Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây xoan ta ( Melia Azedarach L,) phục vụ chuyển Gen Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây xoan ta ( Melia Azedarach L,) phục vụ chuyển Gen Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây xoan ta ( Melia Azedarach L,) phục vụ chuyển Gen Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây xoan ta ( Melia Azedarach L,) phục vụ chuyển Gen Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây xoan ta ( Melia Azedarach L,) phục vụ chuyển Gen Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây xoan ta ( Melia Azedarach L,) phục vụ chuyển Gen Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây xoan ta ( Melia Azedarach L,) phục vụ chuyển Gen Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây xoan ta ( Melia Azedarach L,) phục vụ chuyển Gen Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây xoan ta ( Melia Azedarach L,) phục vụ chuyển Gen Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây xoan ta ( Melia Azedarach L,) phục vụ chuyển Gen Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây xoan ta ( Melia Azedarach L,) phục vụ chuyển Gen Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây xoan ta ( Melia Azedarach L,) phục vụ chuyển Gen Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây xoan ta ( Melia Azedarach L,) phục vụ chuyển Gen Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây xoan ta ( Melia Azedarach L,) phục vụ chuyển Gen Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây xoan ta ( Melia Azedarach L,) phục vụ chuyển Gen Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây xoan ta ( Melia Azedarach L,) phục vụ chuyển Gen
Trang 1Mo dau 1 Lý do chọn đề tài
Xoan ta (Melia azedarach L.) là cây thân gỗ, sớm rụng lá, thuộc họ xoan (Meliaceae), có nguồn gốc ở ấn độ, miền nam Trung Quốc và Australia
Xoan ta được phân bố ở nhiều nước như Việt Nam, Lào, Campuchia
Riêng ở Việt Nam từ Bắc vào Nam hầu như tỉnh nào cũng thấy sự hiện diện của cây xoan ta, chúng mọc tự nhiên hoặc được trồng thành rừng [18]
Xoan ta là một trong những cây trồng quan trọng trong chiến lược phát triển lâm nghiệp, được trồng ở 6 trong số 9 vùng sinh thái lâm nghiệp, trong đó có các vùng: vùng Đồng bằng sông hồng, vùng Trung du, vùng Tây bắc, vùng Nam trung bộ, vùng Tây nguyên, vùng Đông nam bộ [18]
Xoan ta đứng đầu trong danh mục các cây trồng được ưu tiên phát triển theo quyết định số 16/2005/ QĐBNN ngày 15/03/2005 của bộ trưởng bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn [26]
Xoan ta là loài cây gỗ lớn có thể cao đến 30m, đường kính gần 100cm Gỗ
xoan có lõi màu hồng hay nâu nhạt, dác xám trắng, gỗ nhẹ, vân thớ đẹp, nếu
được ngâm tẩm thì đây là loại gỗ khá bên và khó bị mối mọt, cho nên gỗ xoan
thường được dùng để xây dựng, trang trí nội thất, điêu khắc [18]
Vì là một loài cây mang nhiều giá trị kinh tế nên hiện nay cây xoan đang
khuyến khích trồng và ngày càng mở rộng diện tích Để đáp ứng nhu cầu sản xuất thì cần đưa ra các giống mới có đặc điểm như kháng bệnh, chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trường, có chất lượng gỗ tốt, sinh trưởng phát triển nhanh Công nghệ chuyển gen đã dần trở thành nhân tố mang tính chìa khoá để giải quyết các vấn đề trên Tuy nhiên, để thực hiện được việc chuyển gen thì phải
có một hệ thống tái sinh cây hoàn chỉnh Với mục đích tạo ra cây xoan ta có chất
lượng gỗ tốt, khả năng sinh trưởng, phát triển nhanh nhờ chuyển gen thì trước tiên cần phải thiết lập được hệ thống tái sinh xoan ta invitro đạt hiệu suất cao Vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài: “Wghiên cứu hệ thống tái sinh xoan ta (Melia
azedarach L.) phục vụ chuyển gen ” 2 Mục đích nghiên cứu
Trang 2Tạo ra hệ thống tái sinh cây xoan ta invitro hoan chinh phuc vụ chuyển
gen bằng cách tạo đa chồi từ thân mầm, lá mầm
3 Nội dung nghiên cứu
Chuẩn bị các môi trường nuôi cấy khác nhau để đánh giá:
Khả năng cảm ứng tạo cụm chồi từ lá mầm Khả năng cảm ứng tạo cụm chồi từ thân mầm
Khả năng kích thích kéo dài chồi
Khả năng tạo rễ và ra cây
Sau đó tìm ra môi trường thích hợp nhất cho sự tái sinh của cây
4 ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Đây là hướng nghiên cứu mới ứng dụng công nghệ gen vào cải tiến giống xoan ta Việc xây dựng hệ thống tái sinh cây xoan ta hoàn chỉnh là bước đột phá
quan trọng trong quy trình chọn tạo giống mới cung cấp cho các đơn vị trồng rừng, nhằm phát triển rừng nguyên liệu có năng suất cao phẩm chất gỗ tốt
Nội dung
Trang 3
Chuong 1 Téng quan tai liéu
1.1 Các đặc điểm tự nhiên của cây xoan ta
Là cây thân gỗ phân bố ở nhiều nước trên thế giới như Việt Nam, Trung
Quốc, Lào ở Việt Nam chúng mọc tự nhiên hoặc được trồng thành rừng [19] Xoan ta là loại cây thường rụng lá vào mùa đông, thân thẳng, tán lá thưa, vỏ màu nâu xám Hoa nhỏ, đều, lưỡng tính, có mùi thơm hắc với 5 cánh hoa có màu tím nhạt hoặc tím hoa cà, mọc thành cụm (hình 1)
Hình 1: ảnh cành xoan mang hoa đang nở [23]
Quả hạch có màu vàng nhạt khi chín, treo trên cây suốt mùa đông và có
nhân màu trắng (hình 2) [21]
Trang 4
Hinh 2: anh canh xoan mang qua [23]
Lá dài đến 50 cm mọc so le, cuống lá với 2 hoặc 3 lần lá phức mọc đối, lá
chét mép có răng cưa [21]
Hệ rễ ngang khá phát triển, thường ăn nông và lan rộng, rễ cọc ăn sâu
Xoan thường phân cành sớm, khả năng đâm chồi nhanh nên có thể lợi dụng tái sinh chồi được [23]
` Xoan là cây nguyên sản ở các vùng nhiệt đới á và nhiệt đới châu á Xoan
ưa sáng, sinh trưởng nhanh, sau khi trồng từ 6-8 năm có thể thu hoạch được Xoan ưa khí hậu nóng ẩm có 2 mùa: mùa mưa và mùa khô, lượng mưa hàng năm từ 1000 mm trở lên, những vùng có thể chịu được hạn với lượng mưa hàng năm là
500 mm [23]
Xoan sinh trưởng trên nhiều loại đất khác nhau nhưng thích hợp nhất là
đất pha cát, đất phù sa ven sông có độ phì cao và sâu ẩm
Xoan có thể chịu được muối, lượng muối trong đất từ 0,4-0,5%, đất chua
có độ PH 5-6, hơi kiểm Những nơi đất bạc màu, khô hạn hoặc úng nước đều
không thích hợp với xoan [23]
Xoan có khả năng tái sinh (mọc lại từ gốc cũ đã thu hoạch) từ 3-4 lần [18]
Trang 5
Cây trồng 3 - 4 năm đã bắt đầu cho quả Chọn những cây mẹ từ 10 - 20
tuổi mọc từ hạt, có thân thẳng, phân cành cao, tán lá đều, ít cành ngang, không sâu bệnh để thu hái hạt làm giống [23]
Khi gieo ngâm hạt trong nước ấm khoảng 45C trong 8h Nhiệt độ thích
hợp cho sự nảy mầm là 16-22°C, lượng mưa trung bình từ 1700-2000 mm [19], [20]
Xoan là cây thường phân cành sớm, vì vay để thúc đẩy cây sinh trưởng, phát triển nhanh về đường kính, chiều cao và tạo ra đoạn thân sử dụng dài, cần tiến hành chăm sóc như: làm cỏ, xới đất, vun gốc kết hợp với bón phân đầy đủ
cho cây đồng thời thực hiện tỉa cành nhân tạo ngay từ khi cây 1,5 - 3 tuổi Sau
tuổi này không nên tỉa thưa nữa vì lúc này cành đã lớn việc tỉa thưa dễ làm cây bị rỗng ruột [23]
Xoan đâm chồi rất mạnh, cả chồi thân và chồi rễ do vậy có thể tạo cây chồi sau khi khai thác Kinh nghiệm nhân dân cho biết gỗ cây mọc từ chổi thường thẳng, chắc hơn mọc từ hạt nhất là những cây mọc từ chồi rễ [23]
1.2 ý nghĩa kinh tế của cây xoan
Gỗ xoan thuộc nhóm gỗ V, có lõi màu hồng hay nâu nhạt, dác xám trắng,
gỗ nhẹ mềm tỉ trọng 0,565, lực kéo ngang thớ 22kg/cm”, nén dọc thớ 339kg/cm? [18]
Gỗ xoan nhẹ nhưng khá bền ít bị mối mọt, mềm rất dé bào nhắn, cưa xẻ trạm trổ, nhưng có nhược điểm là dễ nứt Nếu được ngâm nước từ 5 - 6 tháng thì
trở nên rất bền và khó bị mối mọt cho nên gỗ xoan thường được dùng trong xây
dựng nhà cửa, đóng đồ gia dụng, trang trí nội thất và dùng trong điêu khắc [23]
Than và củi xoan cung cấp một lượng nhiệt lớn Ngoài ra lá, rễ xoan còn
dùng làm phân xanh, thuốc sát trùng, hạt có thể ép dầu chữa một số bệnh, trồng xoan để che bóng và phòng hộ .[18]
Trang 6Danh mục các loài cây chủ yếu cho trồng rừng sản xuất theo 9 vùng sinh
thái lâm nghiệp.Trong đó các vùng trồng xoan như: vùng Tây bắc gồm các tỉnh Lai Châu, Điện Biên, Sơn La, Hòa Bình; vùng Trung du (TD) gồm 6 tỉnh: Lào Cai, Yên Bái, Hà Giang, Tuyên Quang, Phú Thọ, Vĩnh Phúc; vùng đồng bằng
sông Hông (ĐBSH) gồm 10 tỉnh: Hải Phòng, Hải Dương, Bắc Ninh, Hưng Yên,
Hà Nội, Hà Tây, Thái Bình, Nam Định, Hà Nam, Ninh Bình; vùng Bắc Trung Bộ
(BTB) gồm 6 tỉnh: Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế; vùng Nam Trung Bộ (NTB) gồm 7 tỉnh: Quảng Nam, Quảng Ngãi,
Bình Định, Phú Yên, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận; vùng Tây Nguyên
(TN) gồm 5 tỉnh: Lâm Đồng, Đấk Nông, Đắc Lắc, Gia Lai, Kon Tum; vùng Đông Nam Bộ gồm 6 tỉnh: Bà Rịa - Vũng Tàu, Đồng Nai, Bình Dương, Bình Phước, Tây Ninh, Tp Hồ Chí Minh; vùng Tây Nam Bộ (TNB) gồm 12 tỉnh: Long
An, Bến Tre, Đồng Tháp, Sóc Trăng, Vĩnh Long, Cần Thơ, Tiền Giang, Bạc Liêu,
Cà Mau, Kiên Giang, An Giang, Trà Vĩnh [26]
1.4 Các phương pháp kỹ thuật ứng dụng trong cải tiến di truyền giống xoan 1.4.1 Các kỹ thuật truyền thống
Phương pháp truyền thống như gieo hạt, hom rễ nhưng khả năng cung cấp
với số lượng lớn, đúng mùa vụ trồng gặp nhiều khó khăn Mặt khác do phương
pháp nhân giống bằng hạt có nhiều nhược điểm như:
Thời gian bảo quản ngắn khoảng 6 - 7 tháng
Cây sinh trưởng và phát triển không đồng đều do có sự phân li trong di truyền
Khả năng kháng sâu bệnh của cây thấp [18] 1.4.2 Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật
Ta thấy cây xoan có nhiều tiêm năng phát triển rộng khắp các tỉnh Khi diện tích trồng xoan tăng đồng nghĩa với việc tăng nguồn giống Để khắc phục
nhược điểm của nhân giống bằng hạt và hom rễ nên trong thời gian qua trung tâm ứng dụng tiến bộ khoa học và công nghệ đã ứng dụng thành công kỹ thuật
nhân giống vô tính cây xoan bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào nhằm giải quyết những khó khăn trên [18]
Trang 7
Tính ưu việt của cây xoan cấy mô là: đảm bảo đặc tính di truyền, ít thoái hoá, cây có khả năng sinh trưởng và phát triển nhanh, có độ đồng đều cao, đảm bảo lượng lớn cây trồng đúng thời vụ [18]
Có thể nói đây là một bước đột phá quan trọng nhằm giải quyết khó khăn về nhiều mặt, đồng thời sản xuất cung ứng giống cho các đơn vị trồng rừng kỹ
thuật, phát triển rừng nguyên liệu, đảm bảo chất lượng, nâng cao năng suất cây trồng [18]
1.5 Cơ sở kĩ thuật của nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.5.1 Tính toàn năng của tế bào
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy các nguyên liệu (tế bào, mô, phơi ) thực vật hồn tồn sạch các vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo trong điều kiện vô trùng [1]
Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật là một trong những công nghệ quan trọng của công nghệ sinh học, là nền tảng để nghiên cứu và ứng dụng các công nghệ khác trong lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật [1]
Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật được tiến hành ở nước ta từ những năm 1960 tại miền Nam và những năm 1970 tại miền Bắc Tuy nhiên chỉ từ cuối những năm 1980 trở lại đây công nghệ mô tế bào mới phát triển mạnh mẽ và
nhanh chóng, nhiều phòng thí nghiệm, nghiên cứu đã được xây dựng và triển
khai ở hầu khắp các tỉnh thành trong cả nước [ 22]
Cơ sở nuôi cấy mô tế bào thực vật là tính toàn năng của tế bào, điều này lần đầu tiên được haberlandt (1902) đề cập, ông cho rằng: mỗi tế bào bất kỳ của cơ thể đa bào đều tiêm tang khả năng phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh
Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hố
đều mang tồn bộ thông tin di truyền của toàn bộ cơ thể Trong điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh, đó là tính toàn năng của tế bào Tính toàn năng là cơ sở của phương pháp nuôi cấy mô, tế bào
thực vật, trên cơ sở đó người ta đã tạo được một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng ré [1]
Hiện nay, người ta đã thực hiện được khả năng tạo ra được một cơ thể thực
vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rếẽ [1]
Trang 8
1.5.2 Sự phân hoá và phản phân hóa của tế bào
Cơ thể thực vật trưởng thành là một tổng thể thống nhất bao gồm nhiều cơ
quan khác nhau, có chức năng khác nhau và được hình thành từ nhiều loại tế bào
khác nhau Tuy nhiên, tất cả các loại tế bào đều bắt nguồn từ tế bào hợp tử ban đầu Tế bào hợp tử lúc đầu phân chia thành khối tế bào chưa chuyên hóa Các tế
bào chưa chuyên hóa này tiếp tục phân chia thành các tế bào chuyên hố đặc trưng cho các mơ, cơ quan có chức năng khác nhau Đó là hiện tượng phân hoá tế
bào Tuy nhiên, các tế bào chuyên hóa thành các tế bào chuyên biệt lại không mất sự hoàn toàn biến đổi của mình Trong những điều kiện thích hợp nhất định chúng có thể trở thành dạng tế bào như tế bào ban đầu, nghĩa là ở dạng tế bào chưa chuyên hoá Hiện tượng này gọi là hiện tượng phản phân hóa tế bào [1]
Sự phân hoá và phản phân hóa tế bào là một quá trình hoạt hóa, ức chế
hoạt động của các gen Trong một giai đoạn phát triển nhất định của cây, một số gen nào đó đang ở trạng thái ức chế không hoạt động được hoạt hóa để cho ra
một tính trạng biểu hiện mới Ngược lại một số gen lại bị ức chế đình chỉ hoạt động Quá trình hoạt hóa, ức chế diễn ra theo một chương trình đã được lập sẵn trong cấu trúc gen của tế bào, giúp cho sự sinh trưởng, phát triển của cơ thể tế
bào thực vật được hài hòa Sự hoạt động hài hoà của tế bào và mô cơ quan còn
phụ thuộc vào tế bào nằm trong khối mô, cơ quan của cơ thể Khi tách riêng từng tế bào, hoặc làm giảm kích thước khối mô sẽ tạo điều kiện cho việc hoạt hóa các
gen của tế bào [ 1]
Kĩ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực chất là điều khiển phát triển sự phát sinh
hình thái của tế bào thực vật một cách có định hướng dựa vào sự phân hóa và
phản phân hóa của tế bào thực vật Để điều khiển sự phát sinh hình thái của tế
bào, người ta bổ sung vào môi trường nuôi cấy hai nhóm điều hoà sinh trưởng
thực vật là auxin và cytokinin Tỷ lệ hàm lượng của 2 nhóm chất điều hoà sinh
trưởng này trong môi trường nuôi cấy mô khác nhau sẽ định hướng cho sự phát
sinh hình thái (phát sinh chồi, rễ hoặc mô sẹo) của mô nuôi cấy khác nhau
Trong môi trường nuôi cấy, tỷ lệ nồng độ auxin/cytokimn (đại diện là [AA/KIN) là thấp thì nuôi cấy phát sinh theo hướng tạo chồi, tỷ lệ này cao thì mô nuôi cấy
Trang 9
sẽ tạo ra mô sẹo Mô sẹo là dạng tế bào chưa phân hoá phân chia liên tục và có
khả năng hình thành phôi, chồi và cây hoàn chỉnh [ 1] 1.6 Nuôi cấy mô xoan
1.6.1 Lược sử nuôi cấy mô xoan
Nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được tiến hành trên nhiều đối loại cây như:
lạc, đậu tương, cà chua, hoa loa kèn, xoan và đã đạt được những kết quả nhất định để phục vụ cho nhiều mục đích của con người ví dụ như phục vụ cho chuyển gen, nhân giống để bảo tồn các giống quý [3], [4], [5], [7], [8]
Nông Văn Hải, Lê Xuân Đắc, Hà Hồng Hải, Đào Thị Thu Hà, Nguyễn
Thanh Danh, Lê Thị Xuân, Lê Trần Bình đã xây dựng được thành công quy trình
nhân nhanh invitro cây Màng tang để bảo tồn giống quý [4]
Nguyễn Thị Phương Thảo, Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Thị Mai đã
nghiên cứu nhân nhanh giống hoa loa kèn bằng kỹ thuật nuôi cấy Invitro nhằm
tạo ra nhiều giống cung ứng cho các nhà sản xuất [8]
Đối với đối tượng là đậu tương Nguyễn Thị Như, Đỗ Tiến Phát, Lê Thị
Muội, Định Thị Phòng đã nghiên cứu được hệ thống tái sinh cây qua phôi soma
đối với giống ĐT'12 Hiệu suất tái sinh đạt 39% và số phôi trung bình là 7,5 Day là bước đầu để có thể nghiên cứu việc chuyển gen nhằm nâng cao năng suất và chất lượng của các sản phẩm từ đậu tương[5]
Ngoài ra người ta còn nghiên cứu quy trình tái sinh cây lạc, cây cà chua
phục vụ chuyển gen [3], [7]
Xoan là một đối tượng cây lâm nghiệp quan trọng và đã được nghiên cứu
nhiều Cho đến nay đã có nhiều công trình của nhiều nhà khoa học nghiên cứu về
tái sinh xoan phục vụ chuyển gen như: Ahmad và cộng sự 1990, Thakur và cộng sự 1998, Vila và cộng sự 2003-2005, mới đây nhất là Sharry và cộng sự 2006
[10], [13], [15], [16]
Năm 1998 Thakur và cộng sự đã nghiên cứu tạo cụm chồi từ lá mầm và đạt tỉ lệ tạo đa chổi là 74% trong 7-9 tuần nuôi cấy [15]
Năm 2005 Vila và cộng sự đã nghiên cứu tái sinh chồi từ rễ xoan ta với việc sử dụng 0,44 uM BAP cho tỉ lệ tạo cụm chổi là 66,8% không có chất điều hoà sinh trưởng tỉ lệ tạo cụm chồi là 40,3% [16]
Trang 10
Nam 2006 Sharry va Teixeira dasilva sử dụng BAP kết hợp với NAA trong việc cảm ứng tạo chồi và đã tạo được 160-200 chồi/g mẫu cấy [16]
ở Việt Nam, theo báo cáo năm 2007 của Hồ Văn Giảng trường Đại học
Lâm nghiệp đã tuyển chọn được 15 cây trội có sản lượng gỗ cao lấy mẫu nuôi
cấy mô Đang xác định chỉ tiêu chất lượng có liên quan đến sản lượng và chất
lượng gỗ Đã tạo được mẫu sạch invitro xoan ta, bước đầu đã xác định được loại vật liệu nuôi cấy tạo phôi soma và cụm chồi, đã tái sinh được phôi soma và cụm
chồi Hiện đang tiến hành nghiên cứu tiếp để hoàn thiện quy trình kĩ thuật tái
sinh cây xoan ta thông qua phôi soma và đa chổi [25]
Năm 2007 theo báo cáo của Đoàn Thị Mai Viện khoa học Lâm nghiệp
Việt Nam đã tiến hành các thí nghiệm nhân giống sinh dưỡng bằng nuôi cấy mô cho 36 dòng, bước đầu đã tìm ra được môi trường thích hợp cho từng dòng, hệ số
nhân chồi đạt từ 5,5 — 9,2 chồi/ cụm chồi [24]
Nghiên cứu ra rễ chồi xoan ta Sharry và Teixeira dasilva (2006), sử dụng IBA ở nồng độ thấp 0,049uM tỉ lệ chồi ra rễ chỉ đạt 17% nhưng khi sử dụng NAA ở nồng độ thấp 0,054uM thì tỉ lệ ra rễ thu được 100% sau 6 tuần nuôi cấy [13]
1.6.2 ảnh hưởng của các thành phần môi trường đến nuôi cấy mô xoan
Thành phần vô cơ bao gồm các muối khoáng (cả đa lượng và vi lượng) được đưa vào môi trường nuôi cấy Nhu cầu về muối khoáng của tế bào và mô
thực vật tách rời là không khác nhiều so với yêu cầu của cây được trồng trong
điều kiện tự nhiên Trong thành phần muối khoáng đa lượng các nguyên tố phải
cung cấp là nitơ, kali, photpho [2]
Nitơ vô cơ được đưa vào môi trường ở 2 dạng là nitrat (NO; ) và amon (NH¿°) Đa số các môi trường có chứa dang nitrat nhiéu hon amon Theo Narayanas Wamy (1994) hàm lượng nitrat trong nhiều môi trường khoảng 25M còn của amon từ 2 - 20 uM [2]
Trong môi trường MS amon được cung cấp ở dạng muối NH,NO,, con
môi trường B¿, của Gramborg có amon ở dạng muối (NH,),SO, - các gốc nitrat được đưa vào môi trường dưới dạng muối nifrat canxi, nifrat kali hoặc mitrat
amon Khi môi trường chỉ chứa nitơ ở dạng dễ gây kiểm hố mơi trường vì thế
Trang 11
Yêu cầu về muối khoáng vi lượng của mô thực vật trong nuôi cấy kha phức tạp và ít được nghiên cứu Tuy nhiên trong nhiều loại môi trường cơ bản đã được xây dựng, các tác giả đều cung cấp cho môi trường hầu hết các nguyên tố vi lượng cần thiết nhằm mục đích để thúc đẩy sự sinh trưởng và phát triển của mẫu
nuôi cấy [2]
Sắt được đưa vào môi trường dạng muối FeSO,.7H,O, Fe,(SO,); Nhưng
chúng sẽ bị kết tủa và mẫu nuôi cấy rất khó hấp thụ các loại muối này do đó phải
cho thêm vào môi trường nuôi cấy Na,EDTA (sodium ethyline diamine tetra acetate) để tạo muối phức Na,FeEDTA (dạng selat) có chưa Na, Fe và được mô
nuôi cấy hấp thụ dễ dàng [2]
Ngoài ra các thành phần hữu cơ cũng có ảnh hưởng tới nuôi cấy mô
Nguồn cacbon cung cấp cho mẫu nuôi cấy chính là đường sucrose, maltose được sử dụng trong môi trường Bên cạnh vai trò là nguồn năng lượng, vật chất cơ bản, đường còn tạo ra một áp lực thẩm thấu giúp cho mô có sự cân
bằng cần thiết với môi trường nuôi cấy [2]
Các tác nhân tạo gel: quyết định trạng thái vật lý của môi trường nuôi cấy Các môi trường chứa đủ hàm lượng chất tạo gel làm cho chúng đông lại ở nhiệt độ bình thường (25 - 30°C) [2]
Chất gel được sử dụng phổ biến là agar (thạch) gồm một số polysaccharide được lấy từ rong biển Các polysaccharide kết hợp với các phân tử nước tạo thành polymer và đông lại thành gel ở nhiệt độ 45°C Hàm lượng agar sử dụng khoảng 0,5 - 10% tuỳ theo chất lượng của chúng và loại môi trường được sử dụng Nếu nhiều quá gây hạn chế khả năng trao đổi chất giữa cơ thể với môi trường [2]
Một số trường hợp người ta còn bổ sung Adenin nồng độ 40 - 80mg/lit
1.6.3 ảnh hưởng của các chất điều hoà sinh trưởng đến nuôi cấy mô xoan
Trang 12
Các chất điều hoa sinh trưởng có vai trò quan trọng trong kĩ thuật nuôi cấy
mô thực vật Bằng cách cung cấp các chất điều hoà sinh trưởng ở một mức thích hợp người nghiên cứu có thể điều khiển được chiều hướng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy Auxin và cytokinin là 2 chất được sử dụng phổ biến nhất
Ngoài ra người ta còn str dung gibberellin [6]
Hiệu quả tác động của chất điều hoà sinh trưởng phụ thuộc vào nồng độ sử dụng, hoạt tính vốn có của chúng và mẫu nuôi cấy
Auxin có hiệu quả kích thích sự sinh trưởng của tế bào, cùng với cytokinin làm tăng phân bào, hạn chế ưu thế đỉnh, kích thích sự hình thành rễ và tham gia vào cảm ứng phôi vô tính [6]
Các loại Auxin thường sử dụng trong nuôi cấy là: IAA - Indole acetic acid
IBA - Indole butyric acid NOA - Naphthoxy acetic acid NAA - Naphthalene acetic acid 2,4D - 2,4 dichlorophenoxy acetic cid
IAA ít được sử dụng do kém bền với nhiệt và ánh sáng, những trường hợp có bổ
sung IAA vào môi trường nghiên cứu thì phải dùng ở nồng độ cao 1,0 - 30mg/1
(Dodds anh Roberts 1990) [2]
Theo Thakur và cộng sự (2004), Vila và cộng sự (2005) với việc sử dụng
môi trường MS bổ sung thêm IBA ở nồng độ cao vào giai đoạn tiền cảm ứng sẽ
tăng cường khả năng ra rễ chồi xoan ta invitro [15], [16], [17]
Các auxin khác có hàm lượng sử dụng từ 0,1 - 2,0 mg/Hit - chúng có hiệu
quả sinh lý ở nồng độ thấp Tuỳ loại auxin hàm lượng sử dụng và đối tượng nuôi cấy mà tác động sinh lý của auxin là kích thích sinh trưởng của mơ, hoạt hố sự hình thành rễ hay thúc đẩy sự phân chia mạnh mẽ của tế bào dẫn đến hình thành
mô seo (callus) [2]
Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh trưởng của chồi invitro Các cytokinin có biểu hiện ức chế sự tạo rễ và sự sinh trưởng của mô sẹo nhưng có ảnh hưởng dương tính rõ rệt đến phát sinh phôi vô tính của mẫu
nuôi cấy [6]
Trang 13
Cac loai cytokinin thudng dung la: Kinetin (KIN), zeatin, 6Bentyl amino purin (6OBAP), Isopentenyl adenin (Zip) [2]
Kinetin duoc nha khoa hoc Skoog phat hiện ngẫu nhiên trong khi chiết
xuất axit nucleic, kinetin thuc chất là một dẫn xuất của bazo nito adenin
BAP là cytokinin được tổng hợp nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn kinetin
[6]
Theo báo cáo của Joarder và cộng sự (1993) BAP thực chất là điều hoà
sinh trưởng rất tốt cho việc phát sinh chồi cây neem [17]
BAP được sử dụng ở nồng độ 0,44 uM đã cho tỉ lệ tạo cụm chồi từ lá mầm là 66,8%, BAP tốt hơn các cytokinin khác trong việc cảm ứng phát sinh chồi ở
cây gỗ [14], [16]
BAP ở nồng độ 4,44 uM kích thích cảm ứng tạo phôi soma đạt tỉ lệ cao
nhất
Hàm lượng sử dụng các loại cytokinim dao động từ 0,1 - 2,0 mg/lit ở những nồng độ cao hơn cytokinin kích thích rõ rệt sự hình thành chồi bất định đồng thời ức chế mạnh sự tạo thành rễ của chổi nuôi cấy Trong các loại cytokinin nói trên thì KIN và BAP là 2 loại được sử dụng rộng rãi hơn cả [2]
Trong nuôi cấy có loại mẫu chỉ cần auxin hoặc cytokinin hoặc không cần cả 2, đa số các trường hợp sử dụng phối hợp cả auxin và cytokinin ở những trường hợp tỷ lệ khác nhau [2]
Tác động phối hợp của auxin và cytokinin có tác dụng quyết định đối với sự phát triển và phát sinh hình thái của mô, tế bào Những nghiên cứu của Skoog cho thấy tỷ lệ auxin/cytokinin cao thì thích hợp cho sự hình thành rễ, tỷ lệ thấp sẽ kích thích quá trình phát sinh chồi Nếu tỷ lệ này ở mức độ cân bằng thì thuận
lợi cho phát triển mô sẹo Das (1958) và Nitsel (1968) khẳng định rằng chỉ khi tác động đồng thời của auxin va cytokinin thi mới kích thích mạnh mẽ sự tổng
hợp ADN, liên quan đến quá trình phân chia tế bào [9] 1.6.4 ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy
Các mẫu nuôi cấy thường được đặt trong phòng nuôi ổn định về ánh sáng
và nhiệt độ Tất cả các tế bào mô nuôi cấy đều cần ánh sáng trừ một số trường
hợp nuôi cấy tạo mô seo, nhưng trong quá trình tái sinh và nhân giống của chúng
Trang 141.6.5 ảnh hưởng của pH
PH của đa số môi trường nuôi cấy đều được điều chỉnh trong phạm vi từ
5,5 - 6.0 PH dưới 5,5 làm cho agar khó chuyển sang trạng thái gel còn pH > 6,0 agar có thể rất cứng Nếu trong thành phần môi trường nuôi dưỡng có GA; thì
phải điều chỉnh giá trị pH của phạm vi nói trên Vì pH quá kiểm hoặc quá acid,
GA; sẽ chuyển sang dạng không có hoạt tính (Vanbrapt and piert 1971) Trong
quá trình nuôi cấy, pH của môi trường có thể giảm xuống do một số mẫu thực vật
sản sinh ra các axit hữu cơ [2]
Trang 15
Chuong 2:
Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Vật hệu thực vật
Quả xoan ta thu hái và chọn lọc từ những cây trội được trung tâm giống và công nghệ sinh học, viện sinh thái rừng và môi trường, Đại học lâm nghiệp cung
cấp Sau đó loại bỏ phần thịt quả bằng cơ giới và tách lấy hạt làm vật liệu nuôi
cấy
2.1.2 Dụng cụ và hoá chất thí nghiệm
Các điều kiện máy móc và hoá chất được phòng Công nghệ tế bào thực vật
- Viện công nghệ sinh học cung cấp
Môi trường nuôi cấy, môi trường cơ bản MS được sử dụng trong nghiên
cứu gồm các muối đa lượng và vi lượng theo Murashige và Skoog
Trang 16Bảng 1: Thành phần môi trường MS (theo Murashige va Skoog) STT Thành phần Nồng độ Muối khoáng 1 NH,NO, 1650 mg/lit 2 KNO, 1900 mg/lit 3 CaCl,.2H,0 440 mg/lit 4 MgS0,.7H;0 370 mg/lit 5 KH;PO, 170 mg/Hit 6 H,BO, 6,2 mg/lit 7 MnS0,.4H,0 22,3 mg/lit 8 ZnS0,.7H,0 8,6 mg/lit 9 KI 0.83 mg/lit 10 | Na,Mo0,.2H,0 0,25 mg/lit 11 CuS0,.5H;0 0,025 mg/lit 12 CoCl,.6H,0 0,025 mg/lit 13 Na,EDTA 37,3 mg/lit 14 | FeS0,7H,0 27,8 mg/lit
Các chất hữu cơ và vitamin
15 Myo - Inositol 100 mg/lit
Trang 172.2 Phương pháp nghiên cứu
Khử trùng môi trường và dụng cụ nuôi cấy ở nhiệt độ 121C, áp suất 1,5 atm trong 15 phút Nuôi cấy trong điều kiện nhiệt độ 25 + 2”C cường độ ánh sáng
3000 Iux với thời gian chiếu sáng 16h/ngày
Tái sinh cụm chồi bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật gồm các bước theo sơ đồ [27] Cây giống trong vườn giống đầu dòng Khử trùng Môi trường MS căn bản Chồi con trong ống nghiệm
Cấy chuyển Môi trường nhân chồi
Trang 18Chúng tôi tiến hành tái sinh cụm chồi từ lá mầm, thân mầm theo các bước
như sau:
Vô trùng mẫu Tạo cụm chồi Kéo dài chồi
Kéo dài rễ và hoàn thiện cay con invitro Đưa cây ra nhà lưới
2.2.1 Khử trùng mẫu và chuẩn bị nguyên liệu tạo chồi
Hạt được sát khuẩn bề mặt bằng ethanol trong 3 phút Khử trùng bằng javen 60% trong 30 phút (lắc mạnh)
Loại bỏ javen và rửa sạch bằng nước cất vô trùng 5 lần
Hạt sau khi khử trùng được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng MS bổ sung thêm sucrose với mật độ 15 hạt/bình tam giác 250 mI
2.2.2 Cảm ứng tạo cụm chồi
Sau 3 tuần nuôi cấy hạt nảy mầm, phân lá mầm được cắt bỏ viền lá và cắt đôi, phần thân mầm cắt thành những đoạn nhỏ có kích thước 4 -5 mm cấy lên
môi trường MS bổ sung thêm vitamin B, (Gamborg và cộng sự 1968) và 3%
sucrose + 0,44 - 13,32 uM, 6BAP+ + 0,46 uM KIN nuôi cấy trong 4 tuần
2.2.3 Kích thích kéo dai choi
Các chồi được tái sinh ra từ cụm chồi và cấy chuyển sang môi trường kích
thích kéo dài chồi MS bổ sung thêm vitamin B, + 3% sucrose + 0,44 - 2,22 uM
BAP + 0,3 uM GA; nuôi cấy trong 4 tuần
2.2.4 Khả năng tạo rễ và ra cây hoàn thiện cây con invifro
Các chồi đạt chiều dài 20 — 30 mm đầu tiên được cấy lên môi trường tiền
cảm ứng tạo rễ MS bổ sung thêm 2% sucrose + 12,30 mM IAB nuôi cấy trong 4 ngày và sau đó cấy sang môi trường MS có bổ sung thêm 1% sucrose, không bổ
sung chất điều hồ sinh trưởng Ni tiếp trong 4 tuần để kéo dài rễ
2.2.5 Đưa cây ra nhà lưới
Cây mô hoàn chỉnh được đưa ra nhà lưới, trồng trên giá thể trấu hun
100%, trấu hun pha cát tỉ lệ 1:1, cát 100% trong vòng 2 tuần đầu ánh sáng trực xạ Tất cả môi trường nuôi cấy đều được chuẩn độ pH = 5,8 và bổ sung thêm agar
Trang 19
2.2.5 Phương pháp xử lí số liệu thực nghiệm
Trang 20Chuong 3:
Két qua va thao luan
3.1 Khả năng cảm ứng cụm chổi từ lá mầm
Nghiên cứu sự ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng BAP và KIN, NAA lên khả năng cảm ứng tạo cụm chồi từ lá mầm cây xoan ta, kết quả thu được ghi ở bảng 2 như sau:
Bảng 2: ảnh hưởng của các chất điều hoà sinh trưởng đến khả năng cảm ứng tạo cụm chồi từ mảnh lá mầm sau 4 tuần nuôi cấy
BAP KIN NAA Minh Phan tram `
Trang 21Ở công thức môi trường không có chất điêu hoà sinh trưởng hoặc có chất điều hòa sinh trưởng là BAP ở nồng độ thấp 0,44uM thì các mảnh lá mầm sau 4 tuần nuôi cấy dưới điều kiện chiếu sáng không có khả năng cảm ứng tạo cụm chồi Trong khi đó nghiên cứu tái sinh chồi từ rễ cây xoan ta chỉ cần sử dụng
0,44uM BAP đã cho tỉ lệ tạo cụm chồi là 40,3% (Vila và cộng sự 2005).Khi sử
dụng riêng BAP với nồng độ thấp 2,22uM tỉ lệ cảm ứng tạo cụm chổi thấp đạt 5,6% và số chồi trung bình là 1,5 chồi/mảnh cấy Tuy nhiên khi sử dụng riêng BAP ở các nồng độ từ 4,44 - 13,32uM khả năng cảm ứng cụm chồi diễn ra mạnh, chỉ sau 2 tuần nuôi cấy, quan sát cho thấy hầu hết các mảnh lá mầm đã cảm ứng
tạo mô sẹo và tạo chồi tại vết cắt (hình 3) sau 4 tuần nuôi cấy tỉ lệ cảm ứng tạo
cụm chéi đạt 93,8%, số chồi trung bình 5,8 chồi/mảnh cấy ở nồng độ 8,8§uM BAP (hình 4) ở nồng độ 4,44uM BAP tỉ lệ mảnh cấy cảm ứng tạo cụm chồi 90% nhưng số chồi trung bình thu được trên mỗi mảnh cấy là 6,8 chồi/mảnh cấy Từ kết quả thu được cho thấy BAP ảnh hưởng rất mạnh mẽ đến khả năng tạo chồi
Theo nghiên cứu của Joarder và cộng sự (1993) BAP là chất điều hoà sinh
trưởng thuộc nhóm cytokinin rất tốt cho sự phát sinh chổi cây neem
(Azadirachda indica Juss.meliaceae) [17]
BAP tét hon cdc cytokinin khác trong sự cảm ting phat sinh chéi ở cây gỗ
(Zamam 1991, Thakur va cong su 1988) [15]
BAP ở nồng độ 4,44uM cũng kích thích cảm ứng tạo phôi soma xoan ta
đạt tỷ lệ cao nhất (Sharry va cộng sự 2006) [13], [14]
Nhiều nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp giữa BAP ở nồng độ cao và KIN ở nồng độ thấp kết quả cũng cho thấy, tỉ lệ cảm ứng cụm chồi tăng lên và số chồi trên cụm cũng tăng Khi sử dụng kết hợp BAP ở nồng độ thấp 2,22uM BAP + 0,46 uM KIN tỉ lệ cảm ứng tạo cụm chổi thấp đạt 7,2% và số chồi trung bình cũng thấp 1,7 chồi/mảnh cấy
Nhưng khi tăng nồng độ BAP lên từ 4,44uM - 8,88uM kết hợp với 0,46uM KÌN thì tỉ lệ cảm ứng tạo cụm chổi tăng trong khoảng từ 92,4% - 98% và số chồi trung bình cũng cao trong khoảng 6,0 - 7,3 chồi/mảnh cấy.Chiều cao
Trang 22
Khi sử dụng kết hợp BAP và NAA trong viéc cam ting tao cum chdi tir 14 mầm tỉ lệ cảm ứng tao cum chéi thap, s6 chéi/manh cay ciing thap cu thể: ở công thitc két hop 4,44uM BAP + 2,68uM NAA ti lé cảm ứng tạo cụm chồi thấp đạt 12,7%, s6 ch6i trung binh dat 1,2 chéi/manh cay Va khi tăng nồng độ BAP lên
la 6,66uM tỉ lệ cảm ứng cụm tao chéi dat 12,2%, s6 chéi trung binh 14 1,0
chồi/mảnh cấy
Néng dé 8,88uM BAP va 2,68uM NAA chi cho ti lé cam ting tao cum
chồi là 37% số chồi trung bình là 2,5 chồi/mảnh cấy Và khi tăng nồng độ BAP lên ở nồng độ 11,10uM kết hợp với 2,68uM NAA thì tỉ lệ cảm ứng tạo cụm chồi
lại giảm (26,8%), số chồi trung bình đạt 2,2 chồi/mảnh cấy Nhìn chung ở các
công thức bổ sung thêm NAA tỷ lệ phần trăm cảm ứng tạo cụm chồi giảm đáng kể, số chồi trên mảnh cũng thấp chủ yếu chồi đơn
Môi trường thích hợp cho việc tái sinh cụm chổi từ mảnh lá mầm là môi
trường MS bổ sung thêm vitamin B, + BAP ở các nồng độ từ 4,44 - 8,88uM +
0,46uM KIN + 3% sucrose và được khuyến cáo sử dụng trong công tác biến nạp và tái sinh cây chuyển gen
3.2 Khả năng cảm ứng tạo cụm chồi từ thân mâm
Các đoạn thân mầm được cắt thành các đoạn nhỏ với chiều dài 4 - 5 mm đặt lên môi trường tái sinh chồi với các chất điều hoà sinh trưởng khác nhau và ở các nồng độ khác nhau Sau 4 tuần nuôi cấy thu thập và xử lý số liệu kết quả thu được ghi ở bảng 3 Khác với lá mầm, thân mầm xoan ta tái sinh kém hơn Sau 2 tuần đầu nuôi cấy đa số các đoạn thân mầm bị cảm ứng tạo mơ sẹo hố rất mạnh và chỉ có một số mô sẹo chuyển từ màu trắng sang màu nâu và mất khả năng tái sinh chồi Đối với thân mầm khi nuôi cấy trên môi trường không có chất điều hoà sinh trưởng cũng có khả năng tái sinh chồi với tỉ lệ 4,3% Khi sử dụng đơn lẻ BAP cho việc tái sinh chổi từ thân mầm kết quả chỉ ra rằng ở nồng độ 0,44uM tỉ
lệ cảm ứng tạo cụm chồi đạt 26,6% cao hơn so với các nồng độ khác Trong khi
đó ở nồng độ 0,44uM BAP tỉ lệ tái sinh chồi từ lá mầm là 0%
Trang 23
Sử dụng tổ hop giita BAP + KIN va BAP + NAA trong viéc tai sinh chéi
từ đoạn thân mầm Kết quả thu được cho thấy tỉ lệ mảnh cấy tạo chồi cao nhất là (30,1%) ở công thức 8,88uM BAP + 2,68uM NAA ty 1é nay thap hơn rất nhiều so với tái sinh từ lá mầm (98%), số chồi/mảnh cấy cũng thấp hơn nhiều so với
việc cảm ứng từ lá mầm, trong việc tái sinh cụm chồi từ thân mầm số chồi/mảnh
cấy chỉ trong khoảng 1,2 - 2,8 chồi/mảnh cấy
Bảng 3: ảnh hưởng cuả các chất điều hoà sinh trưởng đến khả năng cảm ứng chồi từ thân mầm sau 4 tuần nuôi cấy
BAP KIN NAA Mảnh cấy tạo | Phần trăm | chồi/mảnh
Trang 243.3 Kich thich kéo dai choi
Các chéi dat chiéu cao > 7 mm duoc tách ra từ cụm chồi và cấy chuyển
sang môi trường kích thích kéo dài chồi MS bổ sung thêm Vitamin B, + 3% sacrose + 0,44 - 2,22uM BAP + 0,3uM GA: Sau 4 tuần nuôi cấy thống kê số
liệu thu được trình bày ở bảng 4
Bảng 4: ảnh hưởng các chất điều hoà sinh trưởng đến khả năng kéo dài chồi sau 4 tuần nuôi cấy BAP (uM) | GA,(uM) | phần trăm chồi kéo dài Chiều cao chồi (mm) - - 62 15,2+1,8 0,44 - 90 20,5 + 4,2 0,88 - 92 25,2 + 2,7 2,22 - 52 10,6 + 0,5 0,44 0,03 95 22,4 + 3,0 0,88 0,03 97 28,7 + 2,9 2,22 0,03 54 16,3 + 2,5
Ghi chú: (-) không có chất điều hoa sinh trưởng
Chồi sử dụng là 100 trên mỗi công thức thí nghiệm số liệu cho thấy khi khơng có chất điều hồ sinh trưởng tỉ lệ chồi kéo dài thấp đạt 62% và chiều cao trung bình của chồi cũng thấp 15,2 mm
Khi sử dụng riêng BAP ở các nồng độ 0,44 và 0,88uM thì tỉ lệ chồi kéo dài lại tăng (90 - 92%),chiều cao trung bình của chồi cũng tăng (20,5 - 25,2 mm) Nhưng khi tăng nồng độ BAP lên 22,2uM tỉ lệ kéo dài chồi giảm xuống (52%) chiều cao chồi thấp hơn (10,6 mm) và xuất hiện các chồi nách ở phần gốc chồi
Sử dụng kết hợp GA; và BAP thì kết quả đạt được như sau: ở các công thức môi trường sử dụng BAP ở nồng độ 0,44 và 0,88§uM kết hợp với 0,03uM
Trang 25
Sử dụng GA; ở nồng độ thấp kết hợp với BAP ở nồng độ thích hợp có tác dụng tốt cho khả năng kích thích chiều cao chồi Kết quả thu được của chúng tôi
cũng tương tự như nghiên cứu của Sharry và Teixeira dasilva (2006) về tái sinh xoan ta từ lá mầm và của Vila và cộng sự 2005 về tái sinh xoan ta từ rễ [13],
[161
3.4 Khả năng tạo rễ và ra cây
Theo Thakur và cộng sự (2004) và Vila và cộng sự (2005), môi trường MS
bổ sung thêm IBA ở nồng độ cao vào giai đoạn tiền cảm ứng sẽ tăng cường khả năng tạo rễ chồi xoan ta invitro Các chồi đạt chiều dài từ 20 - 30 mm, giai đoạn đầu được cấy lên môi trường tiền cảm ứng tạo rễ MS bổ sung thêm 12,30uM IBA
+ 2% sucrose nuôi trong thời gian 4 ngày và sau đó cấy chuyển sang môi trường
MS có chứa 1% sucrose, khơng có chất điều hồ sinh trưởng nuôi tiếp trong thời gian 4 tuần Kết quả thu được cho thấy tỷ lệ chồi ra rễ đạt 100% (hình 5) kết qua
này phù hợp với nghiên cứu của Thakur và cộng sự (2004) và Vila và cộng sự (2005) Khi nghiên cứu ra rễ chồi xoan ta Sharry và Teixeira dasilva (2006) sử
dụng IBA ở nồng độ thấp 0,049uM tỷ lệ chồi ra rễ đạt 17% nhưng khi sử dụng NAA ở nồng độ thấp 0,054uM thì tỷ lệ ra rễ thu được 100% sau 6 tuần nuôi cấy
[13]
Trong điều kiện invitro, cây mô được cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng,
ánh sáng và sống trong điều kiện vô trùng Với mục đích xây dựng 1 quy trình tái sinh cây hoàn chỉnh phục vụ cho công tác chuyển gen nên hệ thống tái sinh cây
không chỉ dừng lại ở giai đoạn tạo cây mô in vitro mà tiếp tục hoàn thiện chuyển cây ta trồng trong điều kiện nhà lưới Khi đưa cây mô từ trong điều kiện phòng thí nghiệm ra nhà lưới, cây non phải trải qua các giai đoạn thích nghi dần dần
Cây mô có bộ rễ phát triển được chuyển ra trồng trên 3 loại giá thể có thành phần chủ yếu: trấu hun 100%, trấu pha cát tỷ lệ 1 : 1 và cát 100% Trong 2 tuần đầu cây được nuôi cấy trong phòng nuôi cấy với nhiệt độ 27c, cường độ chiếu sáng 1000 - 1500 lux, thời gian chiếu sáng 12h/ngày Sau 2 tuần đầu cây
Trang 26
Hình 3: ảnh của chồi cảm ứng trực tiếp từ lá mầm sau 2 tuần nuôi cấy Hình 4: ảnh của chồi cảm ứng trực tiếp từ lá mầm sau 4 tuần nuôi cấy Hình 5: ảnh cây mơ hồn chỉnh
Hình 6: ảnh cây trồng ngoài nhà lưới sau 1 tháng
Trang 27
Kết luận
1 Đã nghiên cứu và hoàn thiện quy trình tái sinh cây xoan ta Invitro hoàn
chỉnh bằng phương pháp tạo cụm chồi từ lá mầm và thân mầm
2 Môi trường thích hợp cho việc cảm ứng tạo chồi từ lá mầm là môi
trường bổ sung thêm vitamin B, + (4,44 - 8,88)uM BAP + 0,46uM KIN +
3%sucrose Ty lệ cảm ứng tạo cụm chồi và số chồi/mảnh cấy cao
Môi trường thích hợp cho việc cảm ứng tạo chổi từ thân mầm là môi
trường bổ sung thém vitamin B, + 8,88uM BAP + 2,68uM NAA + 3%sucrose
Ty lệ cảm ứng tạo cụm chổi là 30,1% và 2,8 chồi/mảnh cấy
Kéo dài chéi đạt tỉ lệ (95 - 97%) với chiều cao trung bình từ (22,4 - 28,7 mm) Môi trường thích hợp cho kéo đài chồi là môi trường MS có bổ sung thêm vitamin B, + (0,44 - 0,88uM) BAP + 0,03uM GA, + 3% sucrose
Tỷ lệ ra rễ đạt 100% trên môi trường MS bổ sung thêm 12,30uM
IBA + 2% sucrose nuôi trong 4 ngày sau đó chuyển sang môi trường MS + 1% sucrose không có chất điều hòa sinh trưởng
3 Cây mô chuyển từ điều kiện invitro trồng trong nhà lưới sinh trưởng và phát triển bình thường
Trang 28
Kién nghi
Với quy trình tái sinh này bước tiếp theo có thể nghiên cứu thử nghiệm
chuyển gen vào xoan ta
Trang 29
Tai liéu tham khao Tai liéu tiéng Viét
1 Trinh Dinh Dat (2008), Cong nghé sinh học tập 4, Nxb Giáo dục
2 Lê Hồng Điệp, Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng (2005), Công nghệ sinh hoc tập 2, Nxb Giáo Dục Hà Nội
3 Đỗ Xuân Đồng, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình —- Nghiên cứu quy trình tái sinh và hệ thống chuyển gen vào cà chua (Lycopersicon esculentum Mill.) cha Việt Nam - Tạp chí công nghệ sinh học tập 2 (số 4)
4 Nông Văn Hải, Lê Xuân Đắc, Hà Hồng Hải, Đào Thị Thu Hà, Nguyễn Thanh Danh, Lê Thị Xuân, Lê Trần Bình - Nhân nhanh và bảo tồn cây Màng tang (Liisea verticilata) được tìm thấy ở vườn quốc gia Cúc Phương bằng kỹ thuật nuôi cấy nô tế bào thực vật - Tạp chí công nghệ sinh học tập 2 (số 4)
5 Nguyễn Thị Như, Đỗ Tiến Phát, Lê Thị Muội, Định Thị Phòng - Tái sinh cây Invitro qua phôi soma từ lá mầm hạt chưa chín ở dau tuong ( glycine max (Merrill)) — Tạp chí công nghệ sinh học tập 5 (số 2)
6 Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật - Nghiên cứu và ứng dung, Nxb Nông nghiệp Hà Nội
7 Bùi Văn Thắng, Đinh Thị Phòng, Chu Hoàng Hà - Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây lạc (Arachishypogaea L.) phục vụ cho chuyển gen - Tạp chí công nghệ
sinh học tập 2 ( số 3)
8 Nguyễn Thị Phương Thảo, Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Thị Mai - Nghiên cứu nhân nhanh gidng hoa loa kén Lilium ƒormolongo bằng lỹ thuật nuôi cấy mô
- Tạp chí công nghệ sinh học tập 4 (số T)
9 Vũ Văn Vụ (1998), Sinh lý thực vật ứng dụng, Nxb Giáo Dục Hà Nội
Tài liệu Tiếng Anh
10 Ahmad Z Zaidi N and Shah RH, 1990 Micrapropagation of Melia
azedarach from mature tissua Pak.J.Bot, vol 22, p 172 - 178
11 Gamborg O, Miller R and Ojima K 1968 Mutrient requirement of supenson cultures of soybean rood cells Exp cell Res, vol 30, p 105 - 116