ± 0,3 8,88 m¶nh cÊy C håi/m¶nh cÊy t¹o chåi 11,10 - - 72/85 84,7 5,5 ± 0,2 13,32 - - 61/76 80,3 5,0 ± 0,1 2,22 0,46 - 7/97 7,2 1,7 ± 0,3 4,44 0,46 - 84/86 97,7 7,0 ± 0,8 6,66 0,46 - 95/97 98,0 7,3 ± 0,8 8,88 0,46 - 85/92 92,4 6,0 ± 0,9 4,44 - 2,68 9/71 12,7 1,2 ± 0,0 6,66 - 2,68 9/74 12,2 1,0 ± 0,0 8,88 - 2,68 31/92 37,0 2,5 ± 0,5 11,10 - 2,68 26/97 26,8 2,2 0,2 Ghi chú: (-) chất điều hoà sinh trởng DiệpThị Lan 20 Lớp K31A Trờng ĐHSP H Nội Khoá luận tốt nghiệp công thức môi trờng chất điều hoà sinh trởng có chất điều hòa sinh trởng BAP nồng độ thấp 0,44M mảnh mầm sau tuần nuôi cấy dới điều kiện chiếu sáng khả cảm ứng tạo cụm chồi Trong nghiên cứu tái sinh chồi từ rễ xoan ta cần sử dụng 0,44M BAP cho tỉ lệ tạo cụm chồi 40,3% (Vila cộng 2005).Khi sử dụng riêng BAP với nồng độ thấp 2,22M tỉ lệ cảm ứng tạo cụm chồi thấp đạt 5,6% số chồi trung bình 1,5 chồi/mảnh cấy Tuy nhiên sử dụng riêng BAP nồng độ từ 4,44 - 13,32M khả cảm ứng cụm chồi diễn mạnh, sau tuần nuôi cấy, quan sát cho thấy hầu hết mảnh mầm cảm ứng tạo mô sẹo tạo chồi vết cắt (hình 3) sau tuần nuôi cấy tỉ lệ cảm ứng tạo cụm chồi đạt 93,8%, số chồi trung bình 5,8 chồi/mảnh cấy nồng độ 8,88M BAP (hình 4) nồng độ 4,44M BAP tỉ lệ mảnh cấy cảm ứng tạo cụm chồi 90% nhng số chồi trung bình thu đợc mảnh cấy 6,8 chồi/mảnh cấy Từ kết thu đợc cho thấy BAP ảnh hởng mạnh mẽ đến khả tạo chồi Theo nghiên cøu cđa Joarder vµ céng sù (1993) BAP lµ chÊt ®iỊu hoµ sinh tr−ëng thc nhãm cytokinin rÊt tèt cho phát sinh chồi neem (Azadirachda indica Juss.meliaceae) [17] BAP tốt cytokinin khác cảm ứng phát sinh chồi gỗ (Zamam 1991, Thakur céng sù 1988) [15] BAP ë nång ®é 4,44μM còng kích thích cảm ứng tạo phôi soma xoan ta đạt tû lƯ cao nhÊt (Sharry vµ céng sù 2006) [13], [14] Nhiều nghiên cứu ảnh hởng kết hợp BAP nồng độ cao KIN nồng độ thấp kÕt qu¶ còng cho thÊy, tØ lƯ c¶m øng cơm chồi tăng lên số chồi cụm tăng Khi sử dụng kết hợp BAP nồng độ thấp 2,22μM BAP + 0,46 μM KIN tØ lƯ c¶m øng tạo cụm chồi thấp đạt 7,2% số chồi trung bình thấp 1,7 chồi/mảnh cấy Nhng tăng nồng ®é BAP lªn tõ 4,44 μM - 8,88 μM kÕt hợp với 0,46M KIN tỉ lệ cảm ứng tạo cụm chồi tăng khoảng từ 92,4% - 98% số chồi trung bình cao khoảng 6,0 - 7,3 chồi/mảnh cấy.Chiều cao DiệpThị Lan 21 Lớp K31A Trờng §HSP Hμ Néi Kho¸ ln tèt nghiƯp Khi sư dụng kết hợp BAP NAA việc cảm ứng tạo cụm chồi từ mầm tỉ lệ cảm ứng tạo cụm chồi thấp, số chồi/mảnh cấy thấp cụ thể: công thức kết hợp 4,44M BAP + 2,68M NAA tỉ lệ cảm ứng tạo cụm chồi thấp đạt 12,7%, số chồi trung bình đạt 1,2 chồi/mảnh cấy Và tăng nồng độ BAP lên 6,66M tỉ lệ cảm ứng cụm tạo chồi đạt 12,2%, số chồi trung bình 1,0 chồi/mảnh cấy Nồng độ 8,88M BAP 2,68M NAA cho tỉ lệ cảm ứng tạo cụm chồi 37% số chồi trung bình 2,5 chồi/mảnh cấy Và tăng nồng độ BAP lên nồng độ 11,10M kết hợp với 2,68M NAA tỉ lệ cảm ứng tạo cụm chồi lại giảm (26,8%), số chồi trung bình đạt 2,2 chồi/mảnh cấy Nhìn chung công thức bổ sung thêm NAA tỷ lệ phần trăm cảm ứng tạo cụm chồi giảm đáng kể, số chồi mảnh thấp chủ yếu chồi đơn Môi trờng thích hợp cho việc tái sinh cụm chồi từ mảnh mầm môi trờng MS bổ sung thêm vitamin B5 + BAP nồng độ từ 4,44 - 8,88M + 0,46M KIN + 3% sucrose đợc khuyến cáo sử dụng công tác biến nạp tái sinh chuyển gen 3.2 Khả cảm ứng tạo cụm chồi từ thân mầm Các đoạn thân mầm đợc cắt thành đoạn nhỏ với chiều dài - mm đặt lên môi trờng tái sinh chồi với chất điều hoà sinh trởng khác nồng độ khác Sau tuần nuôi cấy thu thập xử lý số liệu kết thu đợc ghi bảng Khác với mầm, thân mầm xoan ta tái sinh Sau tuần đầu nuôi cấy đa số đoạn thân mầm bị cảm ứng tạo mô sẹo hoá mạnh có số mô sẹo chuyển từ màu trắng sang màu nâu khả tái sinh chồi Đối với thân mầm nuôi cấy môi trờng chất điều hoà sinh trởng có khả t¸i sinh chåi víi tØ lƯ 4,3% Khi sư dơng đơn lẻ BAP cho việc tái sinh chồi từ thân mầm kết nồng độ 0,44M tỉ lệ cảm ứng tạo cụm chồi đạt 26,6% cao so với nồng độ khác Trong nồng độ 0,44M BAP tỉ lệ tái sinh chồi từ mầm 0% DiệpThị Lan 22 Lớp K31A Trờng ĐHSP H Nội Khoá luận tốt nghiệp Sử dụng tổ hợp BAP + KIN BAP + NAA việc tái sinh chồi từ đoạn thân mầm Kết thu đợc cho thấy tỉ lệ mảnh cấy tạo chồi cao (30,1%) công thức 8,88 M BAP + 2,68 μ M NAA tû lƯ nµy thấp nhiều so với tái sinh từ mầm (98%), số chồi/mảnh cấy thấp nhiều so với việc cảm ứng từ mầm, việc tái sinh cụm chồi từ thân mầm số chồi/mảnh cấy kho¶ng 1,2 - 2,8 chåi/m¶nh cÊy B¶ng 3: ¶nh hởng cuả chất điều hoà sinh trởng đến khả cảm ứng chồi từ thân mầm sau tuần nuôi cấy BAP KIN NAA Mảnh cấy tạo Phần trăm chåi/m¶nh ( μ M) ( μ M) ( μM) chåi mảnh cấy cấy tạo chồi - - - 4/94 4,3 1,0 ± 0,0 0,44 - - 25/94 26,6 1,8 ± 0,2 2,22 - - 12/92 13,0 1,5 ± 0,4 4,44 - - 10/97 10,0 2,5 ± 06 6,66 - - 6/95 6,3 2,1 ± 0,5 8,88 - - 5/85 5,9 2,4 ±0,3 2,22 0,46 - 18/96 18,8 2,6 ± 0,7 4,44 0,46 - 12/84 14,3 2,0 ±0,8 6,66 0,46 - 8/90 8,9 1,5 ± 0,2 8,88 0,46 - 7/72 9,7 2,5 ± 0,6 2,22 - 2,68 5/80 6,3 2,2 ±0,0 4,44 - 2,68 11/92 12,0 2,1 ± 0,5 6,66 - 2,68 15/95 15,8 2,6 ± 0,7 8,88 - 2,68 28/93 30,1 2,8 ± 0,5 Ghi chó: (-) kh«ng cã chÊt điều hoà sinh trởng DiệpThị Lan 23 Lớp K31A Trờng §HSP Hμ Néi Kho¸ ln tèt nghiƯp 3.3 KÝch thích kéo dài chồi Các chồi đạt chiều cao mm đợc tách từ cụm chồi cấy chuyển sang môi trờng kích thích kéo dài chồi MS bỉ sung thªm Vitamin B5 + 3% sacrose + 0,44 - 2,22M BAP + 0,3M GA3 Sau tuần nuôi cấy thống kê số liệu thu đợc trình bày bảng Bảng 4: ảnh hởng chất điều hoà sinh trởng đến khả kéo dài chồi sau tuần nuôi cấy BAP (M) GA3 (M) phần trăm chồi kÐo dµi ChiỊu cao chåi (mm) - - 62 15,2 ± 1,8 0,44 - 90 20,5 ± 4,2 0,88 - 92 25,2 ± 2,7 2,22 - 52 10,6 ± 0,5 0,44 0,03 95 22,4 ± 3,0 0,88 0,03 97 28,7 ± 2,9 2,22 0,03 54 16,3 ± 2,5 Ghi chó: (-) chất điều hoà sinh trởng Chồi sử dụng 100 công thức thí nghiệm số liệu cho thấy chất điều hoà sinh trởng tỉ lệ chồi kéo dài thấp đạt 62% chiỊu cao trung b×nh cđa chåi còng thÊp 15,2 mm Khi sử dụng riêng BAP nồng độ 0,44 0,88M tỉ lệ chồi kéo dài lại tăng (90 - 92%),chiều cao trung bình chồi tăng (20,5 - 25,2 mm) Nhng tăng nồng độ BAP lên 22,2M tỉ lệ kéo dài chồi giảm xuống (52%) chiều cao chồi thấp (10,6 mm) xuất chồi nách phần gốc chồi Sử dụng kết hợp GA3 BAP kết đạt đợc nh sau: công thức môi trờng sử dụng BAP nồng độ 0,44 0,88M kết hợp với 0,03M DiệpThị Lan 24 Lớp K31A Trờng ĐHSP H Nội Khoá luận tốt nghiệp Sử dụng GA3 nồng độ thấp kết hợp với BAP nồng độ thích hợp có tác dụng tốt cho khả kích thích chiều cao chồi Kết thu đợc tơng tự nh nghiên cứu Sharry Teixeira dasilva (2006) tái sinh xoan ta từ mầm Vila cộng 2005 tái sinh xoan ta từ rễ [13], [16] 3.4 Khả tạo rễ Theo Thakur cộng (2004) Vila cộng (2005), môi trờng MS bổ sung thêm IBA nồng độ cao vào giai đoạn tiền cảm ứng tăng cờng khả tạo rễ chồi xoan ta invitro Các chồi đạt chiều dài từ 20 - 30 mm, giai đoạn đầu đợc cấy lên môi trờng tiền cảm ứng tạo rễ MS bổ sung thêm 12,30μM IBA + 2% sucrose nu«i thêi gian ngày sau cấy chuyển sang môi trờng MS có chứa 1% sucrose, chất điều hoà sinh trởng nuôi tiếp thời gian tuần Kết thu đợc cho thấy tỷ lệ chồi rễ đạt 100% (hình 5) kết phù hợp với nghiên cøu cđa Thakur vµ céng sù (2004) vµ Vila vµ céng sù (2005) Khi nghiªn cøu rƠ chåi xoan ta Sharry vµ Teixeira dasilva (2006) sư dơng IBA ë nồng độ thấp 0,049M tỷ lệ chồi rễ đạt 17% nh−ng sư dơng NAA ë nång ®é thÊp 0,054M tỷ lệ rễ thu đợc 100% sau tuần nuôi cấy [13] Trong điều kiện invitro, mô đợc cung cấp đầy đủ chất dinh dỡng, ánh sáng sống điều kiện vô trùng Với mục đích xây dựng quy trình tái sinh hoàn chỉnh phục vụ cho công tác chuyển gen nên hệ thống tái sinh không dừng lại giai đoạn tạo mô in vitro mà tiếp tục hoàn thiện chuyển ta trồng điều kiện nhà lới Khi đa mô từ điều kiện phòng thí nghiệm nhà lới, non phải trải qua giai đoạn thích nghi Cây mô có rễ phát triển đợc chuyển trồng loại giá thể có thành phần chủ yếu: trấu hun 100%, trấu pha cát tỷ lệ : cát 100% Trong tuần đầu đợc nuôi cấy phòng nuôi cấy với nhiệt độ 270c, cờng độ chiếu sáng 1000 - 1500 lux, thời gian chiếu sáng 12h/ngày Sau tuần đầu DiệpThị Lan 25 Lớp K31A Trờng ĐHSP H Nội Khoá luận tốt nghiệp Hình Hình Hình Hình Hình 3: ảnh chồi cảm ứng trực tiếp từ mầm sau tuần nuôi cấy Hình 4: ảnh chồi cảm ứng trực tiếp từ mầm sau tuần nuôi cấy Hình 5: ảnh mô hoàn chỉnh Hình 6: ảnh trồng nhà lới sau tháng DiệpThị Lan 26 Lớp K31A Trờng ĐHSP H Nội Khoá luận tốt nghiệp Kết luận Đã nghiên cứu hoàn thiện quy trình tái sinh xoan ta invitro hoàn chỉnh phơng pháp tạo cụm chồi từ mầm thân mầm Môi trờng thích hợp cho việc cảm ứng tạo chồi từ mầm môi tr−êng bỉ sung thªm vitamin B5 + (4,44 - 8,88) μM BAP + 0,46μM KIN + 3%sucrose Tû lƯ c¶m ứng tạo cụm chồi số chồi/mảnh cấy cao Môi trờng thích hợp cho việc cảm ứng tạo chồi từ thân mầm môi trờng bổ sung thêm vitamin B5 + 8,88 μM BAP + 2,68 μM NAA + 3%sucrose Tỷ lệ cảm ứng tạo cụm chồi 30,1% 2,8 chồi/mảnh cấy Kéo dài chồi đạt tỉ lệ (95 - 97%) víi chiỊu cao trung b×nh tõ (22,4 - 28,7 mm) Môi trờng thích hợp cho kéo dài chồi môi trờng MS có bổ sung thêm vitamin B5 + (0,44 - 0,88μM ) BAP + 0,03μM GA3 + 3% sucrose Tỷ lệ rễ đạt 100% môi tr−êng MS bỉ sung thªm 12,30μM IBA + 2% sucrose nuôi ngày sau chuyển sang môi trờng MS + 1% sucrose chất điều hòa sinh trởng Cây mô chuyển từ điều kiện invitro trồng nhà lới sinh trởng phát triển bình thờng DiệpThị Lan 27 Lớp K31A Trờng ĐHSP H Nội Khoá luận tốt nghiệp Kiến nghị Với quy trình tái sinh bớc nghiên cứu thử nghiệm chuyển gen vào xoan ta DiệpThị Lan 28 Lớp K31A Trờng ĐHSP H Nội Khoá luận tốt nghiệp Tài liệu tham khảo Tài liệu tiếng Việt Trịnh Đình Đạt (2008), Công nghệ sinh học tập 4, Nxb Giáo dục Lê Hồng Điệp, Vũ Văn Vụ, Nguyễn Méng Hïng (2005), C«ng nghƯ sinh häc tËp 2, Nxb Giáo Dục Hà Nội Đỗ Xuân Đồng, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình Nghiên cứu quy trình tái sinh vµ hƯ thèng chun gen vµo cµ chua (Lycopersicon esculentum Mill.) Việt Nam - Tạp chí công nghệ sinh học tập (số 4) Nông Văn Hải, Lê Xuân Đắc, Hà Hồng Hải, Đào Thị Thu Hà, Nguyễn Thanh Danh, Lê Thị Xuân, Lê Trần Bình Nhân nhanh bảo tồn Màng tang (Litsea verticillata) đợc tìm thấy vờn quốc gia Cúc Phơng kỹ thuật nuôi cấy nô tế bào thực vật - Tạp chí công nghệ sinh học tập (số 4) Nguyễn Thị Nh, Đỗ Tiến Phát, Lê Thị Muội, Đinh Thị Phòng Tái sinh invitro qua phôi soma từ mầm hạt cha chín đậu tơng ( glycine max (Merrill)) Tạp chí công nghệ sinh học tập (số 2) Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật - Nghiên cứu ứng dụng, Nxb Nông nghiệp Hà Nội Bùi Văn Thắng, Đinh Thị Phòng, Chu Hoàng Hà - Nghiên cứu hệ thống tái sinh lạc (Arachishypogaea L.) phục vụ cho chuyển gen - Tạp chí công nghệ sinh học tập ( số 3) Nguyễn Thị Phơng Thảo, Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Thị Mai Nghiên cứu nh©n nhanh gièng hoa loa kÌn Lilium formolongo b»ng lü thuật nuôi cấy mô - Tạp chí công nghệ sinh học tập (số 1) Vũ Văn Vụ (1998), Sinh lý thực vật ứng dụng, Nxb Giáo Dục Hà Néi Tµi liƯu TiÕng Anh 10 Ahmad Z Zaidi N and Shah RH, 1990 Micrapropagation of Melia azedarach from mature tissua Pak.J.Bot, vol 22, p 172 - 178 11 Gamborg O, Miller R and Ojima K 1968 Mutrient requirement of supenson cultures of soybean rood cells Exp cell Res, vol 30, p 105 - 116 DiƯpThÞ Lan 29 Líp K31A Trờng ĐHSP H Nội Khoá luận tốt nghiệp 12 Murashige T and Skoog F 1962, Arevised medium for rapid growth and bioassays with tobaco tissue cultures Physiol plant, vol 15 p 473 - 497 13 Sharry S, and Teixeira dasilva J , 2006 Effectiveorganogenesis, somatic embryogenesis and salt telerance in duction invitro in the persionlilactree (Melia azedarachl) Floriculture, Ornamental and plant Biotechnology, vol 2, p318 - 324 14 Sharrys.Cabrera Ponce J.L.Estrelia L.H Rangel cano and R.M Lede S and Abedini w, 2006 Analternative pathway for plant invitro regenetion of chinaberry tree Melia azedarach L Derived from the in duction of somatic embryogenesis Electronic Journal of Biotechology, vol No3 p188 - 194 15 Thakur.R Roop and Bapat V ,1998 Invitroplant regeneration in M elia azedarach L plant cell reports, vol 18, p127 - 131 16 Vilas.Gonzalez A.Rey H and Mroginski L 2005 plant regeneration, origin, and development of shoot buds from rood segment of Melia azedarach L (Meliaceace) seedlings Invitro cell Dev Biol.plant, vol 41, p746 - 751 17 Zaman M, Rahman N Joarder N.and Islam R 1991 Mass propagation of Mulberry (Morus alba L) through axillary bud culture plant Tissua culture vol 7, p75 - 78 Website 18 Http://Dosbinhdinh.org.vn/MagazineNewspage.asp?TinTs_TD=476&Is_Id=46 19 Http://Dofmard.gov.vn/caytrongchinh.aspx?cay=xoan%zota 20 Http://Dofmard.gov.vn/seed/loaicay41.aspx 21 Http://vi.wikipedia.org/wiki/xoan(ngay22/9/2008) 22.Http://www.dostbinhdinh.org.vn/MagazineNewsPage.asp?TinTS_ID=474&TS _ID=46 23.Http://www.nusinh.com/forum/viewtopic.php?f=17&t=6510 24.Http://www.vnast.gov.vn/default.aspx?url=Components/ArticleDetail&Article ID=3150&PanelID=511 25 Http://www.vnast.gov.vn/default.aspx?url=Components/ArticleDetail&PanelID= 511&ArticleID=3142 26 Http://www.kiemlam.org.vn 27 Http://caygiongnguyenhanh.com/project.php (9/1/2005) DiƯpThÞ Lan 30 Líp K31A ... ngời ta nghiên cứu quy trình tái sinh lạc, cà chua phục vụ chuyển gen [3], [7] Xoan đối tợng lâm nghiệp quan trọng đợc nghiên cứu nhiều Cho đến có nhiều công trình nhiều nhà khoa học nghiên cứu tái. .. Nông nghiệp Hà Nội Bùi Văn Thắng, Đinh Thị Phòng, Chu Hoàng Hà - Nghiên cứu hệ thống tái sinh lạc (Arachishypogaea L.) phục vụ cho chuyển gen - Tạp chí công nghệ sinh học tập ( số 3) Nguyễn Thị Phơng... trờng thích hợp cho tái sinh ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Đây hớng nghiên cứu ứng dụng công nghệ gen vào cải tiến giống xoan ta Việc xây dựng hệ thống tái sinh xoan ta hoàn chỉnh bớc đột