Bài viết trình bày xác định tỷ lệ nhiễm HPV và sự phân bố các type HPV có nguy cơ gây ung thư cao ở các bệnh nhân có tổn thương cổ tử cung đến khám phụ khoa tại Bệnh viện Phụ Sản Hải Phòng.
TẠP CHÍ PHỤ SẢN - 15(02), 135 - 138, 2017 NGHIÊN CỨU TỶ LỆ NHIỄM HPV Ở BỆNH NHÂN CÓ TỔN THƯƠNG CỔ TỬ CUNG TẠI BỆNH VIỆN PHỤ SẢN HẢI PHÒNG BẰNG KỸ THUẬT REAL - TIME PCR VÀ REVERSE DOT BLOT HYBRIDIZATION Vũ Văn Tâm, Phan Thị Thanh Lan, Lưu Vũ Dũng Bệnh viện Phụ Sản Hải Phòng Từ khóa: Tỷ lệ nhiễm HPV, tổn thương cổ tử cung, Real Time PCR Reverse Dot Blot Hybridization Keywords: HPV prevalence, distribution of HPV, Real - Time PCR and Reverse Dot Blot Hybridization Tóm tắt Mục tiêu: Xác định tỷ lệ nhiễm HPV phân bố type HPV có nguy gây ung thư cao bệnh nhân có tổn thương cổ tử cung đến khám phụ khoa Bệnh viện Phụ Sản Hải Phòng Phương pháp: Sử dụng phương pháp Real-time PCR Reverse Dot Blot Hybridization máy X-4800 Cobas hãng Roche- dianostique (Thụy Sỹ), nghiên cứu 533 mẫu dịch phết cổ tử cung Kết quả: Tỷ lệ nhiễm HPV type nguy cao phụ nữ đến khám phụ khoa Bệnh viện Phụ Sản Hải Phòng 10,1% (54/533), số bị nhiễm type 16 20,4% (11/54); type 18 12,9 % (7/54) 66,7% (36/54) dương tính với 12 type (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68 ) Tỷ lệ nhiễm type 88,9% (48/54), đồng nhiễm type 11,1% (6/54); Không phát ca đồng nhiễm từ type trở lên 100% đồng nhiễm type nguy cao với type nguy trung bình, đồng nhiễm hay gặp type 16 type nguy trung bình (66,67%) Kết luận: Tỷ lệ nhiễm HPV phụ nữ tổn thương cổ tử cung đến khám phụ khoa Bệnh viện Phụ Sản Hải Phòng 10,1%, cao tỷ lệ nhiễm HPV khảo sát phụ nữ nói chung cộng đồng Từ khóa: Tỷ lệ nhiễm HPV, tổn thương cổ tử cung, Real - Time PCR Reverse Dot Blot Hybridization Abstract STUDY ON HPV PREVALANCE IN PATIENTS AT HAI PHONG GYNECOLOGY-OBSTETICQUE HOSPITAL BY REAL-TIME PCR AND DOT BLOT HYBRIDIZATION Objectives: To determine HPV prevalence and distribution of HPV types in patients at Hải Phòng gynecology- obstetrics Hospital Methods: Using real-time PCR and Reverse Dot Blot Hybidization to study 533 cervical swab specimens Results: The rate of HPV infetion in women at Hospital with high-risk type is 10.1%, which were infected with type 16 is 20.4%; type 18 is Tập 15, số 02 Tháng 05-2017 Tác giả liên hệ (Corresponding author): Phan Thị Thanh Lan, email: bsthanhlan@gmail.com Ngày nhận (received): 01/03/2017 Ngày phản biện đánh giá báo (revised): 15/03/2017 Ngày báo chấp nhận đăng (accepted): 28/04/2017 135 PHỤ KHOA – NỘI TIẾT, VÔ SINH VŨ VĂN TÂM, PHAN THỊ THANH LAN, LƯU VŨ DŨNG 12.9% and 66.7% positive with in 12 type (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68 ) The infection rate with type is 88.9%, coinfection with types is 11.1%; No any cases of co-infection of types Co-infection between one high-risk type with one type of average-risk is the highest rate (100%), the most common co-infectionis between types 16 and average-risk type (66.67%) Conclusion: The rate of HPV infection in women at Hospital with high-risk is 10,1% Our results is highrer than that in pulication Key words: HPV prevalence, distribution of HPV, Real - Time PCR and Reverse Dot Blot Hybridization Tập 15, số 02 Tháng 05-2017 Đặt vấn đề 136 Ung thư cổ tử cung loại ung thư xếp hàng thứ hai số ung thư phổ biến phụ nữ giới, lại chiếm vị trí hàng đầu ung thư phụ nữ nước phát triển Ước tính năm có khoảng 288.000 ca tử vong ung thư cổ tử cung khắp giới, 85% trường hợp tử vong xảy nước phát triển [1] Nhiều nghiên cứu gần cho thấy ung thư cổ tử cung có liên quan chặt chẽ với nhiễm type Human papillomavirus (HPV) nguy cao đường sinh dục [2],[3] Có yếu tố nguy phát sinh ung thư cổ tử cung là: bệnh nhân có tổn thương cổ tử cung tồn từ trước, đồng thời nhiễm HPV nguy cao mà thể không tự đào thải được, suy giảm miễn dịch Thì từ tái tạo khơng hồn tồn biến đổi thành tổn thương biểu mô Malpighi (loạn sản), trước hết mức độ thấp (CIN 1), sau đó, tiến triển lên mức độ cao (CIN 2, CIN 3, K cổ tử cung) [4] Dựa khả gây tổn thương mô học, đặc biệt khả gây ung thư cổ tử cung, HPV chia làm hai nhóm: nhóm nguy cao nguy thấp Nhóm nguy cao (HPV-16,18…) gây tổn thương tiền ung thư ung thư, trái lại nhóm nguy thấp (HPV-6,11…) gặp trường hợp ung thư mà chủ yếu gây tổn thương lành tính Do đó, việc phát xác định type HPV có vai trị vơ quan trọng việc đánh giá nguy ung thư cổ tử cung số ung thư đường sinh dục khác [2],[5],[6] Hiện có nhiều phương pháp phát nhiễm HPV PAP’s smear, ts-PCR (type specific PCR), PCRElisa, Reverse Dot Blot, Sequencing, song xác kỹ thuật sinh học phân tử, có xét nghiệm định type HPV kỹ thuật Reverse Dot Blot Hybridization Vì vậy, chúng tơi sử dụng kỹ thuật Real-time PCR Reverse Dot Blot Hybridization nghiên cứu đề tài nhằm mục tiêu sau: Xác định tỷ lệ nhiễm HPV Xác định phân bố type HPV bệnh nhân tổn thương cổ tử cung khám phụ khoa Bệnh viện Phụ Sản Hải Phòng từ năm 6/2016 -3/2017 Phương pháp nghiên cứu 2.1 Đối tượng nghiên cứu - Bệnh nhân đến khám phụ khoa Bệnh viện Phụ Sản Hải Phòng - Thời gian thu thập mẫu: từ tháng 6/2016 đến tháng 3/2017 2.2 Phương pháp nghiên cứu - Nghiên cứu hồi cứu với cỡ mẫu thuận tiện - số liệu thống kê từ phần mềm quản lý xét nghiệm Labconn - Tiêu chuẩn lựa chọn đối tượng nghiên cứu: • Phụ nữ có quan hệ tình dục • Hiện khơng có thai * Bệnh nhân khám, soi cổ tử cung xét nghiệm Thinprep pap test Những bệnh nhân chẩn đốn tổn thương cổ tử cung lành tính nhận vào nghiên cứu Bảng Tỷ lệ nhiễm HPV theo nhóm tuổi Tuổi HPV DNA (-) ≤ 25 28 26 - 35 182 > 35 269 Tổng 479 Trung bình 38,3 ±9 Trẻ 17 Già 75 HPV DNA (+) 25 25 52 36,7 ± 8,8 21 57 Tổng 32 207 294 533 3.3 Sự phân bố type HPV TẠP CHÍ PHỤ SẢN - 15(02), 135 - 138, 2017 • Khơng thụt rửa âm đạo trước xét nghiệm • Khơng đặt thuốc điều trị phụ khoa trước ngày • Khi xét nghiệm khơng thời kỳ hành kinh • Khơng quan hệ tình dục trước xét nghiệm ngày - Quy trình thực định type HPV: • Thu nhận bệnh phẩm: dịch phết cổ tử cung • Tách chiết DNA tổng số phương pháp Phenol - chloroform • Thực phản ứng Nested Real-time PCR: máy X- 4800 Cobas hãng Rochedianostique (Pháp), • Phân tích, so sánh, đối chiếu kết với sơ đồ màng lai Biểu đồ Tỷ lệ type HPV Hình HPV Real-time PCR nguyên lý kỹ thuật Reverse Dot Blot Hình Kết định type HPV kỹ thuật Reverse Dot Blot Kết 3.1 Tỷ lệ nhiễm HPV Biểu đồ Tỷ lệ nhiễm HPV Bàn luận 4.1 Về phương pháp xét nghiệm Hiện có nhiều phương pháp để phát định type HPV như: PAP’s smear, ts-PCR (type specific PCR), PCR-Elisa, Reverse Dot Blot, Sequencing PAP’s smear cho biết thay đổi hình thái tế bào bị nhiễm HPV, khơng xác định type HPV, có độ nhạy 4478% độ đặc hiệu 91-96% PCR-Elisa ts-PCR phải qua bước phát sản phẩm PCR điện di agarose sử dụng Ethidium Bromide độc, nguy ngoại nhiễm cao, xác định 18 type HPV (13 type nguy cao type thấp) Sequencing đánh giá tiêu chuẩn vàng xác định type HPV Tuy nhiên, Tập 15, số 02 Tháng 05-2017 Như biểu đồ 1, tỷ lệ phát HPVDNA dương tính với HPV type nguy cao nguy trung bình phụ nữ tổn thương cổ tử cung đến khám phụ khoa Bệnh viện Phụ sản Hải Phòng 10,1% 3.2 Sự liên quan nhiễm HPV theo nhóm tuổi Như biểu đồ 2, phát 14 type HPV số 24 type xác định kỹ thuật Trong đó, Type 16 chiếm tỷ lệ (20,4%), type 18 (12,9%) Tỷ lệ dương tính với 12 type (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68) 66,7% Đặc biệt có 11,1% có đồng nhiễm type HPV Khơng xuất ca nhiễm từ type trở lên Kiểu đồng nhiễm phổ biến type nguy cao với nguy trung bình (100%), hay gặp đồng nhiễm type 16, 18 với type khác không xuất đồng nhiễm type 16 18 Đồng nhiễm 16 với type nguy trung bình chiếm 66,7% Đồng nhiễm 18 với type nguy trung bình chiếm 33,3% Khơng có trường hợp đồng nhiễm type nguy trung bình với nguy trung bình 137 PHỤ KHOA – NỘI TIẾT, VÔ SINH VŨ VĂN TÂM, PHAN THỊ THANH LAN, LƯU VŨ DŨNG kỹ thuật có giá thành cao, tốn nhiều thời gian không xác định đồng nhiễm Trong đề tài này, áp dụng phương pháp Real - time PCR Reverse Dot Blot kỹ thuật có nhiều ưu điểm so với phương pháp khác như: thao tác đơn giản, cho kết nhanh, có độ nhạy cao đến IU/phản ứng, độ đặc hiệu 100%, xác định 24 type HPV (18 type nguy cao type nguy thấp) Phương pháp có lợi so với Sequencing xác định dễ dàng nhiễm đồng nhiễm type HPV mẫu bệnh phẩm 4.2 Về độ tuổi nhiễm HPV Tuổi trung bình nhóm nhiễm khơng nhiễm HPV khơng có khác biệt p> 0,05 Trong nhóm tuổi 25 (độ tuổi cịn tiêm vắc xin phịng HPV) tỷ lệ dương tính với HPV 4/32 (12,5%) Do vậy, khuyến nghị xét nghiệm định type HPV trước định tiêm phòng cho nữ giới 25 tuổi có quan hệ tình dục Trong nhóm tuổi 35, tỷ lệ dương tính với HPV 25/207 (12,1%) Tuy nhiên, theo tác giả Remi Catabelle (Pháp), có đến 80% bệnh nhân nhóm tuổi này, HPV đào thải tự nhiên nhờ hệ miễn dịch (được gọi khỏi tự nhiên hay nhiễm trùng tạm thời)[7] Trong nhóm tuổi 35, tỷ lệ dương tính 25/269 (9,3%) Theo tác giả Remi Catabelle (Pháp) tồn nhiễm trùng năm có khoảng 10-20% ca nhiễm, sau – năm tiến triển từ tổn thương cổ tử cung lành tính thành tổn thương biểu mơ Malpighi mức độ thấp (CIN 1) Sau đó, đến năm tiến triển thành tổn thương biểu mô Malpighi mức độ cao (CIN 2-3) Sau đến 10-15 năm thành ung thư [7] 4.3 Về tỷ lệ nhiễm type HPV Với 533 phụ nữ đến khám phụ khoa Bệnh viện Phụ sản Hải Phòng xác định có tổn thương cổ tử cung, kết thu có 54/533 (10,1%) ca nhiễm HPV, tỷ lệ thấp nghiên cứu tác giả Nguyễn Hữu Quyền sử dụng kỹ thuật Real Tập 15, số 02 Tháng 05-2017 Tài liệu tham khảo 138 Nguyễn Bá Đức Tổng quan ung thư cổ tử cung Tạp chí Y học Việt Nam 2007; 98-104 Kumar, Vinay; Abbas, Abul K.; Fausto, Nelson; Mitchell, Richard Chapter 19 The Female Genital System and Breast Robbins Basic Pathology 2007 (8 ed.); Philadelphia: Saunders ISBN 1-4160-2973-2977 Lee Hyo-Pyo, Sang-Soo Seo The application of human papilloma virus testing to cervical cancer screening Yousei Medical Journal 2002;43(6): 763-768 Muñoza N, Castellsaguéb X, Berrington de Gonzálezc A, Gissmann L (2006) Chapter 1: HPV in the etiology of human cancer Vaccine 2006; 24 (3): S1-S10 Parkin DM The global health burden of infection-associated cancers in the - time PCR Reverse Dot Blot khảo sát phụ nữ viêm cổ tử cung 29,8% [8] Sự khác tác giả Nguyễn Hữu Quyền khảo sát 24 type HPV (2 type nguy cao, 16 type nguy trung bình type nguy thấp) Cịn chúng tơi tiến hành khảo sát type HPV nguy cao (16,18) 12 type nguy trung bình (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68,) Trong đó, khảo sát phụ nữ nói chung cộng đồng, tỷ lệ nhiễm HPV theo kết nghiên cứu Lê Trung Thọ Trần Văn Hợp Hà Nội (2009) 5,13% [6], Vũ Thị Nhung khảo sát Thành phố Hồ Chí Minh (2007) 12% [9] Điều cho thấy lệ nhiễm HPV phụ nữ tổn thương cổ tử cung cao nhiều so với nhóm phụ nữ bình thường cộng đồng Trong trường hợp HPV (+), xác định 33,3% bệnh nhân bị nhiễm type nguy cao Trong type 16 chiếm tỷ lệ cao 66,7%, type 18 (33,3% Do vậy, nhóm phụ nữ tổn thương cổ tử cung cần tư vấn khám định kỳ kết hợp với Thinprep PAP test, soi cổ tử cung để phát sớm tiền ung thư ung thư cổ tử cung Kết luận Sử dụng phương pháp Real-time PCR Reverse Dot Blot Hybridization nghiên cứu 533 mẫu dịch phết cổ tử cung, thu kết sau: Tỷ lệ nhiễm HPV phụ nữ có tổn thương cổ tử cung đến khám phụ khoa Bệnh viện Phụ sản Hải Phòng 10,1%, cao tỷ lệ nhiễm HPV khảo sát phụ nữ nói chung cộng đồng Tỷ lệ nhiễm type nguy cao 33,3%; nguy trung bình 66,7% Tỷ lệ nhiễm type 88,9%, đồng nhiễm type 11,1%; không phát ca đồng nhiễm từ type trở lên 100% đồng nhiễm type nguy cao với type nguy trung bình Đồng nhiễm hay gặp type 16 type nguy trung bình (66,7%) year 2002 Int J Cancer 2006; 118 (12): 3030-44 Lê Trung Thọ Trần Văn Hợp Nghiên cứu tỷ lệ nhiễm HPV cộng đồng phụ nữ Hà Nội số yếu tố liên quan Y Hoc TP Hồ Chí Minh 2009; 13 (1): 185-189 Remi Catabelle Chẩn đốn, điều trị, dự phịng ung thư cổ tử cung Bài giảng cho bác sỹ sản phụ khoa 23/05/2016 Đại học y Hải Phòng Nguyễn Hữu Quyền Nghiên cứu tỷ lệ nhiễm HPV bệnh nhân khám phụ khoa Bệnh viện Đa khoa MEDLATEC kỹ thuật Real - Time PCR Reverse Dot Blot Hybridization Tài liệu lưu hành nội Vũ Thị Nhung Khảo sát tình hình nhiễm týp HPV (Human Papiloloma Virus) Phụ nữ Thành phố Hồ Chí Minh kỹ thuật sinh học phân tử Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh Phụ chuyên đề Ung bướu học 2006; 10(4): 402-407 ... Reverse Dot Blot Hybridization nghiên cứu 533 mẫu dịch phết cổ tử cung, thu kết sau: Tỷ lệ nhiễm HPV phụ nữ có tổn thương cổ tử cung đến khám phụ khoa Bệnh viện Phụ sản Hải Phòng 10,1%, cao tỷ lệ nhiễm. .. lai Biểu đồ Tỷ lệ type HPV Hình HPV Real-time PCR nguyên lý kỹ thuật Reverse Dot Blot Hình Kết định type HPV kỹ thuật Reverse Dot Blot Kết 3.1 Tỷ lệ nhiễm HPV Biểu đồ Tỷ lệ nhiễm HPV Bàn luận 4.1... [7] 4.3 Về tỷ lệ nhiễm type HPV Với 533 phụ nữ đến khám phụ khoa Bệnh viện Phụ sản Hải Phịng xác định có tổn thương cổ tử cung, kết thu có 54/533 (10,1%) ca nhiễm HPV, tỷ lệ thấp nghiên cứu tác