Xây dựng hệ thống tái sinh và ứng dụng trong nghiên cứu chuyển nạp gen HB ag (tạo vỏ virus viêm gan b) vào cây cà chua bi

Đại Học Quốc Gia Tp Hồ Chí Minh TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA [[[ \\\ LÊ HOÀN HẢO XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH VÀ ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU CHUYỂN NẠP GEN HBsAg (TẠO VỎ VIRUS VIÊM GAN B) VÀO CÂY CÀ CHUA BI Lycopersicon esculentum var Cerasiforme Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Nguyễn Hữu Hổ TP HỒ CHÍ MINH, tháng năm 2008 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI VIỆN SINH HỌC NHIỆT ĐỚI – THỦ ĐỨC – TP.HCM - oOo - Cán hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Hữu Hổ Cán chấm nhận xét 1: Cán chấm nhận xét 2: Luận văn thạc sĩ bảo vệ HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày tháng năm 2008 TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA PHÒNG ĐÀO TẠO SĐH CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM ĐỘC LẬP – TỰ DO – HẠNH PHÚC Tp HCM, ngày tháng 08 năm 2008 NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: LÊ HOÀN HẢO Ngày, tháng, năm sinh: 04 – 04 – 1981 Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Phái: Nam Nơi sinh: Tp.HCM MSHV: 03106670 I- TÊN ĐỀ TÀI: XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH VÀ ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU CHUYỂN NẠP GEN HBsAg (TẠO VỎ VIRUS VIÊM GAN B) VÀO CÂY CÀ CHUA BI Lycopersicon esculentum var Cerasiforme II- NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: - Khảo sát khả khử trùng mẫu tối ưu - Hệ thống tái sinh cho cà chua bi F1 TN84 cho tử diệp trụ hạ diệp - Thử kháng Kanamycin tử diệp trụ hạ diệp - Thử khả kháng Kanamycin cà chua bi - Chuyển gen vào cà chua bi - Tách chiết DNA cà chua bi - Kiểm tra diện gen nptII, gen gusA, gen mục tiêu HBsAg cà chua bi mang gen giả định phương pháp phân tích PCR III- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 01/10/2007 IV- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 01/08/2008 V- CÁN BỘ HƯỚNG DẪN : TS NGUYỄN HỮU HỔ CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CN BỘ MÔN QL CHUYÊN NGÀNH TS NGUYỄN HỮU HỔ Nội dung đề cương luận văn thạc sĩ Hội đồng chun ngành thơng qua TRƯỞNG PHỊNG ĐT – SĐH Ngày tháng năm 2008 TRƯỞNG KHOA QL NGÀNH -a- MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN TÓM TẮT MỤC LỤC a DANH MỤC HÌNH .d DANH MỤC BẢNG f DANH MỤC BIỂU ĐỒ g LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY CÀ CHUA 1.1.1 GIÁ TRỊ DINH DƯỠNG 1.1.2 NGUỒN GỐC – PHÂN BỐ - Ý NGHĨA KINH TẾ 1.1.2.1 NGUỒN GỐC 1.1.2.2 PHÂN BỐ 1.1.2.3 Ý NGHĨA KINH TẾ 1.1.3 PHÂN LOẠI THỰC VẬT 1.1.4 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT 1.1.4.1 HỆ RỄ 1.1.4.2 THÂN 1.1.4.3 LÁ 1.1.4.4 HOA 1.1.4.5 QUẢ 12 1.1.4.6 HẠT 14 1.1.5 GIỚI THIỆU MỘT SỐ GIỐNG CÀ CHUA BI 14 1.2 GIỚI THIỆU VIRUS VIÊM GAN B (Hepatitis viruses) 15 1.2.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ VIRUS VIÊM GAN B (Hepatitis B virus – HBV) 15 1.2.1.1 CẤU TRÚC CỦA HBV 16 1.2.1.2 KHẢ NĂNG GÂY BỆNH 18 1.2.2 DỊCH TỄ HỌC VỀ VIÊM GAN B 20 1.2.3 SỰ KHÁC BIỆT CHÍNH GIỮA VIRUS VIÊM GAN A, B VÀ C .21 1.2.4 KHÁNG NGUYÊN BỀ MẶT VIRUS VIÊM GAN B (HBsAg – Hepatitis B surface antigen) 22 1.2.4.1 PROTEIN NHỎ (SHBs) 23 1.2.4.2 PROTEIN TRUNG BÌNH (MHBs) 23 1.2.4.3 PROTEIN LỚN (LHBs) 23 1.2.4.4 CÁC KIỂU SHBs PHỤ 24 1.3 NHÂN GIỐNG VƠ TÍNH IN VITRO 25 1.3.1 NGUYÊN TẮC CỦA NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT 26 1.3.2 ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG 27 -b- 1.4 CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ TẠO DÒNG 28 1.4.1 TẠO DÒNG GEN .28 1.4.2 ENZYME GIỚI HẠN (restriction enzyme) 29 1.4.3 ENZYME NUCLEASE 30 1.4.4 ENZYME NỐI DNA (ligase) 30 1.4.5 ENZYME POLYMERASE 31 1.4.6 VECTOR 31 1.5 GEN CHỌN LỌC VÀ GEN CHỈ THỊ 36 1.5.1 GEN CHỌN LỌC KHÁNG Kanamycin – nptII 36 1.5.2 GEN CHỈ THỊ - GusA 36 1.6 SỰ CHUYỂN GEN NHỜ A TUMEFACIENS .37 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 2.1 VẬT LIỆU 41 2.1.1 NGUYÊN LIỆU THỰC VẬT 41 2.1.2 CHỦNG VI KHUẨN 41 2.1.3 PLASMID 42 2.1.4 MỒI VÀ THANG DNA CHUẨN 43 2.1.4.1 MỒI CHO GEN HBsAg 43 2.1.4.2 THANG DNA CHUẨN 43 2.1.5 HÓA CHẤT VÀ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY 44 2.1.5.1 HÓA CHẤT .44 2.1.5.2 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY 44 2.1.6 THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ TRONG NGHIÊN CỨU 45 2.2 PHƯƠNG PHÁP 45 2.2.1 XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH CHO CÂY CÀ CHUA BI (Lycopersicon esculentum var Cerasiforme) từ tử diệp trụ hạ diệp 45 2.2.1.1 THÍ NGHIỆM 1: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHỬ TRÙNG MẪU TỐI ƯU 45 2.2.1.2 THÍ NGHIỆM 2: NGHIÊN CỨU MƠI TRƯỜNG TÁI SINH TỐI ƯU CHO TỬ DIỆP VÀ TRỤ HẠ DIỆP 45 2.2.2 ỨNG DỤNG MÔI TRƯỜNG TỐI ƯU TRONG CHUYỂN GEN VÀO CÂY CÀ CHUA BI (Lycopersicon esculentum var Cerasiforme) nhờ vi khuẩn A tumefaciens 46 2.2.2.1 THÍ NGHIỆM 3: XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ CHỌN LỌC TỐI ƯU CHUẨN BỊ CHO CÁC THÍ NGHIỆM CHUYỂN GEN 47 2.2.2.2 THÍ NGHIỆM 4: CHUYỂN GEN VÀO CÂY CÀ CHUA BI NHỜ A TUMEFACIENS .47 2.2.3 KIỂM TRA SỰ HIỆN DIỆN CỦA GEN MỤC TIÊU HBsAg BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PCR 49 2.2.3.1 TÁCH CHIẾT DNA NHIỄM SẮC THỂ CÂY CÀ CHUA BI ĐÃ ĐƯỢC CHUYỂN GEN 49 2.2.3.2 PHƯƠNG PHÁP PCR KIỂM TRA SỰ HIỆN DIỆN CỦA GEN nptII, GEN gusA, GEN HBsAg Ở CÂY CÀ CHUA BI MANG GEN GIẢ ĐỊNH 50 -c- CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 3.1 XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH CHO CÂY CÀ CHUA BI (Lycopersicon esculentum var Cerasiforme) từ tử diệp trụ hạ diệp .52 3.1.1 THÍ NGHIỆM 1: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHỬ TRÙNG MẪU TỐI ƯU .52 3.1.1.1 QUY TRÌNH THỰC HIỆN 52 3.1.1.2 NHẬN XÉT – THẢO LUẬN 53 3.1.2 THÍ NGHIỆM 2: NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG TÁI SINH TỐI ƯU CHO TỬ DIỆP VÀ TRỤ HẠ DIỆP 54 3.1.2.1 QUY TRÌNH THỰC HIỆN 54 3.1.2.2 NHẬN XÉT – THẢO LUẬN 56 3.2 ỨNG DỤNG MÔI TRƯỜNG TỐI ƯU TRONG CHUYỂN GEN VÀO CÂY CÀ CHUA BI (Lycopersicon esculentum var Cerasiforme) nhờ vi khuẩn A tumefaciens .65 3.2.1 THÍ NGHIỆM 3: XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ CHỌN LỌC TỐI ƯU CHUẨN BỊ CHO CÁC THÍ NGHIỆM CHUYỂN GEN 65 3.2.1.1 THÍ NGHIỆM 3a: KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ Kanamycin LÊN SỰ TÁI SINH CỦA TỬ DIỆP VÀ TRỤ HẠ DIỆP 65 3.2.1.2 THÍ NGHIỆM 3b: KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ Kanamycin LÊN SỰ TÁI SINH CỦA CÀ CHUA BI CON 69 3.2.2 THÍ NGHIỆM 4: CHUYỂN GEN VÀO CÂY CÀ CHUA BI NHỜ A TUMEFACIENS 72 3.2.2.1 QUY TRÌNH THỰC HIỆN 72 3.2.2.2 NHẬN XÉT – THẢO LUẬN 75 3.3 KIỂM TRA SỰ HIỆN DIỆN CỦA GEN MỤC TIÊU HBsAg BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PCR .79 3.3.1 CHIẾT XUẤT THU NHẬN DNA 80 3.3.2 PHÂN TÍCH PCR 80 3.3.2.1 SỰ HIỆN DIỆN CỦA GEN nptII TRONG CÀ CHUA BI F1 TN84 MANG GEN GIẢ ĐỊNH ĐƯỢC KIỂM TRA BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR 80 3.3.2.2 SỰ HIỆN DIỆNCỦA GEN gusA (uidA) TRONG CÀ CHUA BI F1 TN84 MANG GEN GIẢ ĐỊNH ĐƯỢC KIỂM TRA BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR 81 3.3.2.3 SỰ HIỆN DIỆNCỦA GEN HBsAg TRONG CÀ CHUA BI F1 TN84 MANG GEN GIẢ ĐỊNH ĐƯỢC KIỂM TRA BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR 83 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN 85 4.2 ĐỀ NGHỊ 86 TÀI LIỆU THAM KHẢO 87 PHỤ LỤC & -d- DANH MỤC HÌNH - oOo - SỐ 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 1.10 1.11 1.12 1.13 1.14 1.15 1.16 1.17 2.1 2.2 2.3 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 NỘI DUNG Quả cà chua bi F1 TN84 thương phẩm công ty Trang Nông Trồng cà chua bi máy AeroGarden in black Hoa cà chua bi Cấu trúc không gian virus HBV Virus HBV kính hiển vi điện tử Sự tổ chức gen virus HBV Chu trình tái HBV Sự phản ứng tế bào trước xâm nhiễm virus HBV Sự phân bố địa lý bệnh biêm gan siêu vi B Ba vùng gen S (S, tiền S1, tiền S2) protein gen mã hóa Các protein bề mặt Cấu tạo enzyme DNA polymerase I Cấu trúc phage lamda dạng vòng Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens bám rễ kính hiển vi điện tử Nốt sần rễ tạo Agrobacterium tumefaciens Sơ đồ xâm nhiễm Agrobacterium tumefaciens vào tế bào thực vật Sự chuyển gen vào tế bào thực vật nhờ Agrobacterium tumefaciens Túi hạt giống cà chua bi F1 TN84 công ty Trang Nơng dùng thí nghiệm Cấu trúc plasmid pITB – HBsAg Phương pháp PCR _ Polymerase Chain Reaction Hạt cà chua bi F1 TN84 gieo Cây cà chua bi F1 TN84 sau 14 ngày gieo hạt Cách xử lý lấy mẫu cà chua bi F1 TN84 Sự tái sinh tử diệp trụ hạ diệp cà chua bi F1 TN84 nghiệm thức từ I1 đến I9 Ảnh hưởng kanamycin từ mg/l đến 50 mg/l lên tái sinh mô tử diệp trụ hạ diệp cà chua bi F1 TN84 Ảnh hưởng kanamycin lên phát triển cà chua bi F1 TN84 Các mô chuyển gen tái nhiễm mô chuyển gen không mang gen mục tiêu TRANG 12 15 16 17 18 19 20 23 24 31 33 37 38 39 40 41 42 51 52 53 55 64 68 71 74 -e- 3.8 3.9 3.10 3.11 3.12 3.13 Mô chuyển gen tái nhiễm mô chuyển gen giả định chưa nhiễm Chồi cà chua bi F1 TN84 bị tái nhiễm Chồi cà chua bi F1 TN84 giả định mọc rễ tạo hoàn chỉnh chồi cà chua bi F1 TN84 giả định bị héo úa mà chết sau tháng chọn lọc mơi trường MS có kháng sinh Kết phân tích PCR kiểm tra diện gen nptII cà chua bi F1 TN84 mang gen giả định Kết phân tích PCR kiểm tra diện gen gusA cà chua bi F1 TN84 mang gen giả định Kết phân tích PCR kiểm tra diện gen HBsAg cà chua bi F1 TN84 mang gen giả định 74 77 79 81 82 84 -f- DANH MỤC BẢNG - oOo - SỐ NỘI DUNG TRANG 1.1 2.1 2.2 2.3 3.1 Số lượng hoa tỷ lệ rụng hoa loại hình sinh trưởng Thang λ-HindIII Thang 1Kb Mơi trường khảo sát nghiên cứu tối ưu Kết phương pháp khử trùng Kết khảo sát môi trường tái sinh tử diệp cà chua bi F1 TN84 sau 60 ngày Kết khảo sát môi trường tái sinh trụ hạ diệp cà chua bi F1 TN84 sau 60 ngày Khảo sát ảnh hưởng kanamycin lên tái sinh tử diệp trụ hạ diệp tự nhiên cà chua bi F1 TN84 Khảo sát ảnh hưởng kanamycin lên sống cà chua bi F1 TN84 Kết chuyển gen vào mô tử diệp cà chua bi F1 TN84 11 43 43 46 53 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 57 60 66 70 75 -g- DANH MỤC BIỂU ĐỒ - oOo - SỐ 3.1 3.2 NỘI DUNG Kết khảo sát ảnh hưởng nghiệm thức lên tái sinh tử diệp cà chua bi F1 TN84 sau 60 ngày Kết khảo sát ảnh hưởng nghiệm thức lên tái sinh trụ hạ diệp cà chua bi F1 TN84 sau 60 ngày TRANG 59 62 - Trang 85 - 4.1 KẾT LUẬN: Những kết nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh kết bước đầu chuyển nạp gen HBsAg (tạo vỏ virus viêm gan B) vào cà chua bi F1 TN84 dẫn đến số kết luận sau: a) Về khử trùng mẫu hạt cà chua bi, với khối lượng g, khử trùng cồn 700 30”, rửa lần nước vô trùng; khử trùng tiếp javel (với tỷ lệ nước:javel 1:1) 10’, rửa lại lần nước cất vô trùng Kết thu 100 % mẫu sống b) Về hệ thống tái sinh, sử dụng tử diệp 10 ngày – 14 ngày tuổi làm mẫu nuôi cấy in vitro Môi trường tối ưu _ thí nghiệm _ có hàm lượng cytokinin gấp 2,5 lần auxin; cụ thể, môi trường chứa mg/l IAA (auxin), mg/l BA 0,5 mg/l kinetin (cytokinin) Trong trường hợp, mẫu tử diệp tái sinh in vitro môi trường vừa nêu thu tỷ lệ mẫu tái sinh 93,3 %, số chồi hình thành từ số mẫu tái sinh 3,03 Điều kiện nuôi cấy 260C – 280C, ánh sáng 3000 lux, độ ẩm 60 % - 65 %, thời gian chiếu sáng – 10 giờ/ngày c) Về độ mẫn cảm tự nhiên mẫu tử diệp, mẫu trụ hạ diệp 10 ngày – 14 ngày tuổi, cà chua bi với kanamycin, có điều cần ý: • Sau 60 ngày, nồng độ kanamycin 50 mg/l, mẫu tử diệp, mẫu trụ hạ diệp có tỷ lệ mẫu tái sinh %, số chồi/số mẫu tái sinh • Sau 60 ngày, nồng độ kanamycin 50 mg/l, cà chua bi khơng cịn tử diệp, thân tím thẫm, ngả sang màu vàng hay trắng chết d) Về khả chuyển nạp gen HBsAg gián tiếp nhờ Agrobacterium tumefaciens, cần lưu ý điểm sau: • Giai đoạn chuẩn bị mẫu: Mẫu tử diệp 10 ngày – 14 ngày tuổi chuẩn bị môi trường tối ưu ngày • Giai đoạn ni chung: Trước tiên, 150 mẫu tử diệp chuẩn bị ngâm dịch khuẩn có bổ sung acetosyringone khoảng 30’ (15’ phút lắc HVTH: Lê Hoàn Hảo Kết luận – Đề nghị - Trang 86 - nhẹ, 15’ giữ yên) Sau cùng, mẫu nuôi môi trường tái sinh tối ưu có bổ sung acetosyringone 50 μM 280C, khoảng ngày e) Về khả chọn lọc, sàng lọc: Các chồi mang gen giả định cm – cm chuyển sang mơi trường MS (có bổ sung 50 mg/l kanamycin, 600 mg/l cefotaxime), tần số chuyển nạp gen 6,67 % f) Về kết phân tích PCR: Thu số dịng mang gen mục tiêu 4.2 ĐỀ NGHỊ: Tìm mơi trường tái sinh cho cà chua bi phương pháp quy hoạch thực nghiệm Khảo sát nồng độ cefotaxime tối ưu diệt khuẩn không ức chế sinh trưởng, phát triển cà chua bi mang gen giả định thực chọn lọc, sàng lọc Nghiên cứu khả chuyển nạp gen HBsAg nhờ Agrobacterium tumefaciens qua mẫu tạo mô sẹo Nghiên cứu sâu khả chuyển nạp gen HBsAg nhờ Agrobacterium tumefaciens thời gian nuôi mẫu trước nuôi chung, nồng độ acetosyringone tối ưu, mật độ khuẩn chuẩn bị nuôi chung tối ưu, thời gian nuôi chung vi khuẩn mẫu tối ưu, … Nghiên cứu điều kiện trồng nuôi dưỡng cà chua bi giai đoạn vườn ươm Nghiên cứu khả tồn gen HBsAg cà chua bi giai đoạn vườn ươm khả trì gen qua hệ sau Nghiên cứu thực nghiệm khả kháng viêm gan B chuột nhờ cà chua bi mang gen HBsAg Nghiên cứu tạo dịng Agrobacterium có khả mang gen mục tiêu chín chậm HBsAg Sau đó, tiến hành chuyển nạp vào cà chua bi HVTH: Lê Hoàn Hảo Kết luận – Đề nghị - Trang 87 - TÀI LIỆU THAM KHẢO - - - oOo - - - ♦ TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1- Báo Nông nghiệp Nông thôn Việt Nam, Phương pháp trồng cà chua Cherry, số 1038057, ngày 15/9/2004 2- Bernard Jack, 2007, Công nghệ sinh học phân tử, nguyên lý ứng dụng DNA tái tổ hợp, Nxb Khoa học kỹ thuật 3- Bùi Chí Bửu – Nguyễn Thị Lang, 2000, Di truyền phân tử, Quyển 2, Nxb Nông nghiệp 4- Bùi Chí Bửu – Nguyễn Thị Lang, 2004, Di truyền phân tử, Nxb Nơng nghiệp 5- Bùi Chí Bửu – Nguyễn Thị Lang, 2007, Chọn giống trồng, Phương pháp truyền thống phân tử, Nxb Nông nghiệp 6- Bùi Đại, 2002, Viêm gan B D, Nxb Y học 7- Bùi Trang Việt, 2000, Sinh lý thực vật đại cương, Nxb Đại học quốc gia Tp.HCM 8- Châu Hữu Hầu, 2001, Tìm hiểu viêm gan virus B, Nxb Y học 9- Châu Hữu Hầu, 2006, Viêm gan virus C, Nxb Y học 10- Chu Thị Thơm cộng sự, 2005, Trồng cà chua quanh năm, Nxb Lao động Hà Nội 11- Dương Công Kiên, 2002, Nuôi cấy mô thực vật, Nxb Đại học Quốc gia Tp.HCM 12- Đái Duy Ban, 2006, Công nghệ gen, Nxb Khoa học kỹ thuật 13- Đỗ Lê Thăng – Đinh Hoàn Long, 2007, Chú giải Di truyền học, Nxb Giáo dục 14- Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2005, Sinh học phân tử, Nxb Khoa học kỹ thuật 15- Huỳnh Thị Ngọc Nhân cộng sự, 2004, Thực tập chuyên đề di truyền, Nxb Đại học Quốc gia Tp.HCM 16- Huỳnh Thị Ngọc Nhân cộng sự, 2004, Thực tập sinh học thực vật (phần di truyền), Nxb Đại học Quốc gia Tp.HCM 17- Khuất Duy Thanh, 2006, Kỹ thuật gen, Nxb Khoa học kỹ thuật 18- Lê Huy Chính cộng sự, 2003, Vi sinh y học, Nxb Y học 19- Lê Văn Hồng, 2007, Cơng nghệ ni cấy mơ tế bào thực vật, Nxb Khoa học kỹ thuật 20- Lê Đình Lương, 2004, Kỹ thuật di truyền ứng dụng, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội 21- Lê Duy Thành cộng sự, 2007, Di truyền học, Nxb Khoa học kỹ thuật 22- Nguyễn Như Hiền, 2005, Công nghệ sinh học, tập 5, Nxb Giáo dục HVTH: Lê Hoàn Hảo Tài liệu tham khảo - Trang 88 - 23- Nguyễn Như Hiền, 2006, Giáo trình Sinh học tế bào, Nxb Giáo dục 24- Nguyễn Đình Huyên, 1999, Những điều kỹ thuật di truyền, Nxb Nông nghiệp 25- Nguyễn Thị Lang, 2002, Phương pháp nghiên cứu công nghệ sinh học, Nxb Nông nghiệp 26- Nguyễn Đức Lượng, 2002, Công nghệ gen, Nxb Đại học Quốc gia Tp.HCM 27- Nguyễn Đức Lượng, 2003, Công nghệ tế bào, Nxb Đại học Quốc gia Tp.HCM 28- Nguyễn Văn Thanh, 2007, Sinh học phân tử, Nxb Giáo dục 29- Nguyễn Văn Uyển, 1996, Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật, tập 1,2, Nxb Nông nghiệp 30- Nguyễn Văn Uyển – Nguyễn Tiến Thắng, 2000, Những kiến thức công nghệ sinh học, Nxb Giáo dục 31- Phạm Thị Trân Châu – Phan Tuấn Nghĩa, 2006, Công nghệ sinh học, tập 3, Nxb Giáo dục 32- Phạm Thành Hổ, 2001, Di truyền học, Nxb Giáo dục 33- Phạm Thành Hổ, 2005, Nhập môn công nghệ sinh học, Nxb Giáo dục 34- Tạ Thu Cúc, 2005, Giáo trình kỹ thuật trồng rau, Nxb Hà Nội 35- Trịnh Đình Đạt, 2006, Cơng nghệ sinh học, tập 4, Nxb Giáo dục 36- Võ Thị Thương Lan, 2006, Giáo trình sinh học phân tử tế bào ứng dụng, Nxb Giáo dục 37- Võ Thị Bạch Mai, 2004, Sự phát triển chồi rễ, Nxb Đại học Quốc gia Tp.HCM 38- Vũ Văn Liết cộng sự, 2007, Giáo trình sản xuất giống cơng nghệ hạt giống, Nxb Nông nghiệp 39- Vũ Quang Sáng cộng sự, 2007, Sinh lý thực vật ứng dụng, Nxb Nông nghiệp 40- Vũ Văn Vụ cộng sự, 2005, Công nghệ sinh học, tập 2, Nxb Giáo dục 41- Vũ Văn Vụ cộng sự, 2007, Sinh lý thực vật, Nxb Giáo dục ♦ TÀI LIỆU TIẾNG NƯỚC NGOÀI 42- Baltimore – Berk – Darnell – Loish – Matsudaira – Zipursky, 2003, Molecular Cell Biology, W.H Freeman and Company 43- Brown T.A., 2001, Gene Cloning, Blackwell Science Ltd 44- Turner – McLennan – Bates – White, 1997, Molecular biology, BIOS Scientific Publishers Limited 45- Willey – Sherwood – Woolverton, 2008, Microbiology, The McGraw-Hill Companies HVTH: Lê Hoàn Hảo Tài liệu tham khảo - Trang 89 - ♦ TÀI LIỆU TỪ INTERNET 46- http://www.ars-grin.gov/cgi-bin/npgs/html/taxon.pl?22955 47- http://kontomdost.gov.vn 48- http://www.bio.davidson.edu 49- http://escience.ws/b572/L20/L20.htm 50- http://pathmicro.med.sc.edu/virol/hepatitis-disease.htm 51- http://www.hkma.org/english/cme/onlinecme/200707-fig1gif 52- http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 53- http://www.tuoitre.com.vn 54- http://en.wikipedia.org/wiki/Hepatitis_B HVTH: Lê Hoàn Hảo Tài liệu tham khảo PHỤ LỤC - oOo - KẾT QUẢ TÍNH TỐN BẰNG PHẦN MỀM THỐNG KÊ MSTATC Thí nghiệm 2: Nghiên cứu môi trường tái sinh tối ưu cho tử diệp trụ hạ diệp Title: TU-DIEP-TAI-SINH Function: ANOVA-1 Data case no to 18 One way ANOVA grouped over variable (LL) with values from to Variable (Ty-le-mau-tao-moseo) ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 1349.547 168.693 5.467 0.0100 Within 277.722 30.858 Total 17 1627.269 Coefficient of Variation = 7.39% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 2.00 130.000 65.000 7.07 3.93 2.00 136.670 68.335 2.35 3.93 2.00 146.670 73.335 9.43 3.93 2.00 133.330 66.665 9.43 3.93 2.00 186.670 93.335 4.72 3.93 2.00 170.000 85.000 2.36 3.93 2.00 156.670 78.335 2.35 3.93 2.00 150.000 75.000 2.36 3.93 2.00 143.330 71.665 2.35 3.93 -Total 18.00 1353.340 75.186 9.78 2.31 Within 5.56 Bartlett's test Chi-square = 4.598 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.800 RANGE Error Mean Square = 30.86 Error Degrees of Freedom = No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 12.57 at alpha = 0.050 Original Order Ranked Order Mean = 65.00 D Mean = 93.34 Mean = 68.34 CD Mean = 85.00 Mean = 73.34 BCD Mean = 78.34 Mean = 66.67 CD Mean = 75.00 Mean = 93.34 A Mean = 73.34 Mean = 85.00 AB Mean = 71.67 Mean = 78.34 BC Mean = 68.34 Mean = 75.00 BCD Mean = 66.67 Mean = 71.67 CD Mean = 65.00 A AB BC BCD BCD CD CD CD D ============================================================ Title: TU-DIEP-TAI-SINH Function: ANOVA-1 Data case no to 18 One way ANOVA grouped over variable (LL) with values from to Variable (So-choi/So-mau-tai-sinh) ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 1.867 0.233 2.135 0.1398 Within 0.984 0.109 Total 17 2.851 Coefficient of Variation = 13.25% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 2.00 5.240 2.620 0.00 0.23 2.00 4.800 2.400 0.92 0.23 2.00 4.330 2.165 0.05 0.23 2.00 4.110 2.055 0.01 0.23 2.00 6.050 3.025 0.18 0.23 2.00 5.880 2.940 0.25 0.23 2.00 5.320 2.660 0.01 0.23 2.00 4.820 2.410 0.03 0.23 2.00 4.380 2.190 0.20 0.23 -Total 18.00 44.930 2.496 0.41 0.10 Within 0.33 Bartlett's test Chi-square = 25.589 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.000 RANGE Error Mean Square = 0.1430 Error Degrees of Freedom = No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 0.8554 at alpha = 0.050 Original Order Ranked Order Mean = 2.260 ABC Mean = 3.030 Mean = 2.400 ABC Mean = 2.940 Mean = 2.170 BC Mean = 2.660 Mean = 2.060 C Mean = 2.470 Mean = 3.030 A Mean = 2.400 Mean = 2.940 AB Mean = 2.260 Mean = 2.660 ABC Mean = 2.170 Mean = 2.470 ABC Mean = 2.140 Mean = 2.140 BC Mean = 2.060 A AB ABC ABC ABC ABC BC BC C ============================================================ Title: TRU-HA-DIEP-TAI-SINH Function: ANOVA-1 Data case no to 18 One way ANOVA grouped over variable (LL) with values from to Variable (Ty-le-mau-tao-moseo) ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 2889.467 361.183 4.302 0.0216 Within 755.644 83.960 Total 17 3645.111 Coefficient of Variation = 20.62% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE 2.00 106.670 53.335 9.43 6.48 2.00 86.660 43.330 14.14 6.48 2.00 73.330 36.665 4.72 6.48 2.00 113.340 56.670 14.14 6.48 2.00 93.330 46.665 9.43 6.48 2.00 126.670 63.335 4.72 6.48 2.00 86.670 43.335 4.72 6.48 2.00 80.000 40.000 9.43 6.48 2.00 33.330 16.665 4.72 6.48 -Total 18.00 800.000 44.444 14.64 3.45 Within 9.16 Bartlett's test Chi-square = 2.485 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.962 RANGE Error Mean Square = 83.96 Error Degrees of Freedom = No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 20.73 at alpha = 0.050 Original Order Ranked Order Mean = 53.34 AB Mean = 63.34 Mean = 43.33 AB Mean = 56.67 Mean = 36.67 BC Mean = 53.34 Mean = 56.67 AB Mean = 46.67 Mean = 46.67 AB Mean = 43.34 Mean = 63.34 A Mean = 43.33 Mean = 43.34 AB Mean = 40.00 Mean = 40.00 B Mean = 36.67 Mean = 16.67 C Mean = 16.67 A AB AB AB AB AB B BC C ============================================================ Title: TRU-HA-DIEP-TAI-SINH Function: ANOVA-1 Data case no to 18 One way ANOVA grouped over variable (LL) with values from to Variable (So-choi/So-mau-tai-sinh) ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 2.444 0.305 9.693 0.0013 Within 0.284 0.032 Total 17 2.727 Coefficient of Variation = 20.67% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 2.00 3.010 1.505 0.09 0.13 2.00 2.340 1.170 0.00 0.13 2.00 2.170 1.085 0.12 0.13 2.00 1.800 0.900 0.14 0.13 2.00 1.550 0.775 0.15 0.13 2.00 2.020 1.010 0.30 0.13 2.00 1.240 0.620 0.07 0.13 2.00 0.830 0.415 0.02 0.13 2.00 0.500 0.250 0.35 0.13 -Total 18.00 15.460 0.859 0.40 0.09 Within 0.18 Bartlett's test - Chi-square = 12.368 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.136 RANGE Error Mean Square = 0.03200 Error Degrees of Freedom = No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 0.4047 at alpha = 0.050 Original Order Ranked Order Mean = 1.510 A Mean = 1.510 A Mean = 1.170 AB Mean = 1.170 AB Mean = 1.090 B Mean = 1.090 B Mean = 0.9000 BC Mean = 1.010 BC Mean = 0.7800 BCD Mean = 0.9000 BC Mean = 1.010 BC Mean = 0.7800 BCD Mean = 0.6200 CDE Mean = 0.6200 CDE Mean = 0.4200 DE Mean = 0.4200 DE Mean = 0.2500 E Mean = 0.2500 E ============================================================ ============================================================ Thí nghiệm 3: Xác định nồng độ chọn lọc tối ưu chuẩn bị cho thí nghiệm chuyển gen Title: MAN-CAM-TUDIEP-TUNHIEN-VOI-KANAMYCIN Function: ANOVA-1 Data case no to 20 One way ANOVA grouped over variable (LL) with values from to 20 Variable (Ty-le-mau-tao-moseo-o-mt-kanamycin) ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 29309.200 3256.578 144.737 0.0000 Within 10 225.000 22.500 Total 19 29534.200 Coefficient of Variation = 9.82% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 2.00 193.000 96.500 4.95 3.35 2.00 187.000 93.500 4.95 3.35 2.00 173.000 86.500 4.95 3.35 2.00 153.000 76.500 4.95 3.35 2.00 127.000 63.500 9.19 3.35 2.00 93.000 46.500 4.95 3.35 2.00 40.000 20.000 4.24 3.35 2.00 0.000 0.000 0.00 3.35 2.00 0.000 0.000 0.00 3.35 10 2.00 0.000 0.000 0.00 3.35 -Total 20.00 966.000 48.300 39.43 8.82 Within 4.74 Bartlett's test Chi-square = 36.045 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.000 RANGE Error Mean Square = 22.50 Error Degrees of Freedom = 10 No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 10.57 at alpha = 0.050 Original Order Ranked Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean 1= 2= 3= 4= 5= 6= 7= 8= 9= 10 = 96.50 A Mean = 93.50 A Mean = 86.50 AB Mean = 76.50 B Mean = 63.50 C Mean = 46.50 D Mean = 20.00 E Mean = 0.0000 F Mean = 0.0000 F Mean = 0.0000 F Mean 10 = 96.50 A 93.50 A 86.50 AB 76.50 B 63.50 C 46.50 D 20.00 E 0.0000 F 0.0000 F 0.0000 F ============================================================ Title: MAN-CAM-MO-TUNHIEN-VOI-KANA Function: ANOVA-1 Data case no to 20 One way ANOVA grouped over variable (LL) with values from to 10 Variable (So-shoi/So-mau-taisinh) ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 33.093 3.677 53.820 0.0000 Within 10 0.683 0.068 Total 19 33.776 Coefficient of Variation = 19.68% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 2.00 7.020 3.510 0.72 0.18 2.00 6.070 3.035 0.32 0.18 2.00 5.070 2.535 0.12 0.18 2.00 3.910 1.955 0.08 0.18 2.00 2.740 1.370 0.20 0.18 2.00 1.410 0.705 0.04 0.18 2.00 0.340 0.170 0.03 0.18 2.00 0.000 0.000 0.00 0.18 2.00 0.000 0.000 0.00 0.18 10 2.00 0.000 0.000 0.00 0.18 -Total 20.00 26.560 1.328 1.33 0.30 Within 0.26 Bartlett's test Chi-square = 32.162 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.000 RANGE Error Mean Square = 0.06800 Error Degrees of Freedom = 10 No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 0.5810 at alpha = 0.050 Original Order Ranked Order Mean = 3.510 A Mean = 3.510 A Mean = 3.040 AB Mean = 3.040 AB Mean = 2.540 BC Mean = 2.540 BC Mean = 1.960 C Mean = 1.960 C Mean = 1.370 D Mean = 1.370 D Mean = 0.7100 E Mean = 0.7100 E Mean = 0.1700 EF Mean = 0.1700 EF Mean = 0.0000 F Mean = 0.0000 F Mean = 0.0000 F Mean = 0.0000 F Mean 10 = 0.0000 F Mean 10 = 0.0000 F ============================================================ Title: MAN-CAM-TRU-HA-DIEP-TUNHIEN-VOI-KANA Function: ANOVA-1 Data case no to 20 One way ANOVA grouped over variable (LL) with values from to 20 Variable (Ty-le-mau-tao-moseo) ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 9739.250 1082.139 78.133 0.0000 Within 10 138.500 13.850 Total 19 9877.750 Coefficient of Variation = 18.84% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 2.00 119.000 59.500 10.61 2.63 2.00 105.000 52.500 2.12 2.63 2.00 79.000 39.500 2.12 2.63 2.00 53.000 26.500 2.12 2.63 2.00 26.000 13.000 2.83 2.63 2.00 13.000 6.500 2.12 2.63 2.00 0.000 0.000 0.00 2.63 2.00 0.000 0.000 0.00 2.63 2.00 0.000 0.000 0.00 2.63 10 2.00 0.000 0.000 0.00 2.63 -Total 20.00 395.000 19.750 22.80 5.10 Within 3.72 Bartlett's test Chi-square = 50.287 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.000 RANGE Error Mean Square = 13.85 Error Degrees of Freedom = 10 No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 8.292 at alpha = 0.050 Original Order Mean = 59.50 A Mean = 52.50 A Mean = 39.50 B Mean = 26.50 C Mean = 13.00 D Mean = 6.500 DE Mean = 0.0000 E Mean = 0.0000 E Mean = 0.0000 E Mean 10 = 0.0000 E Ranked Order Mean = 59.50 A Mean = 52.50 A Mean = 39.50 B Mean = 26.50 C Mean = 13.00 D Mean = 6.500 DE Mean = 0.0000 E Mean = 0.0000 E Mean = 0.0000 E Mean 10 = 0.0000 E ============================================================ Title: MAN-CAM-TRU-HA-DIEP-TUNHIEN-VOI-KANA Function: ANOVA-1 Data case no to 20 One way ANOVA grouped over variable (LL) with values from to 10 Variable (So-choi/So-mau-tai-sinh) ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 2.978 0.331 199.913 0.0000 Within 10 0.017 0.002 Total 19 2.994 Coefficient of Variation = 11.57% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 2.00 2.220 1.110 0.06 0.03 2.00 1.490 0.745 0.06 0.03 2.00 1.330 0.665 0.08 0.03 2.00 0.990 0.495 0.05 0.03 2.00 1.000 0.500 0.03 0.03 2.00 0.000 0.000 0.00 0.03 2.00 0.000 0.000 0.00 0.03 2.00 0.000 0.000 0.00 0.03 2.00 0.000 0.000 0.00 0.03 10 2.00 0.000 0.000 0.00 0.03 -Total 20.00 7.030 0.352 0.40 0.09 Within 0.04 Bartlett's test Chi-square = 25.275 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.000 RANGE Error Mean Square = 0.002000 Error Degrees of Freedom = 10 No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 0.09965 at alpha = 0.050 Original Order Ranked Order Mean = 1.110 A Mean = 1.110 A Mean = 0.7500 B Mean = 0.7500 B Mean = 0.6700 B Mean = 0.6700 B Mean = 0.5000 C Mean = 0.5000 C Mean = 0.5000 C Mean = 0.5000 C Mean = 0.0000 D Mean = 0.0000 D Mean = 0.0000 D Mean = 0.0000 D Mean = 0.0000 D Mean = 0.0000 D Mean = 0.0000 D Mean = 0.0000 D Mean 10 = 0.0000 D Mean 10 = 0.0000 D ============================================================ ============================================================ Phụ lục - oOo - THÀNH PHẦN MƠI TRƯỜNG SỬ DỤNG TRONG THÍ NGHIỆM Mơi trường MS: - Sucrose: 30 g/l - Macro: 50 ml/l - Micro: ml/l - Vitamin: ml/l - Sắt (dung dịch EDTA): ml/l Agar: 10 mg/l pH = 5,5 – 5,8 Trong đó: 1.1 Macro MS: CaCl2 MgSO4 không ngậm nước: CaCl2 x (mg/1 l) x 20 (g/1 l) x 20 (g/2 l) 332,02 6,6 13,3 KH2PO4 170 3,4 6,8 KNO3 1900 38,0 76,0 MgSO4 180,54 3,6 7,2 NH4NO3 1650 33,0 66,0 CaCl2 MgSO4 có ngậm nước: x (mg/1 l) x 20 (g/1 l) x 20 (g/2 l) CaCl2.2H2O 439,6 8,8 17,6 KH2PO4 170 3,4 6,8 KNO3 1900 38,0 76,0 MgSO4.7H2O 369,54 7,4 14,8 NH4NO3 1650 33,0 66,0 1.2 Micro MS: Pha lít stock: - CoCl2: 12,5 mg - CuSO4: 12,5 mg - H3BO3: 3100 mg - KI: 415 mg - MnSO4: 8450 mg - Na2MoO4: 125 mg - ZnSO4: 4300 mg 1.3 Vitamin MS: Hóa chất Trọng lượng (mg/l) Stock x 500 (mg pha 500 ml) Glycin 500 Myo inositol 100 25000 Nicotinic acid 0,5 125 Pyridoxin HCl 0,5 125 Thiamine HCl 1,0 250 Môi trường LB: Hỗn hợp muối LB chứa thành phần: Tryptone: 10,00 g/l Sodium Chloride: 10,00 g/l Dịch chiết nấm men: 5,00 g/l pH = 7,2 Hỗn hợp dạng bột pha theo nồng độ 25,00 g/l nước cất Môi trường LB dùng agar bacteriological với nồng độ 1,0 % w/v agar khoáng chất, ức chế tối thiểu lên khuếch tán kháng sinh Môi trường AB x20: gồm: - Dung dịch đệm (g): 250 ml 500 ml K2HPO4.3H2O: 19,65 g 39,3 g NaH2PO4.3H2O: 5,75 g 11,5 g - Dung dịch muối AB (g): KCl: 0,75 g 1,5 g NH4Cl: g 10 g MgSO4.7H2O: 1,5 g g CaCl2.2H2O: 0,05 g 0,1 g FeSO4.7H2O: 0,0125 g 0,0250g - Dung dịch glucose: g glucose + 180 ml nước cất: 18 ml/ erlen 20 ml ⇒ Dung dịch AB: ml dung dịch đệm AB + ml dung dịch muối AB + 18 ml dung dịch glucose ⇒ 20 ml dung dịch AB pH = LÝ LỊCH TRÍCH NGANG - oOo - - Họ tên: Lê Hoàn Hảo - Ngày, tháng, năm sinh: 04 – 04 – 1981 Nơi sinh: Tp HCM - Địa liên lạc: 336/27/8_Nguyễn Văn Lng, P.12, Q.6, Tp.HCM Q TRÌNH ĐÀO TẠO: ♦ 2001 – 2005: Học tốt nghiệp Trường Đại Học Mở TP.HCM ♦ 2006 – 2008: Học viên Cao học Trường Đại Học Bách Khoa TP.HCM QUÁ TRÌNH CƠNG TÁC: ♦ 2005 – 2006: Cơng tác vườn ươm Phịng Cơng nghệ Tế Bào Thực Vật – Viện Sinh học Nhiệt Đới – Thủ Đức – Tp.HCM ♦ 2006 – đến nay: Quản lý vườn ăn số 142, Đường 600, Xã Phú An, Huyện Tân Phú, Tỉnh Đồng Nai ... Phịng Cơng Nghệ Gen, Viện Sinh học Nhiệt đới, thực đề tài: “XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH VÀ ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU CHUYỂN NẠP GEN HBsAg (TẠO VỎ VIRUS VIÊM GAN B) VÀO CÂY CÀ CHUA BI Lycopersicon... cho tái sinh cà chua bi, từ thực bước chuyển gen HBsAg vào cà chua bi nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Giới hạn đề tài tập trung xây dựng hệ thống tái sinh in vitro, thực bước chuyển gen vào. .. tiền chất vitamin A vào lúa (lúa vàng), gen mã hóa monellin vào cà chua, rau xà lách để làm tăng độ đường, Tuy nhiên, chuyển nạp gen HBsAg (tạo vỏ virus viêm gan B) vào cà chua bi chưa có cơng bố