Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây xoan ta ( melia azedarach l,) phục vụ chuyển gen

Xoan ta đứng đầu trong danh mục các cây trồng được ưu tiên phát triển theo quyết định số 16/2005/ QĐBNN ngày 15/03/2005 của bộ trưởng bộ Nông nghiệp điều kiện bất lợi của môi trường, có

Xoan ta là một trong những cây trồng quan trọng trong chiến lược phát triển lâm nghiệp, được trồng ở 6 trong số 9 vùng sinh thái lâm nghiệp, trong đó

có các vùng: vùng Đồng bằng sông hồng, vùng Trung du, vùng Tây bắc, vùng Nam trung bộ, vùng Tây nguyên, vùng Đông nam bộ [18]

Xoan ta đứng đầu trong danh mục các cây trồng được ưu tiên phát triển theo quyết định số 16/2005/ QĐBNN ngày 15/03/2005 của bộ trưởng bộ Nông nghiệp

điều kiện bất lợi của môi trường, có chất lượng gỗ tốt, sinh trưởng phát triển nhanh Công nghệ chuyển gen đã dần trở thành nhân tố mang tính chìa khoá để giải quyết các vấn đề trên Tuy nhiên, để thực hiện được việc chuyển gen thì phải

có một hệ thống tái sinh cây hoàn chỉnh Với mục đích tạo ra cây xoan ta có chất lượng gỗ tốt, khả năng sinh trưởng, phát triển nhanh nhờ chuyển gen thì trước tiên cần phải thiết lập được hệ thống tái sinh xoan ta invitro đạt hiệu suất cao Vì

vậy chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu hệ thống tái sinh xoan ta (Melia

azedarach L.) phục vụ chuyển gen”

2 Mục đích nghiên cứu

Tạo ra hệ thống tái sinh cây xoan ta invitro hoàn chỉnh phục vụ chuyển gen bằng cách tạo đa chồi từ thân mầm, lá mầm

3 Nội dung nghiên cứu

Chuẩn bị các môi trường nuôi cấy khác nhau để đánh giá:

Khả năng cảm ứng tạo cụm chồi từ lá mầm

Khả năng cảm ứng tạo cụm chồi từ thân mầm

Khả năng kích thích kéo dài chồi

Khả năng tạo rễ và ra cây

Sau đó tìm ra môi trường thích hợp nhất cho sự tái sinh của cây

4 ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Đây là hướng nghiên cứu mới ứng dụng công nghệ gen vào cải tiến giống xoan ta Việc xây dựng hệ thống tái sinh cây xoan ta hoàn chỉnh là bước đột phá quan trọng trong quy trình chọn tạo giống mới cung cấp cho các đơn vị trồng rừng, nhằm phát triển rừng nguyên liệu có năng suất cao phẩm chất gỗ tốt

Nội dung

Chương 1 Tổng quan tài liệu

1.1 Các đặc điểm tự nhiên của cây xoan ta

Là cây thân gỗ phân bố ở nhiều nước trên thế giới như Việt Nam, Trung Quốc, Lào ở Việt Nam chúng mọc tự nhiên hoặc được trồng thành rừng [19]

Xoan ta là loại cây thường rụng lá vào mùa đông, thân thẳng, tán lá thưa,

vỏ màu nâu xám Hoa nhỏ, đều, lưỡng tính, có mùi thơm hắc với 5 cánh hoa có màu tím nhạt hoặc tím hoa cà, mọc thành cụm (hình 1)

Hình 1: ảnh cành xoan mang hoa đang nở [23]

Quả hạch có màu vàng nhạt khi chín, treo trên cây suốt mùa đông và có nhân màu trắng (hình 2) [21]

Hình 2: ảnh cành xoan mang quả [23]

Lá dài đến 50 cm mọc so le, cuống lá với 2 hoặc 3 lần lá phức mọc đối, lá chét mép có răng cưa [21]

Hệ rễ ngang khá phát triển, thường ăn nông và lan rộng, rễ cọc ăn sâu Xoan thường phân cành sớm, khả năng đâm chồi nhanh nên có thể lợi dụng tái sinh chồi được [23]

` Xoan là cây nguyên sản ở các vùng nhiệt đới á và nhiệt đới châu á Xoan

ưa sáng, sinh trưởng nhanh, sau khi trồng từ 6-8 năm có thể thu hoạch được Xoan ưa khí hậu nóng ẩm có 2 mùa: mùa mưa và mùa khô, lượng mưa hàng năm

từ 1000 mm trở lên, những vùng có thể chịu được hạn với lượng mưa hàng năm là

500 mm [23]

Xoan sinh trưởng trên nhiều loại đất khác nhau nhưng thích hợp nhất là

đất pha cát, đất phù sa ven sông có độ phì cao và sâu ẩm

Xoan có thể chịu được muối, lượng muối trong đất từ 0,4-0,5%, đất chua

có độ PH 5-6, hơi kiềm Những nơi đất bạc màu, khô hạn hoặc úng nước đều không thích hợp với xoan [23]

Xoan có khả năng tái sinh (mọc lại từ gốc cũ đã thu hoạch) từ 3-4 lần [18]

Cây trồng 3 - 4 năm đã bắt đầu cho quả Chọn những cây mẹ từ 10 - 20 tuổi mọc từ hạt, có thân thẳng, phân cành cao, tán lá đều, ít cành ngang, không sâu bệnh để thu hái hạt làm giống [23]

Khi gieo ngâm hạt trong nước ấm khoảng 450C trong 8h Nhiệt độ thích hợp cho sự nảy mầm là 16-220C, lượng mưa trung bình từ 1700-2000 mm [19], [20]

Xoan là cây thường phân cành sớm, vì vậy để thúc đẩy cây sinh trưởng, phát triển nhanh về đường kính, chiều cao và tạo ra đoạn thân sử dụng dài, cần tiến hành chăm sóc như: làm cỏ, xới đất, vun gốc kết hợp với bón phân đầy đủ cho cây đồng thời thực hiện tỉa cành nhân tạo ngay từ khi cây 1,5 - 3 tuổi Sau tuổi này không nên tỉa thưa nữa vì lúc này cành đã lớn việc tỉa thưa dễ làm cây bị rỗng ruột [23]

Xoan đâm chồi rất mạnh, cả chồi thân và chồi rễ do vậy có thể tạo cây chồi sau khi khai thác Kinh nghiệm nhân dân cho biết gỗ cây mọc từ chồi thường thẳng, chắc hơn mọc từ hạt nhất là những cây mọc từ chồi rễ [23]

1.2 ý nghĩa kinh tế của cây xoan

Gỗ xoan thuộc nhóm gỗ V, có lõi màu hồng hay nâu nhạt, dác xám trắng,

gỗ nhẹ mềm tỉ trọng 0,565, lực kéo ngang thớ 22kg/cm2, nén dọc thớ 339kg/cm2

[18]

Gỗ xoan nhẹ nhưng khá bền ít bị mối mọt, mềm rất dễ bào nhẵn, cưa xẻ trạm trổ, nhưng có nhược điểm là dễ nứt Nếu được ngâm nước từ 5 - 6 tháng thì trở nên rất bền và khó bị mối mọt cho nên gỗ xoan thường được dùng trong xây dựng nhà cửa, đóng đồ gia dụng, trang trí nội thất và dùng trong điêu khắc [23]

Than và củi xoan cung cấp một lượng nhiệt lớn Ngoài ra lá, rễ xoan còn dùng làm phân xanh, thuốc sát trùng, hạt có thể ép dầu chữa một số bệnh, trồng xoan để che bóng và phòng hộ …[18]

Với đặc điểm sinh hoá như trên cũng như có giá trị về nhiều mặt nên xoan

là loài cây trồng lâm nghiệp có nhiều tiềm năng phát triển rộng rãi

1.3 Tình hình trồng xoan ở nước ta

Theo quyết định của Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn Việt Nam số

16/2005/QĐ- BNN ngày 15/03/2005

Danh mục các loài cây chủ yếu cho trồng rừng sản xuất theo 9 vùng sinh thái lâm nghiệp.Trong đó các vùng trồng xoan như: vùng Tây bắc gồm các tỉnh Lai Châu, Điện Biên, Sơn La, Hòa Bình; vùng Trung du (TD) gồm 6 tỉnh: Lào

Cai, Yên Bái, Hà Giang, Tuyên Quang, Phú Thọ, Vĩnh Phúc; vùng đồng bằng sông Hông (ĐBSH) gồm 10 tỉnh: Hải Phòng, Hải Dương, Bắc Ninh, Hưng Yên,

Hà Nội, Hà Tây, Thái Bình, Nam Định, Hà Nam, Ninh Bình; vùng Bắc Trung Bộ

(BTB) gồm 6 tỉnh: Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế; vùng Nam Trung Bộ (NTB) gồm 7 tỉnh: Quảng Nam, Quảng Ngãi,

Bình Định, Phú Yên, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận; vùng Tây Nguyên (TN) gồm 5 tỉnh: Lâm Đồng, Đắk Nông, Đắc Lắc, Gia Lai, Kon Tum; vùng

Đông Nam Bộ gồm 6 tỉnh: Bà Rịa - Vũng Tàu, Đồng Nai, Bình Dương, Bình Phước, Tây Ninh, Tp Hồ Chí Minh; vùng Tây Nam Bộ (TNB) gồm 12 tỉnh: Long

An, Bến Tre, Đồng Tháp, Sóc Trăng, Vĩnh Long, Cần Thơ,Tiền Giang, Bạc Liêu,

Cà Mau, Kiên Giang, An Giang, Trà Vinh [26]

1.4 Các phương pháp kỹ thuật ứng dụng trong cải tiến di truyền giống xoan

1.4.1 Các kỹ thuật truyền thống

Phương pháp truyền thống như gieo hạt, hom rễ nhưng khả năng cung cấp với số lượng lớn, đúng mùa vụ trồng gặp nhiều khó khăn Mặt khác do phương pháp nhân giống bằng hạt có nhiều nhược điểm như:

Thời gian bảo quản ngắn khoảng 6 - 7 tháng

Cây sinh trưởng và phát triển không đồng đều do có sự phân li trong di truyền

Khả năng kháng sâu bệnh của cây thấp [18]

1.4.2 Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

Ta thấy cây xoan có nhiều tiềm năng phát triển rộng khắp các tỉnh Khi diện tích trồng xoan tăng đồng nghĩa với việc tăng nguồn giống Để khắc phục nhược điểm của nhân giống bằng hạt và hom rễ nên trong thời gian qua trung tâm ứng dụng tiến bộ khoa học và công nghệ đã ứng dụng thành công kỹ thuật nhân giống vô tính cây xoan bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào nhằm giải quyết những khó khăn trên [18]

Tính ưu việt của cây xoan cấy mô là: đảm bảo đặc tính di truyền, ít thoái hoá, cây có khả năng sinh trưởng và phát triển nhanh, có độ đồng đều cao, đảm bảo lượng lớn cây trồng đúng thời vụ [18]

Có thể nói đây là một bước đột phá quan trọng nhằm giải quyết khó khăn

về nhiều mặt, đồng thời sản xuất cung ứng giống cho các đơn vị trồng rừng kỹ thuật, phát triển rừng nguyên liệu, đảm bảo chất lượng, nâng cao năng suất cây trồng [18]

1.5 Cơ sở kĩ thuật của nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.5.1 Tính toàn năng của tế bào

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy các nguyên liệu (tế bào, mô, phôi ) thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo trong điều kiện vô trùng [1]

Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật là một trong những công nghệ quan trọng của công nghệ sinh học, là nền tảng để nghiên cứu và ứng dụng các công nghệ khác trong lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật [1]

Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật được tiến hành ở nước ta từ những năm 1960 tại miền Nam và những năm 1970 tại miền Bắc Tuy nhiên chỉ từ cuối những năm 1980 trở lại đây công nghệ mô tế bào mới phát triển mạnh mẽ và nhanh chóng, nhiều phòng thí nghiệm, nghiên cứu đã được xây dựng và triển khai ở hầu khắp các tỉnh thành trong cả nước [ 22]

Cơ sở nuôi cấy mô tế bào thực vật là tính toàn năng của tế bào, điều này lần đầu tiên được haberlandt (1902) đề cập, ông cho rằng: mỗi tế bào bất kỳ của cơ thể đa bào đều tiềm tàng khả năng phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh

Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hoá

đều mang toàn bộ thông tin di truyền của toàn bộ cơ thể Trong điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh, đó là tính toàn năng của tế bào Tính toàn năng là cơ sở của phương pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật, trên cơ sở đó người ta đã tạo được một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một

tế bào riêng rẽ [1]

Hiện nay, người ta đã thực hiện được khả năng tạo ra được một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ [1]

1.5.2 Sự phân hoá và phản phân hóa của tế bào

Cơ thể thực vật trưởng thành là một tổng thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan khác nhau, có chức năng khác nhau và được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau Tuy nhiên, tất cả các loại tế bào đều bắt nguồn từ tế bào hợp tử ban

đầu Tế bào hợp tử lúc đầu phân chia thành khối tế bào chưa chuyên hóa Các tế bào chưa chuyên hóa này tiếp tục phân chia thành các tế bào chuyên hoá đặc trưng cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau Đó là hiện tượng phân hoá tế bào Tuy nhiên, các tế bào chuyên hóa thành các tế bào chuyên biệt lại không mất sự hoàn toàn biến đổi của mình Trong những điều kiện thích hợp nhất định chúng có thể trở thành dạng tế bào như tế bào ban đầu, nghĩa là ở dạng tế bào chưa chuyên hoá Hiện tượng này gọi là hiện tượng phản phân hóa tế bào [1]

Sự phân hoá và phản phân hóa tế bào là một quá trình hoạt hóa, ức chế hoạt động của các gen Trong một giai đoạn phát triển nhất định của cây, một số gen nào đó đang ở trạng thái ức chế không hoạt động được hoạt hóa để cho ra một tính trạng biểu hiện mới Ngược lại một số gen lại bị ức chế đình chỉ hoạt

động Quá trình hoạt hóa, ức chế diễn ra theo một chương trình đã được lập sẵn trong cấu trúc gen của tế bào, giúp cho sự sinh trưởng, phát triển của cơ thể tế bào thực vật được hài hòa Sự hoạt động hài hoà của tế bào và mô cơ quan còn phụ thuộc vào tế bào nằm trong khối mô, cơ quan của cơ thể Khi tách riêng từng

tế bào, hoặc làm giảm kích thước khối mô sẽ tạo điều kiện cho việc hoạt hóa các gen của tế bào [1]

Kĩ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực chất là điều khiển phát triển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật một cách có định hướng dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào thực vật Để điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào, người ta bổ sung vào môi trường nuôi cấy hai nhóm điều hoà sinh trưởng thực vật là auxin và cytokinin Tỷ lệ hàm lượng của 2 nhóm chất điều hoà sinh trưởng này trong môi trường nuôi cấy mô khác nhau sẽ định hướng cho sự phát sinh hình thái (phát sinh chồi, rễ hoặc mô sẹo) của mô nuôi cấy khác nhau Trong môi trường nuôi cấy, tỷ lệ nồng độ auxin/cytokinin (đại diện là IAA/KIN)

là thấp thì nuôi cấy phát sinh theo hướng tạo chồi, tỷ lệ này cao thì mô nuôi cấy

sẽ tạo ra mô sẹo Mô sẹo là dạng tế bào chưa phân hoá phân chia liên tục và có khả năng hình thành phôi, chồi và cây hoàn chỉnh [1]

1.6 Nuôi cấy mô xoan

1.6.1 Lược sử nuôi cấy mô xoan

Nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được tiến hành trên nhiều đối loại cây như: lạc, đậu tương, cà chua, hoa loa kèn, xoan và đã đạt được những kết quả nhất

định để phục vụ cho nhiều mục đích của con người ví dụ như phục vụ cho chuyển gen, nhân giống để bảo tồn các giống quý [3], [4], [5], [7], [8]

Nông Văn Hải, Lê Xuân Đắc, Hà Hồng Hải, Đào Thị Thu Hà, Nguyễn Thanh Danh, Lê Thị Xuân, Lê Trần Bình đã xây dựng được thành công quy trình nhân nhanh invitro cây Màng tang để bảo tồn giống quý [4]

Nguyễn Thị Phương Thảo, Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Thị Mai đã nghiên cứu nhân nhanh giống hoa loa kèn bằng kỹ thuật nuôi cấy invitro nhằm tạo ra nhiều giống cung ứng cho các nhà sản xuất [8]

Đối với đối tượng là đậu tương Nguyễn Thị Như, Đỗ Tiến Phát, Lê Thị Muội, Đinh Thị Phòng đã nghiên cứu được hệ thống tái sinh cây qua phôi soma

đối với giống ĐT12 Hiệu suất tái sinh đạt 39% và số phôi trung bình là 7,5 Đây

là bước đầu để có thể nghiên cứu việc chuyển gen nhằm nâng cao năng suất và chất lượng của các sản phẩm từ đậu tương[5]

Ngoài ra người ta còn nghiên cứu quy trình tái sinh cây lạc, cây cà chua phục vụ chuyển gen [3], [7]

Xoan là một đối tượng cây lâm nghiệp quan trọng và đã được nghiên cứu nhiều Cho đến nay đã có nhiều công trình của nhiều nhà khoa học nghiên cứu về tái sinh xoan phục vụ chuyển gen như: Ahmad và cộng sự 1990, Thakur và cộng

sự 1998, Vila và cộng sự 2003-2005, mới đây nhất là Sharry và cộng sự 2006 [10], [13], [15], [16]

Năm 1998 Thakur và cộng sự đã nghiên cứu tạo cụm chồi từ lá mầm và

đạt tỉ lệ tạo đa chồi là 74% trong 7-9 tuần nuôi cấy [15]

Năm 2005 Vila và cộng sự đã nghiên cứu tái sinh chồi từ rễ xoan ta với việc sử dụng 0,44 μM BAP cho tỉ lệ tạo cụm chồi là 66,8% không có chất điều hoà sinh trưởng tỉ lệ tạo cụm chồi là 40,3% [16]

Năm 2006 Sharry và Teixeira dasilva sử dụng BAP kết hợp với NAA trong việc cảm ứng tạo chồi và đã tạo được 160-200 chồi/g mẫu cấy [16]

ở Việt Nam, theo báo cáo năm 2007 của Hồ Văn Giảng trường Đại học Lâm nghiệp đã tuyển chọn được 15 cây trội có sản lượng gỗ cao lấy mẫu nuôi cấy mô Đang xác định chỉ tiêu chất lượng có liên quan đến sản lượng và chất lượng gỗ Đã tạo được mẫu sạch invitro xoan ta, bước đầu đã xác định được loại vật liệu nuôi cấy tạo phôi soma và cụm chồi, đã tái sinh được phôi soma và cụm chồi Hiện đang tiến hành nghiên cứu tiếp để hoàn thiện quy trình kĩ thuật tái sinh cây xoan ta thông qua phôi soma và đa chồi [25]

Năm 2007 theo báo cáo của Đoàn Thị Mai Viện khoa học Lâm nghiệp Việt Nam đã tiến hành các thí nghiệm nhân giống sinh dưỡng bằng nuôi cấy mô cho 36 dòng, bước đầu đã tìm ra được môi trường thích hợp cho từng dòng, hệ số nhân chồi đạt từ 5,5 – 9,2 chồi/ cụm chồi [24]

Nghiên cứu ra rễ chồi xoan ta Sharry và Teixeira dasilva (2006), sử dụng IBA ở nồng độ thấp 0,049μM tỉ lệ chồi ra rễ chỉ đạt 17% nhưng khi sử dụng NAA ở nồng độ thấp 0,054μM thì tỉ lệ ra rễ thu được 100% sau 6 tuần nuôi cấy [13]

1.6.2 ảnh hưởng của các thành phần môi trường đến nuôi cấy mô xoan

Thành phần vô cơ bao gồm các muối khoáng (cả đa lượng và vi lượng)

được đưa vào môi trường nuôi cấy Nhu cầu về muối khoáng của tế bào và mô thực vật tách rời là không khác nhiều so với yêu cầu của cây được trồng trong

điều kiện tự nhiên Trong thành phần muối khoáng đa lượng các nguyên tố phải cung cấp là nitơ, kali, photpho…[2]

(NO3-) và amon Nitơ vô cơ được đưa vào môi trường ở 2 dạng là nitrat

NH4+

( ) Đa số các môi trường có chứa dạng nitrat nhiều hơn amon Theo Narayanas Wamy (1994) hàm lượng nitrat trong nhiều môi trường khoảng 25μM còn của amon từ 2 - 20 μM [2]

Trong môi trường MS amon được cung cấp ở dạng muối NH4NO3,, còn môi trường B5 của Gramborg có amon ở dạng muối (NH4)2SO4 - các gốc nitrat

được đưa vào môi trường dưới dạng muối nitrat canxi, nitrat kali hoặc nitrat amon Khi môi trường chỉ chứa nitơ ở dạng dễ gây kiềm hoá môi trường vì thế

Yêu cầu về muối khoáng vi lượng của mô thực vật trong nuôi cấy khá phức tạp và ít được nghiên cứu Tuy nhiên trong nhiều loại môi trường cơ bản đã

được xây dựng, các tác giả đều cung cấp cho môi trường hầu hết các nguyên tố vi lượng cần thiết nhằm mục đích để thúc đẩy sự sinh trưởng và phát triển của mẫu nuôi cấy [2]

Sắt được đưa vào môi trường dạng muối FeSO4.7H2O, Fe2(SO4)3 Nhưng chúng sẽ bị kết tủa và mẫu nuôi cấy rất khó hấp thụ các loại muối này do đó phải cho thêm vào môi trường nuôi cấy Na2EDTA (sodium ethyline diamine tetra acetate) để tạo muối phức Na2FeEDTA (dạng selat) có chưa Na, Fe và được mô nuôi cấy hấp thụ dễ dàng [2]

Ngoài ra các thành phần hữu cơ cũng có ảnh hưởng tới nuôi cấy mô Nguồn cacbon cung cấp cho mẫu nuôi cấy chính là đường sucrose, maltose được sử dụng trong môi trường Bên cạnh vai trò là nguồn năng lượng, vật chất cơ bản, đường còn tạo ra một áp lực thẩm thấu giúp cho mô có sự cân bằng cần thiết với môi trường nuôi cấy [2]

Các tác nhân tạo gel: quyết định trạng thái vật lý của môi trường nuôi cấy Các môi trường chứa đủ hàm lượng chất tạo gel làm cho chúng đông lại ở nhiệt

độ bình thường (25 - 30oC) [2]

Chất gel được sử dụng phổ biến là agar (thạch) gồm một số polysaccharide

được lấy từ rong biển Các polysaccharide kết hợp với các phân tử nước tạo thành polymer và đông lại thành gel ở nhiệt độ 450C Hàm lượng agar sử dụng khoảng 0,5 - 10% tuỳ theo chất lượng của chúng và loại môi trường được sử dụng Nếu nhiều quá gây hạn chế khả năng trao đổi chất giữa cơ thể với môi trường [2]

Một số trường hợp người ta còn bổ sung Adenin nồng độ 40 - 80mg/lit

1.6.3 ảnh hưởng của các chất điều hoà sinh trưởng đến nuôi cấy mô xoan

Các chất điều hoà sinh trưởng có vai trò quan trọng trong kĩ thuật nuôi cấy mô thực vật Bằng cách cung cấp các chất điều hoà sinh trưởng ở một mức thích hợp người nghiên cứu có thể điều khiển được chiều hướng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy Auxin và cytokinin là 2 chất được sử dụng phổ biến nhất Ngoài ra người ta còn sử dụng gibberellin [6]

Hiệu quả tác động của chất điều hoà sinh trưởng phụ thuộc vào nồng độ sử dụng, hoạt tính vốn có của chúng và mẫu nuôi cấy

Auxin có hiệu quả kích thích sự sinh trưởng của tế bào, cùng với cytokinin làm tăng phân bào, hạn chế ưu thế đỉnh, kích thích sự hình thành rễ và tham gia vào cảm ứng phôi vô tính [6]

Các loại Auxin thường sử dụng trong nuôi cấy là:

IAA - Indole acetic acid

IBA - Indole butyric acid

NOA - Naphthoxy acetic acid

NAA - Naphthalene acetic acid

2,4D - 2,4 dichlorophenoxy acetic cid

IAA ít được sử dụng do kém bền với nhiệt và ánh sáng, những trường hợp có bổ sung IAA vào môi trường nghiên cứu thì phải dùng ở nồng độ cao 1,0 - 30mg/l (Dodds anh Roberts 1990) [2]

Theo Thakur và cộng sự (2004), Vila và cộng sự (2005) với việc sử dụng môi trường MS bổ sung thêm IBA ở nồng độ cao vào giai đoạn tiền cảm ứng sẽ tăng cường khả năng ra rễ chồi xoan ta invitro [15], [16], [17]

Các auxin khác có hàm lượng sử dụng từ 0,1 - 2,0 mg/lit - chúng có hiệu quả sinh lý ở nồng độ thấp Tuỳ loại auxin hàm lượng sử dụng và đối tượng nuôi cấy mà tác động sinh lý của auxin là kích thích sinh trưởng của mô, hoạt hoá sự hình thành rễ hay thúc đẩy sự phân chia mạnh mẽ của tế bào dẫn đến hình thành mô sẹo (callus) [2]

Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh trưởng của chồi invitro Các cytokinin có biểu hiện ức chế sự tạo rễ và sự sinh trưởng của mô sẹo nhưng có ảnh hưởng dương tính rõ rệt đến phát sinh phôi vô tính của mẫu nuôi cấy [6]

Các loại cytokinin thường dùng là: Kinetin (KIN), zeatin, 6Bentyl amino purin (6BAP), Isopentenyl adenin (Zip) [2]

Kinetin được nhà khoa học Skoog phát hiện ngẫu nhiên trong khi chiết xuất axit nucleic, kinetin thực chất là một dẫn xuất của bazơ nitơ adenin

BAP là cytokinin được tổng hợp nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn kinetin [6]

Theo báo cáo của Joarder và cộng sự (1993) BAP thực chất là điều hoà sinh trưởng rất tốt cho việc phát sinh chồi cây neem [17]

BAP được sử dụng ở nồng độ 0,44 μM đã cho tỉ lệ tạo cụm chồi từ lá mầm

là 66,8%, BAP tốt hơn các cytokinin khác trong việc cảm ứng phát sinh chồi ở cây gỗ [14], [16]

BAP ở nồng độ 4,44 μM kích thích cảm ứng tạo phôi soma đạt tỉ lệ cao nhất

Hàm lượng sử dụng các loại cytokinin dao động từ 0,1 - 2,0 mg/lit ở những nồng độ cao hơn cytokinin kích thích rõ rệt sự hình thành chồi bất định

đồng thời ức chế mạnh sự tạo thành rễ của chồi nuôi cấy Trong các loại cytokinin nói trên thì KIN và BAP là 2 loại được sử dụng rộng rãi hơn cả [2]

Trong nuôi cấy có loại mẫu chỉ cần auxin hoặc cytokinin hoặc không cần cả 2, đa số các trường hợp sử dụng phối hợp cả auxin và cytokinin ở những trường hợp tỷ lệ khác nhau [2]

Tác động phối hợp của auxin và cytokinin có tác dụng quyết định đối với

sự phát triển và phát sinh hình thái của mô, tế bào Những nghiên cứu của Skoog cho thấy tỷ lệ auxin/cytokinin cao thì thích hợp cho sự hình thành rễ, tỷ lệ thấp

sẽ kích thích quá trình phát sinh chồi Nếu tỷ lệ này ở mức độ cân bằng thì thuận lợi cho phát triển mô sẹo Das (1958) và Nitsel (1968) khẳng định rằng chỉ khi tác động đồng thời của auxin và cytokinin thì mới kích thích mạnh mẽ sự tổng hợp ADN, liên quan đến quá trình phân chia tế bào [9]

1.6.4 ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy

Các mẫu nuôi cấy thường được đặt trong phòng nuôi ổn định về ánh sáng

và nhiệt độ Tất cả các tế bào mô nuôi cấy đều cần ánh sáng trừ một số trường hợp nuôi cấy tạo mô sẹo, nhưng trong quá trình tái sinh và nhân giống của chúng

1.6.5 ảnh hưởng của pH

PH của đa số môi trường nuôi cấy đều được điều chỉnh trong phạm vi từ 5,5 - 6.0 PH dưới 5,5 làm cho agar khó chuyển sang trạng thái gel còn pH > 6,0 agar có thể rất cứng Nếu trong thành phần môi trường nuôi dưỡng có GA3 thì phải điều chỉnh giá trị pH của phạm vi nói trên Vì pH quá kiềm hoặc quá acid,

GA3 sẽ chuyển sang dạng không có hoạt tính (Vanbrapt and piert 1971) Trong quá trình nuôi cấy, pH của môi trường có thể giảm xuống do một số mẫu thực vật sản sinh ra các axit hữu cơ [2]

2.1.2 Dông cô vµ ho¸ chÊt thÝ nghiÖm

C¸c ®iÒu kiÖn m¸y mãc vµ ho¸ chÊt ®−îc phßng C«ng nghÖ tÕ bµo thùc vËt

- ViÖn c«ng nghÖ sinh häc cung cÊp

M«i tr−êng nu«i cÊy, m«i tr−êng c¬ b¶n MS ®−îc sö dông trong nghiªn cøu gåm c¸c muèi ®a l−îng vµ vi l−îng theo Murashige vµ Skoog

Dông cô: nåi khö trïng, tñ cÊy, b×nh tam gi¸c, pipet, lß vi sãng, tñ sÊy, m¸y chuÈn pH

Ho¸ chÊt: m«i tr−êng MS, m«i tr−êng B5 theo Gamborg, sucrose, 8gam agar/lit, pH = 5,8 ( b¶ng 1)