Bài viết khảo sát đột biến gen pre-S trên bệnh nhân (BN) viêm gan B mạn tính (VGBMT) và ung thư gan (UTG). Bài viết phát hiện đột biến gen pre-S bằng giải trình tự gen trực tiếp trên hệ thống CEQ 8800 trên 148 BN được chia thành 2 nhóm: 94 BN UTG và 54 BN VGBMT.
Trang 1NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN pre-S Ở BỆNH NHÂN
VIÊM GAN B MẠN TÍNH VÀ UNG THƯ GAN
Nguyễn Trọng Chính*
TÓM TẮT
Mục tiêu: khảo sát đột biến gen pre-S trên bệnh nhân (BN) viêm gan B mạn tính (VGBMT)
và ung thư gan (UTG) Đối tượng và phương pháp: phát hiện đột biến gen pre-S bằng giải trình
tự gen trực tiếp trên hệ thống CEQ 8800 trên 148 BN được chia thành 2 nhóm: 94 BN UTG và
54 BN VGBMT Kết quả: nồng độ HBV ADN ở nhóm VGBMT cao hơn có ý nghĩa so với nhóm
UTG (3,1 x 109 ± 1,05 x 109 so với 1,2 x 108 - 4,6 x 109 copies/ml, p< 0,001) 44/148 mẫu
(29,7%) có đột biến gen cùng pre-S Đột biến tại vị trí bắt đầu của đoạn pre-S2 phổ biến nhất (42%), tiếp theo là đột biến mất đoạn pre-S2 (37,2%), vùng khởi động pre-S (14,1%) và vùng
khởi động pre-S2 (12,8%) Đột biến gen tại tất cả các vị trí ở nhóm UTG cao hơn có ý nghĩa so với nhóm VGBMT, trừ đột biến vùng khởi động pre-S2 (p < 0,05) Nguy cơ UTG ở BN có đột
biến gen pre-S cao hơn có ý nghĩa so với BN không mang gen đột biến (trừ đột biến đoạn khởi
động gen pre-S2), OR: 2,2 - 6,6 Kết luận: đột biến gen pre-S là một yếu tố nguy cơ tiến triển UTG trên BN nhiễm viêm gan virut B
* Từ khóa: Gen pre-S; Đột biến; Viêm gan B mạn tính; Ung thư gan
Investigation the pre-S Gene Mutation in Chronic Hepatitis B and Hepatocellular Carcinoma
Summary
Objectives: To investigate the mutations of pre-S gene in chronic hepatitis B (CHB) and
hepatocellular carcinoma (HCC) Subjects and methods: Pre-S gene mutation was identified by direct sequencing in automatic system CEQ 8800 and 148 patients were divided into two
groups: 94 patients with HCC and 54 patients with CHB Result: HBV DNA level in CHB was significant higher than in HCC group (3.1 x 10 9 ± 1.05 x 10 9 vs 1.2 x 10 8 ± 4.6 x 109 copies/ml,
p < 0.001) 44/148 patients (29.7%) carried the pre-S gene mutations Point mutations at start
codon of pre-S2 was most frequent with 42%, following by pre-S2 deletion (37.2%), pre-S1 promoter (14.1%) and pre-S2 promoter (12.8%) Pre-S gene mutations in all, but pre-S2 promoter were significant higher in HCC group compared to CHB group (p < 0.05) Risk of HCC
in patients having pre-S gene mutations is significant higher compared to wild type with OR from
2.2 to 6.6 Conclusion: pre-S gene mutation is a risk factor for development of HCC in patients infected with HBV
* Key words: pre-S gene; Mutation; HBV; HCC
* Học viện Quân y
Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Trọng Chính (chinhvmmu@gmail.com)
Ngày nhận bài: 20/02/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 18/03/2017
Ngày bài báo được đăng: 23/03/2017
Trang 2ĐẶT VẮN ĐỀ
Nhiễm virut viêm gan B có thể gây nhiều
bệnh cảnh khác nhau từ người mang virut
không triệu chứng đến viêm gan cấp tự
hồi phục, VGBMT, xơ gan, UTG và có thể
tiến triển ngay thành viêm gan tối cấp
Nguyên nhân dẫn đến tình trạng đó cho
đến nay vẫn còn nhiều tranh luận, kết quả
nghiên cứu còn nhiều điểm chưa thống
nhất Nguyên nhân được quan tầm nhiều
nhất trong thời gian gần đây là do chính
sự khác nhau của bộ gen của viêm gan
virut B
Viêm gan virut B là một virut có lõi
ADN và virut nhân lên theo cơ chế sao
chép ngược Mặc dù bộ gen của viêm
gan virut B không lớn, khoảng 3,2 kb,
nhưng đây là một loại virut có nhiều đột
biến gen Nguyên nhân là do enzvm
polymerase là một enzym đa chức năng,
vừa có hoạt tính cửa ARNnase vừa có
hoạt tính ADNnase, nên virut này có khả
năng tái bản với tốc độ cao trong tế bào
lây nhiễm Đồng thời, enzym này không
có hoạt tính đọc sửa nên trong quá trình
tái bản bộ gen virut thường xảy ra các đột
biến với tỷ lệ cao, ước tính từ 3,2 x 10-5
đến 2,7 x 10-3 thay thế nucleotid tại mỗi vị
trí trong 1 năm [2, 3] Kết quả là quần thể
HBV có thể tiến hóa nhanh hơn hầu hết
các ADN virut khác trong khả năng đáp
ứng với tác nhân môi trường và đột biến
xuất hiện áp lực của những tác nhân này,
có thể là hiện tượng xảy ra thường
xuyên
Khung đọc mở (ORF) của gen - S khá
dài, chứa 3 codon khởi đầu ATG, chia
ORF này thành 3 vùng pre-S1, pre-S2 và
S mã hóa cho 3 dạng protein bề mặt hay
còn gọi là các kháng nguyên bề mặt
(HBsAg) của virut: kháng nguyên S nhỏ
mã hóa bởi gen S (226 amino axít-a.a),
kháng nguyên S trung bình mã hóa bởi
gen pre-S2/S (thêm 55 a.a so với kháng
nguyên S nhỏ), kháng nguyên S lớn mã
hóa bởi gen pre-Sl/pre-S2/S (tùy thuộc
vào từng kiểu huyết thanh (serotype) thêm 108 a.a hoặc 119 a.a so với kháng
nguyên S trung bình) Gene pre-S là một
gen có tần suất biến đổi gen lớn nhất trong toàn bộ bộ gen của viêm gan virut
B Sự thay đổi của kiểu gen cũng như mức độ đáp ứng miễn dịch thay đổi với
cơ thể phụ thuộc nhiều vào sự biến đổi gen này Gần đâv, người ta thấv đột biến
gen pre-S có liên quan chặt chẽ đến tiến
triển ung thư gan trên BN nhiễm viêm gan
virut B [4] Đột biến mất đoạn pre-S sẽ
gây lưu giữ một lượng lớn protein vỏ trong bào tương tế bào gan, từ đó dẫn tới kích thích các yếu tố khởi động tế bào bằng áp lực bất lợi trên hệ lưới nội sinh [5]
Mối tương tác giữa đột biển mất đoạn
pre-S, đột biến vùng khởi động lõi và
vùng tiền lõi đã được nghiên cứu nhiều Kết quả cho thấy đột biến mất đoạn và đột biến vùng khởi động pre-S1 là những yếu tố liên quan đến tiến triển bệnh nặng như xơ gan và UTG Phân tích đa biến cho thấy khi kết hợp các đột biến trên
1 BN, nguy cơ tiến triển thành ung thư cao hơn rất nhiều [6]
Tại Việt Nam, chưa có nhiều nghiên
cứu khảo sát đột biến gen pre-S trên
nhóm bệnh do viêm gan virut B gây ra Vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu này
nhằm: Khảo sát đội biến gen pre-S trên
BN VGBMT và UTG
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1 Đối tượng nghiên cứu
Tổng số 148 BN được chia thành 2 nhóm: 94 BN UTG và 54 BN VGBMT
Trang 3* Tiêu chuẩn lựa chọn BN UTG:
- Lâm sàng: BN mệt mỏi, ăn uống
kém, gày sút cân nhanh Có thể có các
triệu chứng khác như gan to dưới bờ
sườn, bờ sắc, mật độ chắc, có u cục lổn
nhổn nổi trên bề mặt, đau khi thăm khám
- Xét nghiệm: có thể có một trong
những dấu hiệu như AFP tăng cao,
bilirubin trực tiếp và gián tiếp, AST, ALT
có thể tăng Siêu âm phát hiện khối tăng
âm khu trú hoặc lan tỏa Chụp CT hoặc
MRI xác định có khối u Sinh thiết gan xét
nghiệm làm tế bào học hoặc/và mô bệnh
học cho kết quả xác định có UTG và mức
độ biệt hoá kèm theo Xét nghiệm huyết
thanh có HBsAg (+)
* Tiêu chuẩn lựa chọn BN VGBMT:
- BN được xác định có HBsAg (+) sau
thời gian > 6 tháng
- Các triệu chứng lâm sàng và cận lâm
sàng có biểu hiện tổn thương mô gan
Hiện tại có biểu hiện lâm sàng viêm gan
như mệt mỏi, chán ăn, gan to dưới bờ sườn,
mật độ chắc, có thể có vàng da HBc - Ab
- IgG (+), men ALT có thể tăng cao hơn
2 lần bình thường, bilirubin máu và nước tiểu có thể bình thường hoặc tăng
- Sinh thiết gan làm mô bệnh học cho thấy hình ảnh viêm gan mạn tính
2 Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu mô tả cắt ngang Các xét nghiệm về huyết học, sinh hóa, miễn dịch, chẩn đoán hình ảnh được tiến hành thường quy tại các khoa xét nghiệm, Bệnh viện TWQĐ 108 Chọc hút tế bào gan tiến hành tại Khoa Tiêu hóa, xử lý mẫu bệnh phẩm và xét nghiệm tế bào học tại Khoa Giải phẫu Bệnh lý, Bệnh viện TWQĐ 108 Xét nghiệm giải trình tự gen
pre-S được tiến hành tại Khoa Sinh học
Phân tử, Bệnh viện TWQĐ 108
* Phân tích thống kê:
Các số liệu được phân tích bằng thuật toán non-parametric Mann-Whitney U-test, chi bình phương (chi (2) test, so sánh không đối xứng t-test, so sánh 2 tỷ lệ, 2
số trung bình bằng các phần mềm Statview, version 4.57 (www.statview.com)
và chương trình STATA (www.stata.com)
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1 Đặc điểm chung các nhóm nghiên cứu
Bảng 1: So sánh một số chỉ số cận lâm sàng thông thường giữa các nhóm
Trang 4AST (U/L) 251 ± 18,3 110,8 ± 107,4 < 0,05
Tổng số có 118/148 BN (79,8%) nam và 30/148 BN (20,2%) nữ Tuy nhiên, giữa các nhóm không có sự khác biệt về tỷ lệ nam/nữ Tuổi ở nhóm UTG cao hon so với nhóm VGBMT (p < 0,05) Không có khác biệt giữa 2 nhóm nghiên cứu về tình trạng mang kháng nguyên e và nồng độ protein toàn phần, albumin, bilirubin toàn phần Tiểu cầu và prothrombin ở nhóm UTG thấp hơn, nhưng AST, ALT lại cao hơn có ý nghĩa so với nhóm VGBMT
2 Nồng độ HBV ADN trên các nhóm nghiên cứu
Hình 1: So sánh nồng độ HBV ADN trên các nhóm nghiên cứu
Nồng độ HBV ADN ở nhóm VGBMT cao hơn có ý nghĩa so với nhóm UTG (3,1 x
109 ± 1,05 x 109 so với 1,2 x 108 ± 4,6 x 109 copies/ml, p < 0,001)
3 Đột biến gen pre-S
* Các loại đột biến gen pre-S được tìm thấy:
Để đảm bảo kết quả giải trình tự là chính xác, chúng tôi tiến hành giải trình tự vùng
pre-S bằng cả mồi xuôi và mồi ngược, dùng phần mềm CEQ 8800 và BioEdit để xác
định chính xác chuỗi trình tự giải được Kết quả đã tìm thấy các đột biến điểm tại
codon khởi động gen pre-S2 như đã được mô tả trong bài báo trước đây [1] và một số
đột biến mất đoạn, được trình bày ở hình sau:
6E9 5E9 4E9 3E9 2E9 1E9
0
p< 0,001
T
Trang 5Hình 2: Kết quả phân tích gen phát hiện đột biến mất đoạn pre-S trên mẫu k13
So với trình tự không có đột biến, mẫu bệnh k13 có nhiều điểm đột biến xen lẫn đột
biến mất đoạn Hàng thứ nhất chỉ trình tự của mẫu k13 có đoạn gen bị mất so với mẫu
bình thường được trình bày ở 2 hàng dưới
Từ kết quả phân tích trên máy giải trình tự gen CEQ 8800, chúng tôi tiến hành so
sánh với Ngân hàng Gen (Genebank), kết quả được trình bày ở hình 3
> gb [G0355371.1] Hepatitis B virus isolate migrant 1208 large S protein (S),
middle S protein (S), and small S protein (S) genes, complete cds
Length = 1132
Score = 813 bits (440), Expect = 0,0
Identities = 514/547 (94%), Gaps = 16/547 (3%)
Strand = plus/plus
Hình 3: Kết quả phân tích so sánh với Ngân hàng Gen
phát hiện đột biến trên mẫu k13
Kết quả phân tích cho thấv so với mẫu chuẩn, mẫu nghiên cứu có đột biến mất
đoạn (trong khung) phù hợp với tín hiệu trên hình 2
Trang 62 So sánh tần suất xuất hiện đột biến gen pre-S nói chung trên các nhóm
nghiên cứu
Bảng 2: Tần suất xuất hiện đột biến chung trên các nhóm
44/148 mẫu (29,7%) phân tích có đột biến gen vùng pre-S; tỷ lệ đột biến xuất hiện nhiều hơn trên nhóm UTG so với nhóm VGBMT (37,2% so với 16,7%, p < 0,01)
3 So sánh các loại đột biến
Bảng 3: Tần suất xuất hiện các loại đột hiến trên nhóm nghiên cứu
(n = 148)
VGBMT (n = 54)
UTG (n = 94)
p
OR (95%CI)
Trong các kiểu đột biến, đột biến tại vị trí bắt đầu của đoạn pre-S2 (start pre-S2)
phổ biến nhất (42%), tiếp theo là đột biến mất đoạn pre-S2 (37,2%), vùng khởi động pre-SI (14,1%) và vùng khởi động pre-S2 (12,8%) So sánh từng đột biến trên các nhóm nghiên cứu cho thấy đột biến gen tại các vị trí ở nhóm UTG cao hơn có ý nghĩa
so vói nhóm VGBMT, trừ đột biến vùng khởi động pre-S2
BÀN LUẬN
Do đặc điểm cấu trúc di truyền và chu
trình nhân lên của viêm gan virut B nên
khả năng xuất hiện các kiểu gen mới, đột
biến gen mới rất cao, cao hơn so với các
loài virut có nhân ADN khác Tỷ lệ xuất
hiện đột biến gen hàng năm tại một vị trí
nucleotid có thể tăng cao đến 2,7 x 10-3
[3] Ngoài cơ chế gây đột biến điểm do
thiếu khả năng đọc sửa của protein
polymerase, còn có cơ chế tiềm tàng
khác làm phát sinh biến thể bộ gen như:
chỉnh sửa ADN virut bởi cytidine
deaminase của tế bào (xúc tác thay thế
guanine thành adenine và cytosine thành
thymine) hay thêm/bớt các đoạn trình tự
trong hệ gen viêm gan virut B do quá trình ghép nối ARN tiền hệ gen = enzym topoisomerase I trong tế bào [7] Tất cả các nhân tố trên đều góp phần hình thành những biến dị di truyền và là nguyên nhân nên sự đa dạng của chủng viêm gan virut B [8]
Nghiên cứu này, hai nhóm BN đã được đưa vào khảo sát so sánh BN được lựa chọn theo đúng tiêu chuẩn chẩn đoán hiện hành về viêm gan mạn tính và UTG của AASLD (2009), do đó đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng có sự khác biệt Chẩn đoán xác định viêm gan mạn dựa trên mô bệnh học sau khi sinh thiết gan Chẩn đoán xác định UTG bằng chọc hút
Trang 7tế bào gan làm tế bào học Điều đáng
quan tâm ở đây là nồng độ HBV ADN ở
nhóm VGBMT cao hơn có ý nghĩa so với
nhóm UTG Đây là kết quả mới so với
những chỉ số cận lâm sàng hiện đang
được sử dụng để so sánh đặc điểm
2 nhóm bệnh Kết quả này phù hợp với
các nghiên cứu trước đây là diễn biến tự
nhiên của bệnh do nhiễm viêm gan virut B
được trải qua 5 giai đoạn Đó là giai đoạn:
(i) dung nạp miễn dịch, (ii) thải loại miễn
dịch, (iii) bất hoạt virut, (iv) tái hoạt hóa
virut và (v) nhiễm viêm gan virut B thầm
kín [9] Trong đó, ở giai đoạn đầu ADN
của viêm gan virut B có nồng độ cao, sau
đó giảm dần khi hệ thống miễn dịch của
cơ thể chủ có nhận biết được virut
Để đảm bảo kết quả giải trình tự chính
xác, chúng tôi tiến hành giải trình tự vùng
pre-S bằng cả mồi xuôi và mồi ngược,
dùng phần mềm BioEdit để xác định
chính xác chuỗi trình tự giải được Sau
đó, so sánh kết quả thu được với Ngân
hàng Gen để xác định các vị trí, kiểu đột
biến Kết quả cho thấy trong 2 nhóm
nghiên cứu, tỷ lệ đột biến, kiểu đột biến
mất đoạn, đột biến điểm tại các vùng khởi
động pre-Sl, pre-S2, đột biến chèn đoạn
phù hợp với một nghiên cứu năm 2009
trên đối tượng BN là người Việt Nam
Trong nghiên cứu đó, tiến hành khảo sát
hồi cứu trên 42 trẻ em UTG người châu
Á, trong đó 28 trẻ em Việt Nam Kết quả
cho thấy một tần suất rất cao có đột biến
mất đoạn gen pre-S (27/30 BN = 90%)
Các đột biến thường xảy ra ở đoạn
pre-S2 (20/27 BN = 74%), tiếp theo là pre-S1
(5/27 BN + 18,5%) và cả hai pre-S1/S2
(2/27 BN = 7,4%) Từ những kết quả đó,
các tác giả kết luận viêm gan virut B là
nguyên nhân chủ yếu gây UTG ở trẻ em
châu Á Đột biến mất đoạn gen pre-S2 là
nơi gắn kết với quyết định kháng nguyên của tế bào TCD8, có thể đóng vai trò quan trọng trong sự xuất hiện và tiến triển thành UTG Qua đó, các tác giả khuyến cáo nên xác định đột biến gen tại khu vực pre-S2, đây là một phương pháp tiên lượng tiến triển UTG trên BN nhiễm viêm gan virut B [10]
So sánh từng đột biến trên nhóm nghiên cứu cho thấy đột biến gen tại các
vị trí ở nhóm UTG cao hơn có ý nghĩa so với nhóm VGBMT, trừ đột biến vùng khởi động pre-S2 Nguy cơ UTG ở những BN
có đột biến gen pre-S cao hơn có ý nghĩa
so với BN không mang gen đột biến (trừ đột biến đoạn khởi động gen pre-S2), OR
từ 2,2 - 6,6 Kết quả này một lần nữa
khẳng định vai trò của đột biến gen pre-S
trong sinh bệnh học gây UTG Các nghiên cứu trước đây đã chứng minh mối liên
quan giữa đột biến gen pre-S với tiến
triển bệnh do nhiễm viêm gan virut B Tổng quan hơn 40 nghiên cứu khác nhau
cho thấy, đột biến gen pre-S có liên quan
chặt chẽ đến hình thành UTG Trong đó, đột biến gen pre-S được tìm thấy ở UTG 48,2% (187/388 BN), ở VGBMT là 21,27% (80/376 BN) Nguy cơ UTG trên BN có đột biến gen pre-S cao hơn với tỷ suất chênh (OR) từ 2,62 - 21,9 Đồng thời, giá trị tiên lượng UTG của BN mang đột biến
gen pre-S cũng được ghi nhận với độ
nhạy từ 43,2 - 53,2% và độ đặc hiệu 78,4 - 83% [6]
KẾT LUẬN
Nồng độ HBV ADN ở nhóm VGBMT cao hơn có ý nghĩa so với nhóm UTG (3,1 x 109 ± 1,05 x 109 so với 1,2 x 108 - 4,6 x 109 copies/ml) 44/148 mẫu (29,7%)
có đột biến gen vùng pre-S Đột biến tại vị trí bắt đầu của đoạn pre-S2 là phổ biến
Trang 8nhất (42%), tiếp theo là đột biến mất đoạn
pre-S2 (37,2%), vùng khởi động pre-S
(14,1%) và vùng khởi động pre-S2
(12,8%) Đột biến gen tại tất cả các vị trí
ở nhóm UTG cao hơn có ý nghĩa so với
nhóm VGBMT, trừ đột biến vùng khởi
động pre-S2 Nguy cơ UTG ở những BN
có đột biến gen pre-S cao hơn có ý nghĩa
so với BN không mang gen đột biến với
OR từ 2,2 - 6,6
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Thành Đ.V, N.T Chính, L.H Song Tần
suất đột biến gen pre-S của virut viêm gan B
trên BN viêm gan B mạn tính và người mang
HBV mạn tính không triệu chứng Tạp chí Y -
Dược học Quân sự Số chuyên đề Sinh lý
bệnh 2010, 35, tr.31-37
2 Ganem D, A.M Prince Hepatitis B
virus infection-natural history and clinical
consequences N Engl J Med 2004, 350 (11),
pp.1118-1129
3 Osiowy C et al Molecular evolution of
hepatitis B virus over 25 years J Virol 2006
80 (21), pp.10307-10314
4 Ni, Y.H et al Mutations of T-cell epitopes
in the hepatitis B virus surface gen in children
with chronic infection and hepatocellular carcinoma Am J Gastroenterol, 2008 103
(4), pp.1004-1009
5 Michielsen P.P, SM Francque, J.L van Dongen Viral hepatitis and hepatocellular
carcinoma World J Surg Oncol 2005, 3, p.27
6 Liu S et al Associations between
hepatitis B virus mutations and the risk of hepatocellular carcinoma: a meta-analysis J Natl Cancer Inst, 2009 101 (15),
pp.1066-1082
7 Gunther S et al Naturally occurring
variants of hepatitis B virus Adv Virus Res
1999, 52, pp.2-137
8 Huy T.T et al High frevalence of hepatitis
B virus pre-S mutant in countries where it is endemic and its relationship with genotype and chronicity J Clin Microbiol 2003, 41 (12),
pp.5449-5455
9 Shi Y.H, C.H Shi Molecular characteristics
and stages of chronic hepatitis B virus infection World J Gastroenterol 2009 15 (25), pp 3099-3105
10 Abe K St et al pre-S2 deletion
mutants of hepatitis B virus could have an important, role in hepatocarcinozemsis in Asian Children Cancer Sci 2009, 100 (12), pp.2249-2254.