NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH LÊN MEN FED-BATCH Corynebacterium glutamicum THU NHẬN L-LYSINE

vào nguồn dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy và các sản phẩm do quá trình sinh trưởng của chính vi sinh vật tạo ra.. Nguyên nhân là do điều kiện bất lợi của môi trường như: nguồn dinh

B Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

FED-BATCH Corynebacterium glutamicum

Thành ph ố Hồ Chí Minh-2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

FED-BATCH Corynebacterium glutamicum

L ỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn này là công trình nghiên cứu của riêng tôi

K ết quả trình bày trong luận văn là trung thực

Vi ệc tham khảo nghiên cứu của các tác giả khác đều được trích dẫn rõ ràng

TP H ồ Chí Minh, ngày 31 tháng 10 năm 2014

TÁC GI Ả LUẬN VĂN

Nguyễn Thanh Hương

Em xin c ảm ơn chị hai, anh rể và các cháu đã luôn ủng hộ em cả về tinh thần

và v ật chất để em có được ngày hôm nay Em cảm ơn chị hai đã luôn ở bên em

Em c ảm ơn Cô Minh Tâm đã giúp đỡ em trong quá trình làm luận văn

Em xin g ửi lời cảm ơn đến Cô Ly Tao, cán bộ phòng thí nghiệm Bộ môn Công ngh ệ Sinh học, Trường Đại học Bách khoa TP HCM đã tạo điều kiện thuận lợi cho

em trong quá trình em ti ến hành thực nghiệm tại đây

Em xin c ảm ơn các Thầy, Cô đã tham gia giảng dạy lớp Cao học Sinh học Thực nghi ệm K23, Trường Đại học Sư phạm TP HCM

Cu ối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến những người bạn đã ở bên tôi

Xin chân thành c ảm ơn

TP H ồ Chí Minh, ngày 31 tháng 10 năm 2014

TÁC GI Ả LUẬN VĂN

Nguyễn Thanh Hương

M ỤC LỤC

Trang phụ bìa

Lời cam đoan

Lời cảm ơn

Mục lục

Danh mục các bảng

Danh mục các hình

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Kỹ thuật lên men thu nhận L-lysine 3

1.1.1 Khái niệm 3

1.1.2 Quá trình lên men 3

1.1.3 Các hình thức lên men 3

1.2 Vi khuẩn Corynebacterium glutamicum 11

1.2.1 Đặc điểm hình thái và vị trí phân loại 12

1.2.2 Đặc điểm sinh lý 13

1.2.3 Đặc điểm sinh hóa 13

1.2.4 Đặc điểm di truyền 14

1.3 Amino acid L-lysine 16

1.3.1 Đặc điểm 16

1.3.2 Vai trò và ứng dụng 17

1.3.3 Thu nhận L-lysine từ vi khuẩn 19

1.3.4 Bản chất quá trình sinh tổng hợp L-lysine ở vi khuẩn Corynebacterium glutamicum 20

1.3.5 K ỹ thuật lên men fed-batch thu nhận L-lysine từ Corynebacterium glutamicum 23

1.4 Những nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến hướng của đề tài 26

Chương 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.1 Nguyên liệu 29

2.2 Bố trí thí nghiệm 33

2.2.1 Khảo sát một số đặc điểm sinh học của giống 33

2.2.2 T ối ưu hóa môi trường lên men Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm 33

2.2.3 Thử nghiệm lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine 35

2.3 Phương pháp phân tích thí nghiệm 36

2.3.1 Phương pháp vi sinh 36

2.3.2 Phương pháp hóa sinh 38

2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu 39

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 40

3.1 Khảo sát một số đặc điểm sinh học của giống 40

3.2 Tối ưu hóa môi trường lên men Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm 42

3.3 Thử nghiệm lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine 50 3.3.1 Xác định thời điểm bắt đầu bổ sung cơ chất 50

3.3.2 Khảo sát ngưỡng ức chế cơ chất 53

3.3.3 Thử nghiệm lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine 56

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO 65

PHỤ LỤC

DANH M ỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Các hóa chất phân tích 29

Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng trong đề tài 30

Bảng 2.3 Các môi trường nuôi cấy sử dụng trong đề tài 31

Bảng 2.4 Các mức thí nghiệm sàng lọc 34

Bảng 2.5 Thí nghiệm sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng lớn đến hàm mục tiêu 34

Bảng 3.1 Đặc điểm chủng Corynebacterium glutamicum VTCC-B-0632 40

Bảng 3.2 Kết quả thí nghiệm sàng lọc 42

Bảng 3.3 Mức ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát 43

Bảng 3.4 Kết quả thí nghiệm khởi đầu 44

Bảng 3.5 Hồi quy-phương sai thí nghiệm khởi đầu 45

Bảng 3.6 Kết quả thí nghiệm bề mặt đáp ứng-cấu trúc tâm xoay RSM-CCD 46

Bảng 3.7 Khả năng sử dụng đường của Corynebacterium glutamicum 52

Bảng 3.8 So sánh lên men batch và fed-batch 61

DANH M ỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 (a) Tế bào vi khuẩn Corynebacterium glutamicum sinh trưởng trên

môi trường phức hợp (b) Tế bào quan sát bằng kính hiển vi điện tử

quét 12

Hình 1.2 Bản đồ gen Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 15

Hình 1.3 Mô hình ezyme aspartate kinase với hai tiểu phần lysCα và lysCβ được cấu tạo bởi bốn chuỗi poplypeptide giống hệt nhau 16

Hình 1.4 Cấu trúc không gian và cấu tạo phân tử của lysine 17

Hình 1.5 Sơ đồ tổng quát chuyển hóa từ glucose thành lysine ở vi khuẩn 20

Hình 1.6 Con đường hình thành L-lysine ở Corynebacterium glutamicum 21

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 32

Hình 3.1 Khuẩn lạc Corynebacterium glutamicum VTCC-B-0632 (a) và hình dạng tế bào Corynebacterium glutamicum VTCC-B-0632 (b) 41

Hình 3.2 Đồ thị đường mức thể hiện sự ảnh hưởng của (NH4)2SO4 và dịch bắp lên lượng L-lysine 48

Hình 3.3 Đồ thị tối ưu 49

Hình 3.4 Khả năng sinh trưởng, sinh L-lysine và lượng đường sót trong lên men batch Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine 50

Hình 3.5 Khả năng hình thành sinh khối, L-lysine và lượng đường sót khi nuôi cấy Corynebacterium glutamicum ở các nồng độ glucose khác nhau 54

Hình 3.6 Khả năng sinh trưởng, sinh L-lysine và lượng đường sót trong quá trình lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum-B-0632 57

Hình 3.7 Đồ thị so sánh lượng L-lysine trong lên men batch và fed-batch 58

Hình 3.8 Đồ thị so sánh khả năng sinh trưởng của Corynebacterium glutamicum trong lên men batch và fed-batch 59

Hình 3.9 Đồ thị so sánh lượng đường sót trong lên men batch và fed-batch 60

M Ở ĐẦU

1 Lí do ch ọn đề tài

Amino acid rất cần thiết cho sự sinh trưởng, phát triển của người và động vật, đặc

biệt là các amino acid không thay thế Sự thiếu hụt amino acid nói chung và các amino acid không thay thế nói riêng sẽ dẫn đến tình trạng bệnh lý L-lysine là một amino acid thuộc nhóm không thay thế được quan tâm nhiều hơn cả, vì có nhu cầu khá cao, nhưng

lại thường bị thiếu hụt nhất trong khẩu phần ăn Mặt khác, L-lysine dễ bị phân hủy trong quá trình chế biến thức ăn và cơ thể tuyệt đối không tổng hợp được Do đó, thiếu L-lysine rất phổ biến, đặc biệt là ở trẻ nhỏ Thiếu L-lysine làm giảm tổng hợp protein cơ

thể, trẻ biếng ăn, chậm lớn, thiếu men tiêu hóa…

Hiện nay, việc sử dụng công nghệ vi sinh để sản xuất L-lysine là hướng đang được quan tâm Tuy nhiên, ở Việt Nam, quy trình sản xuất vẫn còn ở quy mô phòng thí nghiệm, số lượng các nghiên cứu về sản xuất L-lysine còn ít, chủng giống chưa đạt chuẩn, năng suất thấp [1]

Với mục tiêu cải thiện quá trình lên men thu nhận L-lysine, chúng tôi chọn giải pháp tối ưu hóa môi trường lên men và kỹ thuật lên men fed-batch Đây là lý do chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu quá trình lên men fed-batch Corynebacterium

glutamicum thu nhận L-lysine”

2 M ục tiêu nghiên cứu

Cải thiện quá trình lên men thu nhận L-lysine từ chủng vi khuẩn Corynebacterium

glutamicum-B-0632

3 Đối tượng nghiên cứu

Vi khuẩn Corynebacterium glutamicum VTCC-B-0632 từ trung tâm lưu giữ giống

Đại học Quốc Gia Hà Nội

4 Nhi ệm vụ nghiên cứu

1 Khảo sát một số đặc điểm sinh học của giống

2 Tối ưu hóa môi trường lên men thu nhận L-lysine bằng phương pháp quy hoạch

thực nghiệm

3 Thử nghiệm lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine

5 Ph ạm vi nghiên cứu

Tối ưu hóa môi trường dinh dưỡng trong lên men batch, tạo tiền đề cho bước đầu

khảo sát lên men fed-batch gián đoạn thu nhận L-lysine ở quy mô phòng thí nghiệm

6 Đóng góp của luận văn

Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các thông số tối ưu của quá trình lên men batch và bước đầu thử nghiệm lên men fed-batch Kết quả này sẽ là tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo

7 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận văn

Về mặt khoa học: đề tài góp phần khẳng định ưu điểm của phương pháp lên men fed-batch trong lên men tế bào vi khuẩn Corynebacterium glutamicum thu nhận amino

acid L-lysine

Về mặt thực tiễn: cải thiện quá trình lên men thu nhận L-lysine

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 K ỹ thuật lên men thu nhận L-lysine

1.1.1 Khái ni ệm

“Lên men” là thuật ngữ được sử dụng từ khá lâu, có nguồn gốc từ tiếng La tinh

“fervere” có nghĩa là “làm chín” để chỉ hoạt động của nấm men trong dịch chiết trái cây

hoặc ngũ cốc Trong lĩnh vực hóa sinh, lên men được hiểu là sự tạo thành năng lượng từ các quá trình dị hóa các hợp chất hữu cơ Tuy nhiên, trong lĩnh vực vi sinh vật học, cụm

từ này lại được dùng để chỉ chung cho quá trình tạo ra sản phẩm bằng cách nuôi cấy vi sinh vật thích hợp [28]

1.1.2 Quá trình lên men

Quá trình lên men là quá trình phân giải carbohydrate trong điều kiện kỵ khí Quá trình lên men bắt đầu từ sự phân giải các hợp chất chứa carbohydrate thành đường glucose và kết thúc là sự tạo thành CO2 và một số hợp chất chứa carbon chưa được oxy hóa hoàn toàn như ethanol, acid acetic, Người ta thường dùng tên sản phẩm điển hình tích lũy trong từng loại lên men để gọi quá trình lên men ấy Ví dụ, quá trình lên men tích lũy chủ yếu acid lactic thì gọi là lên men lactic (muối dưa, cà, làm sữa chua) Tuy nhiên, có nhiều vi sinh vật hiếu khí có khả năng oxy hóa không hoàn toàn cơ chất tạo ra

những sản phẩm giống như lên men kỵ khí, quá trình này cũng được gọi là lên men mà

thực chất là oxy hóa hiếu khí Rất nhiều quá trình oxy hóa không hoàn toàn có ý nghĩa quan trọng trong công nghiệp lên men, vì đã tạo ra những sản phẩm có giá trị [2]

1.1.3 Các hình th ức lên men

Tùy theo cách phân loại mà có nhiều hình thức lên men khác nhau:

Theo tính chất môi trường: lên men dạng lỏng, lên men dạng rắn và bán rắn

Theo đặc tính sử dụng oxy của chủng vi sinh vật: lên men hiếu khí và lên men kỵ khí

Theo trạng thái: lên men tĩnh (không khuấy trộn hay sục khí) và lên men động (có khuấy trộn hoặc sục khí)

Theo mức độ kiểm soát của quy trình: lên men có kiểm soát (kiểm soát độ tạp nhiễm, nồng độ cơ chất, pH…) và lên men không kiểm soát (tự nhiên)

Theo kỹ thuật lên men: lên men theo mẻ (batch), lên men liên tục (continous) và lên men dạng bán liên tục (fed-batch hay dạng mẻ có bổ sung)

Trong phần này, chúng tôi sẽ đề cập sâu hơn đến ba kỹ thuật lên men, đó là lên men theo mẻ (batch), lên men liên tục và lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất (fed-batch)

1.1.3.1 Lên men theo m ẻ

Lên men theo mẻ hay còn gọi là lên men batch Đây là phương pháp nuôi cấy mà trong suốt thời gian nuôi cấy, ta không thêm vào chất dinh dưỡng và cũng không loại bỏ các sản phẩm cuối cùng của quá trình trao đổi chất, ngoại trừ ammoniac được thêm vào

để điều chỉnh pH (nếu có) [12], quần thể tế bào bị giới hạn trong một khoảng không gian nhất định Vi sinh vật bắt buộc phải trải qua các pha sinh trưởng: pha lag, pha log, pha ổn định và pha suy vong [2, 28]

Trong giai đoạn đầu (pha lag), gần như không có sự tăng trưởng đáng kể nào xảy

ra, chủ yếu là sự thích nghi của tế bào với môi trường mới Trong thực tế sản xuất, cần

phải rút ngắn thời gian của pha này càng nhiều càng tốt để đưa hệ thống lên men nhanh chóng bước vào pha tăng trưởng và sinh tổng hợp sản phẩm mong muốn

Sau giai đoạn thích nghi là giai đoạn tăng trưởng và dần đạt đến tốc độ tối đa (pha log) [28] Sự tăng trưởng trong pha log được biểu diễn theo phương trình sau:

dx/dt = µx (1.1) Trong đó: x là sinh khối vi sinh vật tại thời điểm nuôi cấy được t giờ, µ là tốc độ tăng trưởng (/giờ) Hằng số µ khác nhau tùy vào từng giai đoạn trong chu kỳ tăng trưởng

Từ phương trình (1.1) ta có:

dx/x = µdt

 ∫ 𝑑𝑑/𝑑𝑡𝑡𝑡 = µ ∫ 𝑑𝑑𝑡𝑡𝑡

 lnxt – lnxto = µ(t-to) Trong đó, xto là lượng sinh khối ban đầu, xtlà lượng sinh khối sau khi nuôi cấy t

giờ

Trong pha log, chất dinh dưỡng còn nhiều, µ sẽ đạt µmax Mỗi chủng vi sinh vật trong điều kiện tối ưu nhất sẽ có µ khác nhau Tốc độ tăng trưởng phụ thuộc rất lớn

vào nguồn dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy và các sản phẩm do quá trình sinh trưởng của chính vi sinh vật tạo ra Nếu duy trì việc bổ sung dinh dưỡng vào môi trường nuôi cấy ở pha log thì tăng trưởng vẫn đạt được tốc độ cao

Sự tăng số lượng tế bào trong pha log diễn ra theo cấp số nhân với cơ số 2 theo phương trình sau:

N = N0 2n

Với N0 và N là số lượng tế bào ban đầu và tại thời điểm khảo sát, n là số thế hệ

 lg(N/N0) = n.lg2  n = lg(N/N0) 1/0,301  n = lg(N/N0) 3,32

Thời gian thế hệ được tính bằng công thức sau:

tg = t/n

với t là thời gian vi sinh vật nhân đôi qua n thế hệ

Hằng số tốc độ phân chia K là số lần phân chia sau 1 giờ nuôi cấy:

K = n/t Pha cân bằng, lượng sinh khối tạo thành có thể được tính bằng công thức:

khối vi sinh vật Có thể dùng Y để tính toán một lượng cơ chất cần thiết để thu được

một lượng sinh khối nhất định Y thay đổi phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy như: nhiệt

độ, pH, lượng oxy, giới hạn nồng độ cơ chất…Theo Monod (1942), sự suy giảm tăng trưởng của vi sinh vật phụ thuộc vào hàm lượng cơ chất được thể hiện qua phương trình:

Pha suy vong, số lượng tế bào có khả năng sống giảm theo lũy thừa Nguyên nhân

là do điều kiện bất lợi của môi trường như: nguồn dinh dưỡng cạn kiệt làm giảm quá trình trao đổi chất, sự tích lũy một số sản phẩm trao đổi chất gây độc cho vi sinh vật (acid) và một số enzyme (amilaza, proteinaza…) ngoài chức năng xúc tác các quá trình

tổng hợp còn tham gia vào quá trình phân giải tế bào vi sinh vật Các nguyên nhân trên

dẫn đến sự chết của hàng loạt các tế bào [2]

Kỹ thuật lên men theo mẻ (batch) được sử dụng để sản xuất sinh khối, sản phẩm

sơ cấp và sản phẩm thứ cấp Hiện nay, phương pháp này vẫn đang được sử dụng phổ

biến do có một số ưu điểm sau: đơn giản, dễ tiến hành do không phải bổ sung thêm bất

kỳ thành phần nào trong quá trình vận hành, vì vậy, giảm khả năng bị nhiễm cũng như chi phí Tuy nhiên, phương pháp này cho sản lượng thấp do vi sinh vật không được cung cấp thêm nguồn dinh dưỡng nên nhanh chóng bước vào pha suy vong khi nguồn

cơ chất cạn kiệt Để nâng cao sản lượng, ta cần bổ sung thêm nguồn dinh dưỡng trong

suốt pha sinh trưởng của vi sinh vật Kỹ thuật lên men theo mẻ có bổ sung (fed-batch)

và lên men liên tục đã khắc phục được nhược điểm của lên men theo mẻ

1.1.3.2 Lên men liên t ục

Trong nuôi cấy theo mẻ, vi sinh vật phải trải qua 4 pha tuần tự: pha thích nghi (pha lag), pha tăng trưởng (pha log), pha cân bằng và pha suy vong, nhưng đối với nuôi cấy liên tục, pha log được duy trì bằng cách bổ sung liên tục nguồn dinh dưỡng vào nồi lên men và một lượng dịch chứa vi khuẩn tương ứng được lấy ra Khi đó, tốc độ nạp liệu và

tốc độ chiết dịch được cân bằng, nồng độ tế bào trong nồi lên men phụ thuộc vào tốc độ

nạp liệu [28] Dòng chất dinh dưỡng nạp vào nồi lên men có liên quan đến thể tích nồi lên men theo tốc độ pha loãng giới hạn (D) theo công thức sau:

D = F/V Trong đó, F là tốc độ nạp liệu (L/giờ), V là thể tích nồi lên men (L), D là tốc độ pha loãng hay hệ số pha loãng Đại lượng D biểu thị sự thay đổi thể tích sau 1 giờ [2]

Tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật trong nồi lên men được biểu diễn qua phương trình:

v+ = dx/dt = µx

Nếu vi sinh vật ngừng sinh trưởng, phát triển, chúng sẽ bị rút khỏi nồi lên men với

quần thể vi sinh vật sinh trưởng và phát triển theo lũy thừa thường xuyên ở một mật độ

tế bào không đổi và không phụ thuộc vào thời gian Làm được như vậy, không những

trạng thái sinh lý tế bào mà cả môi trường nuôi cấy đều ổn định và không phụ thuộc vào

thời gian Điều này tạo điều kiện cho nghiên cứu sinh trưởng và sinh lý tế bào [2]

Trong nuôi cấy liên tục còn chia thành nhiều kiểu nuôi cấy khác nhau:

Nuôi cấy dạng đa hệ thống: dịch chiết ra từ hệ thống lên men này sẽ được đưa ngay vào một hệ thống lên men khác Như vậy, có thể thay đổi được nguồn nguyên liệu trong các giai đoạn khác nhau trong quá trình nuôi cấy

Hồi lưu tế bào vi khuẩn trong quá trình lên men: dịch chiết ra trong quá trình lên men, ngoài sản phẩm còn có một lượng lớn tế bào vi khuẩn Nếu lượng tế bào này được thu hồi và tái bổ sung vào hệ thống lên men thì sẽ làm tăng sản lượng lên men Có thể dùng phương pháp lọc hoặc ly tâm tách tế bào rồi bổ sung ngược lại vào nồi lên men Tuy nhiên, vấn đề chống tạp nhiễm là một trở ngại lớn khi thực hiện kiểu nuôi cấy này

Kỹ thuật lên men liên tục bắt đầu bằng một mẻ (batch), khi tế bào vi sinh vật bước vào pha log, quá trình lên men được chuyển từ nuôi cấy theo mẻ sang liên tục [12]

Nuôi cấy liên tục làm tăng đáng kể sản lượng mà không cần thêm nhiều bình lên men Điều này không những giảm chi phí sản xuất mà còn giảm chi phí đầu tư Hirao và

cộng sự (1989) đã nuôi cấy liên tục chủng Corynebacterium glutamicum B-6 thu nhận

L-lysine Chủng có thể sản xuất L-lysine ổn định trong 300 giờ với sản lượng 105g/L và năng suất 5,6g/L/giờ Trong đó, với hình thức lên men theo mẻ có bổ sung, sản lượng L-

lysine chỉ đạt 100g/L trong 48 giờ, năng suất không vượt quá 2,1g/L/giờ Nghĩa là năng

suất khi lên men liên tục gấp 2,5 lần lên men theo mẻ có bổ sung [12]

Mặc dù cho năng suất cao hơn hẳn nhưng nuôi cấy liên tục vẫn có những hạn chế sau:

Vấn đề tạp nhiễm là một trở ngại lớn trong suốt quá trình vận hành

Nuôi cấy liên tục diễn ra trong một thời gian dài nên dễ xảy ra hiện tượng đột biến

ngẫu nhiên ở vi sinh vật Các chủng đột biến phát triển nhanh hơn chủng bố mẹ trong cùng điều kiện nuôi cấy nên cạnh tranh dinh dưỡng, dẫn đến giảm năng suất

Một số quá trình lên men thu nhận amino acid (lysine) chia thành 2 pha rõ rệt: pha tăng trưởng và pha sinh tổng hợp Nuôi cấy liên tục có thể đạt năng suất không cao bằng nuôi cấy theo mẻ hoặc theo mẻ có bổ sung do tế bào luôn bị giữ ở pha tăng trưởng [12] Ngoài ra, quá trình lên men diễn ra trong thời gian dài sẽ tiêu tốn nhiều công sức

và nguyên liệu, do đó, năng suất cao nhưng chưa phải hiệu suất đã cao Vì vậy cần cân

nhắc kỹ trước khi lựa chọn phương pháp này

1.1.3.3 Lên men fed-batch

Lên men fed-batch còn gọi lên men theo mẻ có bổ sung, là hình thức trung gian

giữa lên men theo mẻ (batch) và lên men liên tục, trong đó, nguyên liệu được nạp vào

nồi lên men liên tục hoặc gián đoạn, sản phẩm chỉ được lấy ra khi quá trình kết thúc Tuy nhiên, dịch lên men cũng có thể được chiết ra trong quá trình vận hành

Fed-batch ban đầu cũng như lên men batch nhưng sau một thời gian sẽ bổ sung thêm môi trường mới với hàm lượng chất dinh dưỡng được kiểm soát trong suốt quá trình nuôi cấy cho đến khi đạt được lượng sản phẩm tối đa [12] Nguồn dinh dưỡng nạp vào có thể giống môi trường nuôi cấy ban đầu hoặc là nguồn cơ chất Đối với cơ chất,

nồng độ có thể tương đương môi trường ban đầu, hoặc cao hơn hoặc rất đậm đặc Vì

vậy, lên men fed-batch thường cho năng suất cao hơn lên men batch trong cùng thời gian và điều kiện lên men Có thể chia hình thức lên men này thành 2 kiểu: lên men theo

mẻ bổ sung thay đổi thể tích và lên men theo mẻ bổ sung không thay đổi thể tích

a Lên men theo m ẻ có bổ sung thay đổi thể tích

Hình thức lên men này, nguồn dinh dưỡng bổ sung có thể là môi trường lên men ban đầu hoặc cơ chất có nồng độ tương đương môi trường ban đầu, khi bổ sung vào sẽ làm thay đổi thể tích dịch lên men Sinh khối tại bất kỳ thời điểm nào trong quá trình lên men được trình bày theo phương trình:

xt = x0 + Y(si – sr) trong đó, x0 là nồng độ giống nạp vào ban đầu Khi sr = 0 và xt = xmax do x0<< xmax thì:

xmax = Y.si

Nếu tại thời điểm sr= 0, môi trường được bổ sung vào với D < µmax thì toàn bộ cơ

chất mới bổ sung vào được sử dụng ngay Ta có:

F.si = µ.(X/Y) với X = x.V (X là tổng sinh khối)

Có thể thấy, tổng sinh khối tăng dần nhưng nồng độ tế bào hầu như không tăng

Do vậy, µ = D Đây được xem là trạng thái cân bằng Khi thể tích dịch lên men tăng, tỷ

lệ pha loãng giảm thì:

D = F/(V0 + F.t) Theo phương trình Monod, khi sr giảm thì D cũng giảm nên x sẽ tăng Tuy nhiên, trong hệ thống nuôi cấy theo mẻ bổ sung, ở bất kỳ giá trị nào của µ thì si>> Ks nên trong

thực tế, sr thay đổi rất nhỏ Do vậy, ở trạng thái cân bằng ổn định, D < µmax và Ks << si[28]

b Lên men theo m ẻ có bổ sung không thay đổi thể tích

Đối với hình thức lên men theo mẻ có bổ sung thay đổi thể tích, cơ chất được bổ sung với nồng độ cao nên không làm thay đổi đáng kể thể tích dịch lên men Động học

hệ thống này được thể hiện qua phương trình:

dx/dt = G.Y trong đó, G là tốc độ nạp cơ chất

xt = x0 +G.Y.t Ngoài cách phân loại trên thì lên men theo mẻ có bổ sung còn được phân loại theo kiểu nạp cơ chất, đó là lên men theo mẻ bổ sung liên tục và bổ sung gián đoạn Đối

với lên men theo mẻ bổ sung liên tục, chất dinh dưỡng trong bình dự trữ được nạp vào bình lên men với tốc độ không đổi Nhờ hệ thống thông khí và khuấy cơ học, bình lên men được cung cấp đầy đủ oxy, đảm bảo việc phân bố nhanh và đồng đều chất dinh dưỡng trong dòng môi trường đi vào Đối với lên men theo mẻ bổ sung gián đoạn, chất dinh dưỡng mới được bổ sung vào bình lên men theo từng thời điểm đã được khảo sát Hình thức lên men theo mẻ có bổ sung đã giải quyết được một số nhược điểm của lên men theo mẻ:

Trong công nghệ lên men amino acid thường đòi hỏi hàm lượng cơ chất cao để thu được sản lượng cao Hàm lượng đường cao trong dịch nuôi cấy ban đầu sẽ ức chế sự sinh trưởng của tế bào vi khuẩn hoặc làm giảm lượng sản phẩm do sự hình thành các

sản phẩm khác như acetate và lactate Nếu bắt đầu quá trình nuôi cấy với hàm lượng đường thấp và bổ sung theo thời điểm thì pha lag có thể được rút ngắn, từ đó làm tăng

sản lượng

Đối với những chủng đột biến khuyết dưỡng, nồng độ chất dinh dưỡng ban đầu quá cao sẽ làm tế bào sinh trưởng quá mức hoặc gây ra ức chế ngược, làm giảm sản lượng Trong trường hợp này, việc bổ sung chất dinh dưỡng theo mẻ với tỷ lệ nhất định

sẽ giúp thu được sản lượng tối đa Hình thức này đã được sử dụng trong nuôi cấy chủng

Corynebacterium glutamicum mang đột biến khuyết dưỡng thu phenylalanine và tyrosine

L-Nồng độ chất dinh dưỡng ban đầu cao gây ra sự phát triển quá nhanh của vi sinh

vật ở pha log, dẫn đến nhu cầu oxy của chúng vượt quá lượng oxy hiện có trong bình lên men, làm giảm sản lượng Kỹ thuật lên men theo mẻ có bổ sung giúp giữ hàm lượng

cơ chất ở mức dưới ngưỡng ức chế để cấp cho vi sinh vật trong quá trình sinh tổng hợp Lên men theo mẻ có bổ sung giúp giảm được vấn đề về nhiễm và đột biến so với lên men liên tục, đạt năng suất cao hơn so với lên men theo mẻ không bổ sung cơ chất

Có nhiều nghiên cứu sản xuất amino acid được tiến hành bằng hình thức lên men vi sinh

vật theo mẻ có bổ sung Kết quả cho thấy, lượng amino acid thu được bằng hình thức này cao hơn nhiều so với lên men theo mẻ không bổ sung cơ chất [12]

Tuy nhiên, lên men fed-batch dạng liên tục đòi hỏi phải có thiết bị để kiểm soát các yếu tố trong quá trình lên men, đồng thời đòi hỏi kỹ năng vận hành thiết bị lên men, điều khiển quá trình Các yếu tố cần được kiểm soát trong khi vận hành hệ thống là: tạp nhiễm, sự tăng trưởng tế bào, pH, nhiệt độ, hàm lượng oxy hòa tan, kiểm soát bọt, tốc

độ nạp liệu

Có th ể nói, hình thức lên men theo mẻ có bổ sung (fed-batch) đã khắc phục được

m ột số nhược điểm của lên men dạng mẻ và lên men liên tục Bên cạnh đó, qua tổng quan tài li ệu, chúng tôi nhận thấy hình thức này phù hợp với mục đích thu nhận amino acid L-lysine t ừ vi khuẩn Corynebacterium glutamicum Vì vậy, chúng tôi chọn hình

th ức lên men theo mẻ có bổ sung (fed-batch) để nâng cao năng suất thu nhận L-lysine trong đề tài này

1.2 Vi khuẩn Corynebacterium glutamicum

Corynebacterium glutamicum được biết đến đầu tiên với vai trò là chủng chuyên

sản xuất acid glutamic, được phát hiện bởi một nhóm các nhà nghiên cứu người Nhật vào giữa những năm 1950 Đầu tiên, Corynebacterium glutamicum có tên gọi

Micrococcus glutamicus No.534, sau này đổi thành Corynebacterium glutamicum [9]

Nghiên cứu sâu hơn về Corynebacterium glutamicum, các nhà khoa học đã khám phá ra

rằng, ngoài khả năng tiết acid glutamic, Corynebacterium glutamicum còn tiết nhiều

loại amino acid khác vào môi trường nuôi cấy như: lysine, methionine, arginine, threonine…

Ngày nay, Corynebacterium glutamicum là một trong những vi khuẩn quan trọng trong công nghiệp, sản xuất 2 triệu tấn amino acid mỗi năm, trong đó có khoảng 0,6 triệu tấn L-lysine [9] Các nghiên cứu về Corynebacterium glutamicum vẫn đang được

các nhà khoa học trong và ngoài nước thực hiện với mục đích nâng cao năng suất thu

nhận amino acid, chủ yếu dựa trên kỹ thuật di truyền

1.2.1 Đặc điểm hình thái và vị trí phân loại

Dưới kính hiển vi phóng đại 400-1000 lần, tế bào Corynebacterium glutamicum có

dạng hình que ngắn điển hình, không đều Tế bào sắp xếp dạng hình chữ V, một số xếp song song, không di động, không hình thành bào tử [9]

Tế bào bắt màu tím khi nhuộm Gram và cho hiện tượng kéo sợi khi phản ứng với dung dịch KOH 3%, chứng tỏ Corynebacterium glutamicum thuộc nhóm vi khuẩn

Gram (+)

Khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch có dạng tròn đầy, trơn bóng, màu vàng nhạt, kích thước 1-1,5 mm (sau một ngày nuôi cấy)

Hình 1.1(a) Tế bào vi khuẩn Corynebacterium glutamicum sinh trưởng trên môi trường

phức hợp (b) Tế bào quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét [9]

Cấu tạo tế bào vi khuẩn có một lớp peptidoglycan dày, vách tế bào chứa arabino galactan và acid mycolic có 26-36 carbon Hàm lượng G:C là 54,1% [12]

Vị trí trong hệ thống phân loại của Corynebacterium glutamicum [37]:

Giới (kingdom): Bacteria Ngành (phylum): Actinobacteria

Lớp (class): Actinobacteria

Bộ (order): Actinomycetales

Họ (family): Corynebacteriaceae Chi (genus): Corynebacterium

Loài (species): Corynebacterium glutamicum

chủng sinh trưởng và sinh tổng hợp sản phẩm

Corynebacterium glutamicum có giới hạn nhiệt độ rộng, khoảng 28-400C nhưng sinh trưởng tốt nhất ở 300

C [7]

Chủng nghiên cứu có khả năng sinh trưởng ở điều kiện pH 6,5-8 nhưng pH thích

hợp cho sự sinh L-lysine là 7,0 [7]

1.2.3 Đặc điểm sinh hóa

Corynebacterium glutamicum có thể sinh trưởng và sinh L-lysine trên nhiều nguồn carbon khác nhau: glucose, sucrose, fructose, acid acetic, ethanol… Các tác giả Kiefer (2002, 2004) [20, 21], Stefan (2011) [16] đã nuôi cấy Corynebacterium glutamicum trên

3 nguồn cơ chất khác nhau: glucose, sucrose và fructose Các tác giả thấy rằng trên

những nguồn cơ chất này, Corynebacterium glutamicum đều sinh trưởng và sinh

L-lysine, tuy nhiên, khả năng sinh trưởng và sinh L-lysine trên môi trường glucose là

mạnh nhất

Nghiên cứu của J Pelechova (1980) cho thấy, Corynebacterium glutamicum còn

có khả năng sinh trưởng và sinh L-lysine trên nguồn cơ chất là ethanol và acid acetic [26]

Gluconate cũng được Corynebacterium glutamicum sử dụng như nguồn carbon

thứ hai khi nuôi cấy trong môi trường chứa hỗn hợp glucose và gluconate [23]

Ngoài ra, Corynebacterium glutamicum còn có khả năng sử dụng mật rỉ đường và tinh bột bắp thô làm cơ chất để sản sinh L-lysine [31, 35]

Hàm lượng carbon trong môi trường nuôi cấy dao động xung quanh 10% (w/v) là thích hợp nhất Hàm lượng quá thấp hay quá cao đều ức chế sự sinh trưởng và sản sinh L-lysine của vi khuẩn

Về nhu cầu nitơ, Corynebacterium glutamicum có khả năng đồng hóa nguồn nitơ

vô cơ như urê, muối amoni và nguồn nitơ hữu cơ như cao nấm men, pepton Muối

amoni thường được sử dụng cho nuôi cấy Corynebacterium glutamicum thu L-lysine

với hàm lượng 1-4%

Trong quá trình sinh trưởng cũng như sinh L-lysine, Corynebacterium glutamicum

cần cung cấp một số loại khoáng vô cơ như K, Mg, Mn, Fe, Cu, Zn…, các nguồn này được cung cấp từ các loại muối khoáng như KH2PO4, MgSO4, FeSO4, CuSO4, ZnSO4 Nhu cầu của vi khuẩn về những nguyên tố này rất ít, chỉ vài mg/L

Corynebacterium glutamicum là vi khuẩn khuyết dưỡng biotin, cần biotin và cả thiamine cho quá trình sinh trưởng và sinh L-lysine Người ta đã chứng minh được rằng

một lượng nhất định biotin sẽ làm tăng sự sản sinh L-lysine do tăng cường hoạt động

của pyruvate carboxylase, một trong hai enzyme phụ thuộc biotine [27] Peter và Wendisch (2012) đã tăng cường biểu hiện gen BirA (được coi là biotin protein ligase) ở

chủng Corynebacterium glutamicum 13032 đã thu được lượng L-lysine cao gấp hai lần

Tuy nhiên, hàm lượng biotine quá cao sẽ tạo thành alanin, aspartic và acid lactic nhiều, ảnh hưởng đến hiệu suất thu nhận L-lysine

Trong công nghiệp lên men, người ta sử dụng mật rỉ đường hay dịch bắp để làm nguồn cung cấp carbon rẻ tiền, vừa làm nguồn cung cấp nitơ và các vitamin

1.2.4 Đặc điểm di truyền

Trình tự gen của Corynebacterium glutamicum bắt đầu được nghiên cứu vào

khoảng giữa những năm 1980, khi mà một vài gen tham gia vào quá trình sinh tổng hợp amino acid của vi khuẩn này được tạo dòng và phân tích Những hiểu biết về bộ gen của

Corynebacterium glutamicum sẽ là nguồn thông tin giá trị cho khoa học cơ bản cũng như ứng dụng công nghiệp [9]

Hình 1.2 Bản đồ gen Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 [9]

Bằng việc sử dụng kỹ thuật di truyền phân tử và phần mềm tin sinh học, nhóm nghiên cứu thuộc khoa Di truyền học trường Đại học Bielefeld, Đức hợp tác với công ty

Degussa, Đức đã giải mã hoàn chỉnh bộ gen của Corynebacterium glutamicum Bộ gen

là phân tử DNA dạng vòng, đơn, gồm 3.282.708 bp với 3.002 gen mã hóa protein [9, 20] Trong số những gen này có hai gen quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp L-lysine, đó là: gen lysC mã hóa enzyme aspartate kinase (enzyme chìa khóa trong chuỗi

phản ứng sinh tổng hợp L-lysine) và gen lysE mã hóa cho enzyme permease có vai trò

giải phóng lysine nội bào ra ngoài

Hình 1.3 Mô hình ezyme aspartate kinase với hai tiểu phần lysCα và lysCβ được cấu tạo

bởi bốn chuỗi poplypeptide giống hệt nhau [12]

Như vậy, có nhiều chủng có khả năng tham gia tổng hợp L-lysine nhưng Corynebacterium glutamicum là ch ủng được nghiên cứu và sử dụng trong công nghiệp nhi ều hơn cả do dễ nuôi cấy, chịu được nhiệt độ cao trong điều kiện nuôi cấy công nghi ệp, có khả năng sinh trưởng tốt trên những nguồn nguyên liệu tự nhiên rẻ tiền Trong ph ạm vi đề tài, chúng tôi sử dụng chủng Corynebacterium glutamicum -B- 0632

t ừ trung tâm lưu giữ giống Đại học Quốc Gia Hà Nội đã được sàng lọc để sản xuất lysine [29, 30]

L-1.3 Amino acid L-lysine

1.3.1 Đặc điểm

Lysine là một α-amino acid thuộc nhóm aspartate Công thức hóa học của lysine là

C6H14N2O2, khối lượng phân tử 146 g/mol Codon mã hóa cho lysine là AAA và AAG Lysine còn có tên gọi khác là 2,6-diaminohexanoic acid

Tiểu phần β

Tiểu phần α

Hình 1.4 Cấu trúc không gian và cấu tạo phân tử của lysine [36]

Lysine có hai dạng đồng phân quang học là D và L, trong đó cơ thể sinh vật chỉ

Cơ thể người và động vật, đặc biệt là trẻ em và động vật còn non nếu thiếu lysine

sẽ chậm lớn, trí não kém phát triển Do đó, lysine thường được bổ sung vào khẩu phần

ăn của trẻ và của gia súc [4]

Lysine thuộc nhóm amino acid không thay thế, nghĩa là cơ thể người và động vật không tự tổng hợp được mà phải lấy từ thức ăn Nguồn thức ăn chứa nhiều lysine là thịt (thịt cừu, thịt gia cầm), trứng, sữa, pho mát và một vài loại cá Lysine cũng có nhiều

trong ngũ cốc, đậu nành Tuy nhiên, lysine dễ bị phân hủy trong quá trình chế biến

1.3.2.2 Ứng dụng

Hàng năm, lượng L-lysine được sản xuất trên toàn thế giới lên tới 600.000 tấn Vào năm 2000, lượng L-lysine được sử dụng như một chất phụ gia thực phẩm đạt xấp xỉ 550.000 tấn và hứa hẹn tiềm năng tăng trưởng mỗi năm sẽ đạt 7-10% [12]

Có nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước được tiến hành để đánh giá ảnh hưởng

của việc bổ sung L-lysine vào thức ăn chăn nuôi

R.M Gous và T.R Morris (1985) đã tiến hành thí nghiệm trên những con gà trống

thịt ở độ tuổi từ 1-3 tuần để xác định phản ứng của chúng đối với hàm lượng lysine Kết

quả cho thấy lysine trong khẩu phần ăn làm tăng trọng lượng của những con gà này, cụ

thể 65 mg/g protein tăng trọng [14]

Vào năm 1990, tác giả D Hickling và cộng sự đã tìm hiểu ảnh hưởng của lysine lên năng suất thịt ức của các con gà trống thịt (Ross x Arbor Acress) Lysine được bổ sung vào khẩu phần ăn trong giai đoạn 0-3 tuần và 3-6 tuần tuổi Từ kết quả thu được, tác giả kết luận rằng, việc tăng 12% lysine (tương ứng 4g) trong khẩu phần ăn sẽ làm tăng 15-20g thịt ức [18]

B.Leclercq (1998) đã nghiên cứu ảnh hưởng của L-lysine đối với sản lượng thịt gia cầm Tác giả thấy rằng lysine cần cho sự tăng sản lượng thịt ức ở gia cầm [22] Trong nước cũng có một số nghiên cứu về vấn đề này, tiêu biểu phải kể đến hai nghiên cứu của nhóm tác giả Nguyễn Thị Hoa Lý, Lê Đức Ngoan và Lê Khắc Huy (1996) Để nâng cao khả năng sản xuất trứng của giống gà Brown Nick, các tác giả trên

đã nghiên cứu bổ sung L-lysine vào khẩu phần ăn của giống gà này Đối tượng nghiên

cứu là giống gà đẻ Brown Nick 29 tuần tuổi ở Xí nghiệp gà đẻ Thanh Vinh (Quảng Nam-Đà Nẵng) Tỉ lệ bổ sung L-lysine là 0,05%; 0,1% và 0,15% Kết quả thu được như sau:

- Tỉ lệ đẻ và sản lượng trứng tăng 2,6 - 5,9%

- Trọng lượng trứng, hiệu quả sử dụng proterin tăng 7,08 -14,7%

- Giảm tiêu tốn thức ăn cho sản xuất trứng 3,3 - 8,4%

- Giảm chi phí protein cho tạo trứng 7,8 - 13,7%

- Giảm giá thành cho sản xuất 1 kg trứng 5,28 – 7,3% [5]

Nhằm tăng trọng lượng thịt ở gà thịt AE, các tác giả trên cũng đã nghiên cứu bổ sung L-lysine và DL-methionine vào khẩu phần ăn của giống gà này Đối tượng nghiên

cứu là giống gà thịt AE từ 0-9 tuần tuổi nuôi tại Xí nghiệp gà Quân khu V (Quảng

Nam-Đà Nẵng) Kết quả thu được như sau:

- Bổ sung L-lysine và DL-methionine với các mức 0,04 – 0,19% và 0,08 – 0,13% (giai đoạn gà 0-4 tuần tuổi), 0,12 -0,27% và 0,06 -0,12% (giai đoạn 5-9 tuần tuổi) làm tăng trọng lượng gà từ 10,24 – 11,43%, giảm tiêu tốn thức ăn 7,2-10,4%, tăng hiệu quả

sử dụng protein 7,03-10,5%, giảm chi phí thức ăn 4,75-5,31%

- Mức bổ sung lysine 0,19% và Dmethionine 0,13% (0-4 tuần tuổi), 0,27% lysine và 0,12% DL- methionine (5-9 tuần tuổi) đem lại hiệu quả kinh tế cao nhất

L Tỉ lệ lysine và methionine tối ưu cho gà thịt AE là 1,25:0,5 (0-4 tuần tuổi); 1,1:0,44 (5-9 tuần tuổi) [6]

Ngoài ra, L-lysine cũng được sản xuất thương mại dưới dạng viên uống bổ sung cho trẻ em giúp tăng khả năng tiêu hóa, ăn ngon miệng

1.3.3 Thu nh ận L-lysine từ vi khuẩn

Có nhiều chủng vi khuẩn có khả năng sản sinh L-lysine như:

Hình 1.5 Sơ đồ tổng quát chuyển hóa từ glucose thành lysine ở vi khuẩn [4]

Lysine được tạo thành đồng thời với methinonine và threonine, đây là hai chất ức

chế ngược quá trình sinh tổng hợp lysine Sự ức chế này khá nhạy, vì thế lượng lysine được tạo ra rất ít, chỉ vừa đủ cho vi sinh vật sử dụng Những vi sinh vật được con người

sử dụng để sinh tổng hợp thừa L-lysine là những chủng được gây đột biến, thường là đột biến khuyết dưỡng methionine và threonine để không có khả năng tổng hợp hai chất này, từ đó sinh tổng hợp thừa L-lysine

1.3.4 Bản chất quá trình sinh tổng hợp L-lysine ở vi khuẩn Corynebacterium

Lysine

Methionine

Homogerin

Threonine Isoleucine

Hình 1.6 Con đường hình thành L-lysine ở Corynebacterium glutamicum [13]

Cơ chất được vận chuyển từ môi trường ngoài vào trong cytosol nhờ các kênh protein vận chuyển Tại đây, cơ chất được biến đổi thành glucose Trải qua một loạt các

phản ứng, pyruvate được hình thành, sau đó biến đổi thành oxaloacetate Oxaloacetate

biến đổi thành aspartate - tiền chất trong quá trình sinh tổng hợp L-lysine Phản ứng mở đầu cũng là phản ứng quan trọng nhất trong quá trình này là từ aspartate thành aspartyl phosphate dưới sự xúc tác của enzyme aspartate kinase do gen lysC mã hóa [12] Vì lý

do nào đó, phản ứng đầu tiên không diễn ra thì cả quá trình cũng không thể diễn ra Vì

vậy, enzyme aspartate kinase trở thành enzyme then chốt trong con đường sinh tổng hợp L-lysine Aspartyl phosphate tiếp tục được biến đổi thành aspartate semialdehyte Từ đây, con đường tổng hợp được chia thành hai nhánh: một nhánh tổng hợp methionine và threonine, một nhánh tổng hợp lysine Theo nhánh thứ nhất, methionine và threonine được hình thành từ homoserine Nhánh thứ hai tổng hợp lysine xảy ra đồng thời với nhánh thứ nhất Sau khi L-lysine nội bào hình thành sẽ được tiết ra ngoài gọi là L-lysine ngoại bào nhờ enzyme permease do gen lysE mã hóa Như vậy, sản phẩm cuối cùng của quá trình sinh tổng hợp L-lysine không chỉ có L-lysine mà còn có methionine và threonine, đây là hai chất ức chế ngược đối với quá trình này Cụ thể, methionine và threonine sẽ ức chế sự hoạt động của enzyme aspartate kinase bằng cách thay đổi cấu trúc trung tâm hoạt động của enzyme, khiến enzyme không gắn được với cơ chất, phản ứng đầu tiên không diễn ra Kết quả là quá trình sinh tổng hợp dừng lại, không tiếp tục

sản sinh L-lysine Đây là cơ chế vi sinh vật sản xuất vừa đủ lượng amino acid cần cho

hoạt động sống của chúng Khi methionine và threonine được vi sinh vật sử dụng hết, nhân tố ức chế không còn, quá trình sinh tổng hợp lại tiếp tục Tuy nhiên, lượng L-lysine sinh ra từ cơ chế này rất ít

Để tạo ra chủng có khả năng sinh tổng thừa L-lysine, một số nghiên cứu đã gây

đột biến khuyết dưỡng homoserine đối với Corynebacterium glutamicum Từ đó,

methionine và threonine không được tạo thành, con đường sinh tổng hợp chỉ đi theo nhánh hai Một hướng khác là tạo ra chủng đột biến mang gen lysC kháng ức chế ngược hay không nhạy cảm với tín hiệu ức chế ngược Năm 1990, gen lysC hoàn toàn không nhạy cảm với ức chế ngược của chủng DM 58-1 đã được phân lập Nghiên cứu này đồng thời đưa ra mô hình cấu trúc chồng lấp của gen lysC bao gồm 2 tiểu đơn vị

lysCα và lysCβ, trong đó lysCβ chịu trách nhiệm kháng ức chế ngược Việc tạo dòng gen lysC kháng ức chế ngược trong chủng Corynebacterium glutamicum ATCC13032

hoang dại đã thu được lượng L-lysine 38mM, trong khi chủng bố mẹ cho sản lượng không đáng kể [12] Jetten và cộng sự (1995) đã phân tích ảnh hưởng của số lượng bản sao gen lysC đột biến đến khả năng sinh trưởng và sinh L-lysine của chủng

Brevibacterium lactofermentum ATCC 21799 Kết quả cho thấy, chủng mang hai bản sao gen lysC đột biến đã sản xuất một lượng L-lysine lớn hơn nhiều so với chủng bố mẹ [12]

Như vậy, để tăng khả năng sản xuất L-lysine của vi sinh vật, đa số tác giả chọn

gi ải pháp can thiệp vào hệ gen Tuy nhiên, chủng đột biến có nhược điểm là dễ thoái hóa, s ản lượng không ổn định, gen đột biến dễ phát tán Trong nghiên cứu này, chúng tôi ch ọn giải pháp tối ưu hóa môi trường lên men và kỹ thuật lên men fed-batch để nâng cao năng suất thu nhận L-lysine

1.3.5 K ỹ thuật lên men fed-batch thu nhận L-lysine từ Corynebacterium

glutamicum

1.3.5.1 Thi ết kế môi trường lên men

Thiết kế môi trường lên men là bước rất quan trọng quyết định sự thành công trong lên men vi sinh vật Thành phần môi trường phải đảm bảo đủ lượng để phục vụ cho việc tăng sinh khối, tạo các chất trao đổi và cung cấp đủ năng lượng cho việc duy trì

mật độ tế bào cũng như sinh tổng hợp Môi trường lên men được thiết kế tùy thuộc vào yêu cầu của chủng vi sinh vật, phương pháp lên men và sản phẩm mục tiêu

Phương trình cân bằng vật chất trong lên men được thể hiện như sau:

C + N + O2 + các yếu tố khác = sinh khối + sản phẩm + CO2 + H2O + nhiệt Thành phần môi trường bao gồm các yếu tố đa lượng (C, N) và các yếu tố vi lượng (muối khoáng, vitamine, chất kiểm soát…)

Dựa vào thành phần và hàm lượng các chất trong tế bào vi sinh vật để thiết kế thành phần môi trường lên men Trong tế bào vi sinh vật, C chiếm khoảng 50% trọng lượng khô của tế bào Các nguyên tố C, N, H, O chiếm tổng cộng khoảng 92%, còn lại

là các yếu tố vi lượng [2] Những yếu tố có hàm lượng cao là những yếu tố ảnh hưởng

lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật Vì vậy trong môi trường lên men, hàm lượng C, N thường cao hơn rất nhiều so với các nguyên tố vi lượng

1.3.5.2 Ảnh hưởng của các thành phần môi trường lên men

Nước: tế bào vi sinh vật chứa 70% là nước [2], mọi hoạt động sống của vi sinh vật như đồng hóa, dị hóa đều diễn ra trong môi trường nước Do vậy, nước là yếu tố quan

trọng không thể thiếu trong các quá trình lên men Ngoài ra, nước còn cần thiết cho

những hoạt động khác trong quá trình lên men như: gia nhiệt, giải nhiệt…Nước sử dụng trong môi trường lên men phải là nước đã được loại bỏ hoàn toàn các ion khoáng để không làm thay đổi hàm lượng khoáng trong môi trường lên men

Nguồn carbon: carbon có ảnh hưởng đến sự hình thành sinh khối, các sản phẩm sơ

cấp và thứ cấp của vi sinh vật Sản xuất L-lysine bởi Corynebacterium glutamicum ở

quy mô phòng thí nghiệm, nguồn carbon được chọn thường tinh khiết (glucose), nhưng trong sản xuất công nghiệp thường dùng nguồn carbon rẻ tiền có nguồn gốc tự nhiên như: bột ngô, bột ngũ cốc, mật rỉ đường mía hoặc củ cải Những nguồn carbon này chứa nhiều tạp chất nên cần chế biến loại bỏ các thành phần tạp chất có ảnh hưởng không tốt đến vi sinh vật trước khi đưa vào sử dụng Khi khử trùng môi trường lên men cần tách riêng nguồn đường khử và nguồn nitơ hữu cơ vì phân tử đường glucose sẽ dễ dàng phản ứng với gốc –NH2 trong amino acid (phản ứng caramen hóa) tạo ra hợp chất có màu nâu đen, gây ức chế sinh trưởng tế bào

Nguồn nitơ: nitơ có vai trò quan trọng trong giai đoạn hình thành sinh khối, tham gia vào nhiều cấu trúc tế bào Ở quy mô phòng thí nghiệm, nguồn nitơ vô cơ được lấy từ các muối ammonium, muối nitrate, nitrite, nitơ hữu cơ được lấy từ cao nấm men, peptone, dịch chiết bắp…Trong đó, dịch bắp là nguồn cung cấp carbon, nitơ và các

amino acid nên thường được dùng trong công nghiệp Đối với chủng Corynebacterium

glutamicum mang đột biến khuyết dưỡng methionine và threonine, người ta sử dụng

dịch thủy phân đậu nành để bổ sung methionine và threonine thay vì nguyên liệu tinh khiết, đắt tiền

Các nguyên tố vi lượng: các nguyên tố vi lượng được sử dụng với hàm lượng vô cùng ít trong môi trường lên men nhưng lại có vai trò quan trọng đối với vi sinh vật, vì tham gia vào cấu trúc một số enzyme hô hấp (Cu, Fe), hoạt hóa nhiều enzyme (Mn) Zn

tham gia vào cấu trúc của nhiều enzyme như DNA polymerase, RNA polymerase, nối các tiểu đơn vị protein trong việc hình thành cấu trúc đặc biệt cho hoạt động của enzyme Photpho là một trong những nguyên tố khoáng quan trọng vì tham gia vào liên

kết cao năng lượng và vận chuyển glucose qua màng tế bào [4]

pH: ion H+ trong môi trường lên men có thể làm thay đổi trạng thái điện tích của tế bào, làm tăng hoặc giảm khả năng thẩm thấu của tế bào đối với một số ion nhất định và gây ức chế các enzyme có mặt trên màng tế bào pH 7,0 là điều kiện tối ưu nhất để

Corynebacterium glutamicum sản sinh L-lysine [7], vì thế, môi trường nuôi cấy cần được duy trì ở mức pH này Việc bổ sung CaCO3 sẽ giúp pH môi trường ổn định Khi

pH giảm, gốc -CO3 bị phân hủy để hiệu chỉnh pH ổn định Ngoài ra, việc bổ sung CaCO3 vào môi trường lên men còn có vai trò đối với khả năng thẩm thấu của tế bào Lượng oxy: oxy là chất nhận H+

cuối cùng trong chuỗi hô hấp Oxy có thể được cung cấp bằng cách lắc đảo bình lên men, khuấy trộn hoặc dẫn khí vô trùng vào bình lên

men Corynebacterium glutamicum là vi khuẩn hiếu khí, vì vậy, việc cung cấp oxy với

nồng độ thích hợp là yếu tố quan trọng quyết định năng suất L-lysine

1.3.5.3 Nh ững yếu tố cần kiểm soát trong lên men fed-batch

Kiểm soát pH: trong quá trình lên men, pH môi trường có thể giảm do sự có mặt

của các sản phẩm trao đổi chất được sinh ra Vi sinh vật rất nhạy cảm với sự thay đổi

pH môi trường nên cần phải kiểm soát pH trong suốt quá trinh lên men để đảm bảo mọi

hoạt động sinh lý trong tế bào diễn ra bình thường pH tối thích của môi trường là pH

tối thích cho hệ enzyme của chủng nuôi cấy Trong lên men fed-batch sản xuất amino acid, dung dịch ammoniac NH3 thường được chọn để hiệu chỉnh pH vì khi bổ sung vào canh trường không những đưa pH về mức ban đầu mà còn là nguồn cung cấp nitơ cho

vi khuẩn Trong lên men công nghiệp, người ta sử dụng hệ thống kiểm soát pH tự động

Kiểm soát lượng oxy hòa tan: đối với lên men thu nhận amino acid, nếu sự thiếu oxy xảy ra trong pha log sẽ hình thành nên các sản phẩm phụ như acid lactic gây ảnh hưởng đến hiệu suất lên men, đồng thời gây ức chế, ảnh hưởng đến hoạt tính của chủng

Vì vậy cần phải sục khí, khuấy trộn để đảm bảo cung cấp đủ oxy cho hô hấp của chủng nghiên cứu

Kiểm soát tốc độ bổ sung cơ chất: nồng độ cơ chất là yếu tố quan trọng trong lên men fed-batch Vì vậy cần phải kiểm soát nồng độ cơ chất trong nồi lên men không quá cao cũng không quá thấp Có thể bổ sung cơ chất theo kiểu liên tục hoặc gián đoạn

Kiểm soát sự tạo bọt: trong điều kiện lên men có sục khí, lắc đảo hoặc sử dụng

mật rỉ đường thường gây hiện tượng tạo bọt Bọt tách tế bào vi khuẩn ra khỏi dịch lên men làm giảm sinh khối, tế bào không được tiếp xúc với điều kiện dinh dưỡng nên giảm

hoạt tính ảnh hưởng đến năng suất lên men Để kiểm soát bọt, có thể dùng phương pháp hóa học hoặc cơ học Nghiên cứu này sử dụng Tween 20 để kiểm soát sự tạo bọt trong bình lên men

1.4 Nh ững nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến hướng của đề tài

Những nghiên cứu về lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum thu nhận

L-lysine chưa được nghiên cứu nhiều trong nước Vì vậy, chúng tôi chỉ đề cập đến

những nghiên cứu của các tác giả nước ngoài

Tác giả Jianzhong Xu (2014) tiến hành lên men fed-batch chủng Corynebacterium

glutamicum Lys5-8 trong môi trường có nguồn cơ chất là glucose, rỉ đường củ cải và

dịch bắp Sau 36 giờ nuôi cấy, lượng L-lysine thu được đạt 896 ± 33,41mM, tương đương 131 ± 4,8g/L Dung dịch bổ sung trong quá trình lên men fed-batch bao gồm: glucose 800g/L, (NH4)2SO4 400g/L Nồng độ glucose duy trì trong dịch lên men khoảng 20-30g/L Điều chỉnh pH ở mức 7,0 bởi dung dịch NH4OH [34]

Cùng tác giả Jianzhong Xu (2013), quá trình lên men fed-batch được thực hiện trong fermentor 7L chứa 3L môi trường lên men Tốc độ dòng không khí đi vào được cài đặt với tốc độ 2,5L/phút Điều chỉnh pH tự động, sử dụng dung dịch NH4OH 25% để duy trì pH 6.9 Tốc độ hòa tan oxy trên 10%/phút Dịch fed-batch gồm: 800g/L glucose

và 400g/L (NH4)2SO4 vô trùng Tốc độ nạp được điều chỉnh sao cho nồng độ glucose trong dịch lên men ở khoảng 20-30g/L bằng cách kiểm tra mỗi 4 giờ Trong thí nghiệm này, tác giả thu được L-lysine với năng suất 2,6g/L/giờ, tương đương 96,8g/L sau 36

giờ nuôi cấy [33]

Nghiên cứu lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum thu L-lysine của

Judith Becker (2011) sử dụng hệ thống Biostat với bình lên men 5L, thể tích môi trường lên men 1L Tốc độ dòng không khí đi vào được cài đặt với tốc độ 2,5L/phút Điều

chỉnh pH tự động, sử dụng dung dịch NH4OH 25% để duy trì pH 6.9 Tốc độ hòa tan oxy trên 10%/phút Dịch bổ sung bao gồm: 200g rỉ đường và 800g glucose được hòa tan trong 1,8L nước, hấp vô trùng ở 1210C trong 20 phút 200mL (NH4)2SO4 (40%) được

hấp riêng 0,8 mL dịch vitamine và 2mL antifoam được bổ sung sau Dịch vitamine bao

gồm: 300mg/L biotin, 500mg/L thiamin.HCl, 2g/L pantothenic acid và 600mg/L nicotinamide Năng suất L-lysine thu được 4g/L/giờ, tương đương 120g/L sau 30 giờ nuôi cấy [8]

Zhen Chen và cộng sự (2011) tiến hành lên men fed-batch Corynebacterium

glutamicum ATCC 13032 và Corynebacterium glutamicum LC 198 trong fermentor 2L

Tateno và cộng sự (2007) đã khảo sát khả năng hình thành L-lysine của

Corynebacterium glutamicum trên nguồn cơ chất là tinh bột bắp thô Với hình thức lên men liên tục và lên men fed-batch, lượng L-lysine đã tăng gấp 2,5 lần ở nhiệt độ 340

C,

72 giờ lên men so với lên men theo mẻ [32]

Tác giả Ohnishi và cộng sự (2006) đã tiến hành lên men fed-batch sáu chủng

Corynebacterium glutamicum mang đột biến đồng gen lysC Môi trường lên men sử

dụng là LPG1 Glucose được chọn là nguồn cơ chất bổ sung trong quá trình lên men fed-batch Kết quả, lượng L-lysine thu được thấp nhất là 33g/L, cao nhất là 59g/L sau

35 giờ lên men [25]

Tác giả Ohnishi (2002) đã khảo sát khả năng sinh L-lysine của 4 chủng

Corynebacterium glutamicum: HD1, AK1, AHD2 và AHP3 Đây là những chủng đã được gây đột biến để tăng khả năng sinh tổng hợp L-lysine Quá trình lên men được

thực hiện theo hình thức fed-batch trong môi trường LPG có nồng độ glucose 50g/L ở quy mô 5L Kết quả, các chủng đều cho sản lượng L-lysine trên 80g/L chỉ sau 27 giờ nuôi cấy [24]

Có thể thấy rằng, ở nước ngoài, các nghiên cứu về sản xuất L-lysine khá phong phú Ở quy mô phòng thí nghiệm, glucose là nguồn cơ chất được sử dụng nhiều và cho năng suất L-lysine cao Những nghiên cứu trên cho thấy, dịch bổ sung có thể là nguồn carbon, nguồn nitơ hay vitamine hoặc hỗn hợp cả ba nguồn Nồng độ glucose bổ sung khoảng 400-800g/L Tốc độ nạp tuy không nói rõ nhưng đều duy trì nồng độ glucose trong môi trường lên men khoảng 10-20%

Qua t ổng quan tài liệu, chúng tôi rút ra một số các vấn đề chính như sau:

- L-lysine là m ột trong những amino acid quan trọng đối với người và động vật, thu ộc nhóm amino acid không thay thế

- Corynebacterium glutamicum là ch ủng vi khuẩn được sử dụng nhiều trong nghiên c ứu sản xuất L-lysine Những chủng cho năng suất cao thường là những chủng đột biến

- K ỹ thuật lên men fed-batch thể hiện nhiều ưu điểm trong việc nghiên cứu thu

nh ận L-lysine

Tuy nhiên, trước khi lên men fed-batch cần tối ưu hóa môi trường lên men, đồng

th ời xác định thời điểm bổ sung cơ chất, tốc độ bổ sung cũng như nồng độ cơ chất bổ sung để duy trì nồng độ đường tối ưu trong canh trường

Đây là tiền đề cho phần thực nghiệm của chúng tôi

Chương 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên li ệu

2.1.1 Gi ống vi sinh vật

Corynebacterium glutamicum VTCC-B-0632 từ trung tâm lưu giữ giống vi sinh

vật Đại học Quốc gia Hà Nội

2.1.2 Các lo ại hóa chất và thiết bị

• Hóa ch ất sử dụng cho môi trường nuôi cấy

Nguồn gốc Trung Quốc: glucose, sucrose, fructose, maltose, ethanol, (NH4)2SO4,

KH2PO4, urê (NH2)2CO, MgSO4, FeSO4, MnSO4, ZnSO4, CuSO4, tween 20

Nguồn gốc Mỹ: biotine, thiamine dạng ống

Nguồn gốc Việt Nam: rỉ đường, dịch bắp (nguồn bắp Mỹ)

Nhuộm Gram

• Thi ết bị

Ngoài những thiết bị cơ bản (que cấy, đèn cồn…), đề tài còn sử dụng các thiết khác được thống kê ở bảng 2.2

Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng trong đề tài

Tủ cấy vô trùng

Tủ ấm

Tủ sấy

Nồi hấp Máy lắc tròn

Tủ lạnh

Bếp điện Kính hiển vi Cân kỹ thuật

pH kế Máy ly tâm Máy UV-vis Máy đo độ ẩm

Trung Quốc Shellab, Đức Trung Quốc Hirayama, Nhật DO6-DAVS, Đức Toshiba, Nhật Trung Quốc Trung Quốc CP22025 Sartorias, Nhật Eutech pH 510, Singapore Hermle Z 233M-2, Đức Geresys, Mỹ

Đức

2.1.3 Môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy sử dụng trong đề tài bao gồm môi trường giữ giống và môi trường nhân giống nhằm bảo quản và hoạt hóa giống trước khi lên men

Các môi trường nuôi cấy được thể hiện ở bảng 2.3

Bảng 2.3 Các môi trường nuôi cấy sử dụng trong đề tài

Peptone Cao nấm men Glucose NaCl Agar

pH

10g/L 5g/L 5g/L 5g/L 18g/L 7,2

Dịch chiết bắp Glucose Peptone Cao nấm men NaCl

pH

50g/L 20g/L 10g/L 5g/L 5g/L 7,2

Chủng giống trước khi đưa vào lên men được nhân giống cấp 2 cấp Một khuẩn

lạc thuần được đưa vào ống nghiệm chứa 10mL môi trường nhân giống cấp 1 Sau 24

giờ, toàn bộ sinh khối được đưa vào bình chứa 100mL môi trường nhân giống cấp 2 Sau 24 giờ, lượng giống này được đưa vào bình lên men với tỷ lệ 7%, chất lượng giống

là 2,4 tỷ tế bào/mL

SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU TỔNG QUÁT

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát Sau khi nhận giống từ trung tâm lưu trữ giống, chúng tôi tiến hành hoạt hóa giống,

kiểm tra độ thuần, kiểm tra các đặc điểm sinh lý, sinh hóa Với chủng giống đã thuần, chúng tôi thực hiện tối ưu hóa môi trường lên men bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm Thu được các thông số tối ưu của môi trường lên men, tiến hành lên men batch,

phân tích động học quá trình lên men batch, từ đó xác định thời điểm bổ sung cơ chất và

nồng độ cơ chất bổ sung Tiến hành khảo sát ngưỡng ức chế cơ chất đối với khả năng hình thành L-lysine của chủng giống Cuối cùng, thử nghiệm lên men fed-batch thu

nhận L-lysine

Tối ưu hóa môi trường lên men

Thử nghiệm lên men fed-batch thu

nhận L-lysine

Kiểm tra vi thể, đại thể, sinh lý, sinh hóa

Corynebacterium glutamicum

VTCC-B-0632 Kiểm tra khả năng đồng hóa một

số nguồn carbon và nguồn nitơ

Thí nghiệm khởi đầu Thí nghiệm sàng lọc

Thí nghiệm bề mặt đáp ứng-cấu trúc tâm xoay (RSM-CCD)

Xác định thời điểm bổ sung

cơ chất Xác định ngưỡng ức chế cơ chất

Thử nghiệm lên men fed-batch